胡妍，陳玲

福建醫(yī)科大學(xué)免疫治療研究院，福州350122

目前免疫療法廣泛用于癌癥治療，免疫療法能直接作用于腫瘤微環(huán)境，具有低毒、不良反應(yīng)小、對(duì)人體傷害少等優(yōu)勢(shì)，且利于患者預(yù)后[1]。在腫瘤細(xì)胞表面，有大量程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）蛋白表達(dá)，其能與T細(xì)胞表面的程序性死亡因子1（programmed death 1，PD-1）蛋白結(jié)合，使得腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞殺傷[2-3]。使用PD-L1抗體能阻斷PD-1與PDL1結(jié)合，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，治療腫瘤效果明顯[4]，其完整的單克隆抗體是由2條重鏈和2條輕鏈組成，這種結(jié)構(gòu)的抗體最先應(yīng)于腫瘤的治療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用的需求，研發(fā)出了各種結(jié)構(gòu)的抗體，如單鏈抗體、雙價(jià)抗體、串聯(lián)抗體、雙特異性抗體等[5]。單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv）是由抗體重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)在一段肽段連接下構(gòu)成的小分子，是具有抗體活性的最小功能結(jié)構(gòu)。scFv由于分子質(zhì)量小（約25 kDa）、穿透力強(qiáng)，在靶向治療、影像診斷、細(xì)胞內(nèi)免疫和生物檢測(cè)等方面具有重要作用。在靶向治療方面，可將藥物和毒素與scFv鏈接，利用抗原抗體特異性結(jié)合特點(diǎn)，定位于靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷；在影像診斷方面，scFv由于分子質(zhì)量小，具有體內(nèi)清除率高、對(duì)身體傷害小等優(yōu)勢(shì)[6]。雙價(jià)抗體（diabody）是scFv的二聚體，分子量?。?0～60 kD），與scFv一樣，具有體內(nèi)半衰期短、組織滲透力強(qiáng)、體內(nèi)清除率高等優(yōu)點(diǎn)，diabody與抗原結(jié)合比單價(jià)scFv更敏感，且在結(jié)構(gòu)和功能上更接近親本抗體[7]。雙特異性抗體（bispecific antibodies，BsAbs）結(jié)構(gòu)包含2種抗體的可變區(qū)，具有2個(gè)抗原結(jié)合表位和雙重功能[8-9]，BsAbs可將效應(yīng)細(xì)胞直接靶向腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，提高抗體選擇性和功能性，共刺激或抑制受體，避免免疫逃逸機(jī)制進(jìn)而改善治療效果[10]。BsAbs抗體根據(jù)結(jié)構(gòu)中是否帶有Fc片段分為IgG-like BsAb和non-IgG-like BsAb兩類。IgG-like BsAb具有Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，如誘導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）。這類抗體相對(duì)分子量較大，F(xiàn)c片段有助于抗體后期的純化，并提高其溶解性、穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)c部分可與受體FcRn結(jié)合，增加抗體血清半衰期。non-IgG-like BsAb因缺乏Fc片段，僅通過(guò)抗原結(jié)合力發(fā)揮治療作用，具有免疫原性低、易于生產(chǎn)、分子量小、腫瘤組織滲透性高、治療效果好等特點(diǎn)。目前，已存在幾種相對(duì)成熟的雙特異性抗體技術(shù)平臺(tái)，可加快BsAbs的發(fā)展[11?12]。

KD測(cè)定是抗體研發(fā)過(guò)程中的一項(xiàng)重要質(zhì)控指標(biāo)。KD測(cè)定最經(jīng)典的方法為酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），但ELISA方法操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使用生物膜層干涉（biofilm layer interference，BLI）技術(shù)同樣能提供較為可靠的KD[13]，分別使用ELISA和BLI兩種方法測(cè)定第1個(gè)研制出來(lái)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）抗體與新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome corona virus 2，SARS-CoV-2）表面的S蛋白之間的親和力，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致[14]。BLI技術(shù)是基于光干涉信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子快速檢測(cè)的非標(biāo)記分析檢測(cè)技術(shù)[15]，當(dāng)生物分子結(jié)合到光纖材質(zhì)的生物傳感器末端會(huì)形成一層生物膜，當(dāng)傳感器末端的生物分子與待檢測(cè)物結(jié)合時(shí)會(huì)引起傳感器末端分子量的改變，從而導(dǎo)致生物膜厚度的改變。光通過(guò)傳感器的生物膜層后發(fā)生透射和反射形成干涉光波，生物膜厚度的變化導(dǎo)致干涉光波發(fā)生相對(duì)位移。生物分子結(jié)合前后的干涉光波被光譜儀檢測(cè)到，形成干涉光譜，通過(guò)結(jié)合前后光譜位移的變化對(duì)待檢測(cè)分子進(jìn)行分析[16]。BLI技術(shù)能對(duì)親和力進(jìn)行實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記的分析，且這種檢測(cè)技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高[17?18]。

通過(guò)選用SA生物傳感器偶聯(lián)biotin標(biāo)記的PDL1抗原，再分別與4類PDL1抗體結(jié)合，并計(jì)算相應(yīng)的KD。4類抗體在分子設(shè)計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)、緩沖液配比等實(shí)驗(yàn)條件不同時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致KD值不同，因此測(cè)量KD時(shí)，對(duì)SA傳感器需求量較大，而SA傳感器價(jià)格昂貴，本研究通過(guò)選用緩沖液再生傳感器，并對(duì)再生后的傳感器所測(cè)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行考察，以確定傳感器再生條件，并繼續(xù)利用再生后的傳感器測(cè)量抗原抗體之間的KD，旨在為SA傳感器的重復(fù)利用提供再生方法和再生依據(jù)，以提高SA傳感器的使用效率，節(jié)約檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器Octet Red 96分子相互作用分析儀購(gòu)自美國(guó)Pall公司；nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；SG 23手持式pH測(cè)量?jī)x購(gòu)自瑞士梅特勒?托利多公司；Practum 124-1CN電子分析天平購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；SA生物傳感器購(gòu)自Pall公司。

1.1.2 材料與試劑ScFv、diabody（一個(gè)PD-L1結(jié)合位點(diǎn)）、完整單抗、BsAb（PD-L1、TGFbeta 1兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)）；PD-L1蛋白、5個(gè)批次的雙價(jià)單鏈抗體DA200（2個(gè)PD-L1結(jié)合位點(diǎn)）均由本實(shí)驗(yàn)室提供，純度經(jīng)超高效液相色譜儀檢測(cè)，純度均大于98%；生物素（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin）、脫鹽柱購(gòu)于Thermo Scientific公司；96孔板購(gòu)于Greiner Bio-One公司；磷酸鹽緩沖溶液購(gòu)于Corning公司。甘氨酸、吐溫-20、蔗糖購(gòu)于Sigma公司；鹽酸為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-pore超純水。

PBST：取100 μL吐溫-20溶液加至500 mL PBS緩沖液中，混勻，用于預(yù)濕或中和傳感器；再生液（10 mmol·L?1甘氨酸，pH 1.7）：稱取75 mg甘氨酸，加水溶解并定容至100 mL，滴加鹽酸將溶液pH調(diào)至1.7，用于再生傳感器。

1.2 方法

1.2.1 biotin-PD-L1的 制 備EZ-Link Sulfo-NHSLC-LC-Biotin通過(guò)其氨基基團(tuán)，能有效與蛋白結(jié)合。將 現(xiàn) 配 的10 mmol·L?1的biotin溶 液 加 至PD-L1中，兩者按照摩爾比3∶1的比例進(jìn)行結(jié)合，冰上反應(yīng)0.5 h，反應(yīng)結(jié)束后使用脫鹽柱去除游離的biotin，得到biotin化的PD-L1蛋白，使用nanodrop對(duì)biotin-PD-L1進(jìn)行濃度測(cè)定，得到的biotin-PD-L1置于4℃冰箱保存。

1.2.2 PD-L1抗體與PD-L1抗原親和力常數(shù)的測(cè)定選用SA生物傳感器與biotin-PD-L1偶聯(lián)，再利用Octet Red 96分子相互作用分析儀，依次檢測(cè)抗原與4類PD-L1抗體的KD值。每次檢測(cè)時(shí)，取8根SA生物傳感器置于傳感器盤上，于PBST緩沖液中預(yù)濕10 min，將biotin-PD-L1蛋白用PBST溶液稀釋至20 μg·mL?1，將配制的50 nmol·L?1抗體溶液用PBST進(jìn)行倍半稀釋，形成7個(gè)濃度梯度的抗體溶液，最后將biotin-PD-L1蛋白、梯度稀釋的抗體、緩沖液和中和液按照表1的設(shè)置加入樣品板中，樣品或溶液量為200 μL·孔?1，檢測(cè)溫度為30℃，樣品盤轉(zhuǎn)速400 r·min?1，固定好樣品板和傳感器盤后，按照表2設(shè)置的程序運(yùn)行。抗體類別不同時(shí)選用新的傳感器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 樣品盤加樣設(shè)置Table 1 Setting of adding samples to sample tray

表2 儀器運(yùn)行程序設(shè)置Table 2 Settting of instrument operation program

1.2.3 再生后的傳感器測(cè)定KD值的實(shí)驗(yàn)步驟考察將使用后的傳感器按照設(shè)定程序進(jìn)行再生，即在再生液中浸泡5 s，轉(zhuǎn)至中和液中浸泡5 s，再生、中和兩個(gè)步驟循環(huán)重復(fù)3次。再生后的傳感器按照1.2.2的方法對(duì)樣品進(jìn)行親和力測(cè)定，測(cè)定結(jié)束后按照再生程序再生一次傳感器，只進(jìn)行平衡、結(jié)合、解離步驟，對(duì)樣品進(jìn)行親和力測(cè)定，以考察再生后的傳感器測(cè)定KD值是否需要重新上樣。

1.2.4 再生后的傳感器重復(fù)性考察將再生后的傳感器按照考察確定后的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)原樣品進(jìn)行親和力測(cè)定，重復(fù)測(cè)3次，計(jì)算重復(fù)3次試驗(yàn)KD值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），然后將再生傳感器依次對(duì)4類抗體進(jìn)行測(cè)定，比較同一傳感器測(cè)不同抗體KD值的RSD。取1列傳感器按照1.2.2的方法，對(duì)5個(gè)批次的DA200抗體上清液進(jìn)行親和力測(cè)試，計(jì)算5次結(jié)果 決 定 系 數(shù)（coefficient of determination，R2）的RSD值。

1.2.5 再生后的傳感器穩(wěn)定性考察將再生的傳感器浸泡于20%蔗糖溶液中，5 min后將傳感器37℃烘干過(guò)夜，再干燥密封保存。1個(gè)月后，按照考察后的實(shí)驗(yàn)方法，再生后傳感器測(cè)定抗原抗體的KD值，并與1個(gè)月前重復(fù)3次所測(cè)KD值進(jìn)行比較，計(jì)算RSD值，考察傳感器穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PD-L1抗原與4類PD-L1抗體親和力

Octet Red 96分子相互作用分析儀能實(shí)時(shí)檢測(cè)PD-L1抗原與PD-L1抗體之間的相互作用。如圖1所示，Octet Red 96檢測(cè)PD-L1抗原與scFv抗體親和力的各個(gè)步驟，圖1中的上樣、清洗步驟表明，biotin-PD-L1能與SA傳感器快速結(jié)合，在清洗液中并未出現(xiàn)結(jié)合信號(hào)降低的現(xiàn)象，說(shuō)明biotin-PD-L1能牢固地結(jié)合于SA傳感器上。從結(jié)合、解離步驟可觀察到抗原抗體結(jié)合、解離的動(dòng)態(tài)全過(guò)程，當(dāng)偶聯(lián)了抗原的傳感器與抗體結(jié)合時(shí)，抗體濃度越高，結(jié)合高度也越高，另外3列傳感器檢測(cè)其他三類抗體的全過(guò)程與圖1類似。通過(guò)濃度梯度的抗體結(jié)合、解離曲線即可計(jì)算出KD值，由表3可知，完整單抗、BS4Ab與抗原的KD值在相同范圍，KD值達(dá)到10?10mol·L?1，scFv、diabody這兩種抗體的KD值接近，KD值為10?9mol·L?1，完整單抗和雙特異性抗體與抗原結(jié)合能力大于其他兩類。

圖1 傳感器檢測(cè)PD-L1抗原與scFv抗體親和力的各個(gè)步驟Fig.1 Each step of detecting the affinity of PD-L1 antigen and scFv antibody by sensor

表3 PD-L1抗原與4類PD-L1抗體親和力Table 3 PD-L1 affinity and four classes of PD-L1 antibodies

2.2 再生后的傳感器再次測(cè)KD值

SA傳感器與biotin-PD-L1快速、穩(wěn)定結(jié)合，本研究通過(guò)是否需要再次上樣步驟，以考察再生液對(duì)SA-biotin之間非共價(jià)結(jié)合的影響（圖2A）。初次結(jié)合scFv傳感器再生后重新上樣測(cè)分子間相互作用時(shí)的結(jié)合、解離過(guò)程。重新上樣后，不同濃度的抗體均能與PD-L1抗原結(jié)合，根據(jù)結(jié)合、解離曲線能計(jì)算出KD值；初始結(jié)合scFv傳感器再生后不經(jīng)過(guò)上樣步驟測(cè)分子間相互作用時(shí)的結(jié)合、解離過(guò)程，SA傳感器上的結(jié)合高度為0~0.03 nm，說(shuō)明不同濃度的抗體不能與PD-L1抗原結(jié)合，且曲線擬合的R2為0，其他3類抗體樣品所測(cè)結(jié)果一致（圖2B），說(shuō)明再生液破壞了SA-biotin之間的非共價(jià)結(jié)合，再生后的傳感器重新測(cè)KD需再次與biotin標(biāo)記的蛋白結(jié)合。

圖2 再生后的傳感器再次測(cè)KD值Fig.2 The regenerated sensor measured the KD value again

2.3 再生后的傳感器測(cè)KD重復(fù)性試驗(yàn)

初次結(jié)合scFv抗體的傳感器再生后重復(fù)測(cè)3次與scFv親和力的RSD值為8.18%，其他3種傳感器與3類抗體親和力的RSD值分別為8.23%、2.64%、8.43%，RSD均值為6.87%，由表4可知，同一傳感器再生后測(cè)其他種類抗體所測(cè)得KD的RSD值在7.28%~32.89%，偏差較大。由表5可知，同一傳感器再生后測(cè)5個(gè)批次的DA200抗體上清液所測(cè)得KD的RSD為0.82%，偏差較小，重復(fù)性好。以上結(jié)果表明，再生后的傳感器再次測(cè)自身樣品KD值穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，但測(cè)其他樣品親和力時(shí)，所得結(jié)果的RSD值較大，重現(xiàn)性不高，因此，再生后的傳感器只適用于對(duì)原類型的樣品進(jìn)行親和力測(cè)定。

表4 初次使用的傳感器再生后與4類抗體樣品KD測(cè)定結(jié)果Table 4 KD determination results of the first used sensor and class 4 antibody samples after regeneration

表5 再生的傳感器與5個(gè)批次的DA200樣品測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of regenerated sensor and 5 batches of DA200 samples

2.4 再生后的傳感器測(cè)KD穩(wěn)定性試驗(yàn)

通過(guò)傳感器在保存1個(gè)月后所得KD值與之前進(jìn)行比較，以考察再生后傳感器的穩(wěn)定性。再生后的4列SA傳感器放置1個(gè)月后與scFv、diabody、完整單抗、BS4Ab的親和力分別為5.10×10?9、5.56×10?9、2.79×10?10、4.17×10?10mol·L?1，與1個(gè)月前比較RSD分別為6.54%、8.34%、2.78%、6.88%，RSD均值為6.13%，說(shuō)明再生后的傳感器穩(wěn)定性較好。

3 討論

親和力常數(shù)測(cè)定是抗體研發(fā)過(guò)程中的一項(xiàng)重要質(zhì)控指標(biāo)，基于BLI技術(shù)研發(fā)出的分子間相互作用平臺(tái)自動(dòng)化程度高、測(cè)定速度快、靈敏度高，能提供與ELISA一致的數(shù)據(jù)，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需標(biāo)記，且能實(shí)時(shí)顯示抗原抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，還可提供結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和親和力常數(shù)，通過(guò)曲線擬合即可計(jì)算出抗體的親和力。本研究利用BLI技術(shù)檢測(cè)PD-L1抗原與4類抗體之間的親和力，結(jié)果表明，scFv和diabody這兩類抗體因只有1個(gè)PD-L1抗原結(jié)合位點(diǎn)、分子量相差較小，因此，2類抗體與抗原的KD值接近，均為10?9mol·L?1，完整單抗因分子量大，解離速度慢，所以親和力大于scFv和diabody這2類抗體，BS4Ab因含有2個(gè)PD-L1抗原結(jié)合位點(diǎn)、分子量大等原因，親和力與完整單抗的結(jié)果相似，PD-L1抗原與4類PD-L1抗體的KD值與其他文獻(xiàn)[19?23]報(bào)道的結(jié)果一致。說(shuō)明PD-L1抗原與PD-L1抗體的親和力主要與抗體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、分子量有關(guān)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)越多，結(jié)合速率常數(shù)越大，親和力也越大；分子量越小，解離速率常數(shù)越大，親和力值則越小。SA傳感器用甘氨酸再生后，需再次結(jié)合biotin-PD-L1，才能檢測(cè)與抗體的親和力，不結(jié)合biotin-PD-L1的傳感器則檢測(cè)不出KD值；進(jìn)行親和力測(cè)定時(shí)，再生后的傳感器只能用于原樣品的親和力檢測(cè)，檢測(cè)其他樣品準(zhǔn)確度降低；再生后的傳感器重復(fù)測(cè)3次原樣品，4類抗體KD值的RSD均值為6.87%，重復(fù)性較好；再生傳感器測(cè)5個(gè)批次的抗體，所得擬合曲線R2的RSD均值為0.82%，批間結(jié)果準(zhǔn)確可靠；再生后的傳感器干燥密閉保存后再次進(jìn)行親和力檢測(cè)，與之前數(shù)據(jù)比較，4類抗體KD的RSD均值為6.13%，數(shù)據(jù)仍較穩(wěn)定、重現(xiàn)性高。

綜上所述，當(dāng)抗原抗體親和力≤10?10mol·L?1數(shù)量級(jí)時(shí)，可以使用甘氨酸再生SA傳感器，再生后的傳感器能繼續(xù)用于原樣品的KD測(cè)定，數(shù)據(jù)重現(xiàn)可靠，且能明顯節(jié)約檢測(cè)成本，本研究結(jié)果可為今后SA傳感器或其他傳感器的重復(fù)使用提供試驗(yàn)思路和參考依據(jù)。