膽鹽水解酶降膽固醇的研究進(jìn)展

馮鑫，丁源，郭怡冰，梁宏澤，劉剛強(qiáng)，艾連中，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093）

隨著日益增長的人民生活水平與人口老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病發(fā)病率也呈上升趨勢，成為目前導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，嚴(yán)重危害到國家與人民的生命財(cái)產(chǎn)。目前為止，美國和加拿大由于心血管疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失已分別達(dá)4031億美元和222億美元。據(jù)世衛(wèi)組織預(yù)測，到2030年，由 心血管疾病造成的死亡人數(shù)將高達(dá)2300萬，是造成人類死亡的主要原因[1]。引起該類疾病的主要誘因是體內(nèi)的高膽固醇含量，而且過量膽固醇也會(huì)引起非酒精性脂肪肝等疾病[2]。當(dāng)血脂中的總膽固醇減少時(shí)，患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之減少[3]。因此，如何有效控制膽固醇攝入，降低人體中膽固醇水平是人們關(guān)注的重點(diǎn)，也是研究的熱點(diǎn)之一。目前常用的降膽固醇藥物為依齊麥布及他汀類藥物，但此類藥物價(jià)格高昂，還會(huì)產(chǎn)生一定的副作用[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，益生菌及其產(chǎn)品可降低體內(nèi)的血清膽固醇水平，降低患病幾率[5]。益生菌被定義為活的微生物，當(dāng)攝入適量的益生菌時(shí)，對宿主的腸道菌群可產(chǎn)生積極影響，能夠刺激或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減少炎癥或過敏反應(yīng)，因此，將益生菌作為生物治療藥物也成為研究熱點(diǎn)。然而目前益生菌降膽固醇的機(jī)理還未完全解析清晰，但大量研究表明，益生菌降膽固醇與其在生長過程中產(chǎn)生的膽鹽水解酶（Bile salt hydrolase，BSH）密切相關(guān)[6]。本文通過介紹膽固醇、膽鹽水解酶的特性與功能，并總結(jié)BSH降膽固醇機(jī)制，以期為益生菌的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 膽固醇

膽汁是一種黃綠色溶液，其主要成分包括膽汁酸、膽固醇、磷脂和膽色素等，其中，膽汁酸含量最多，可用作脂質(zhì)的生物洗滌劑，在脂肪消化中起重要作用[7]。膽汁酸主要由在肝臟中從頭合成的初級膽汁酸和在腸道中由初級膽汁酸生成的次級膽汁酸構(gòu)成，在正常條件下通過沿腸道的被動(dòng)擴(kuò)散和在回腸末端的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而被吸收[8]。膽汁酸是信號(hào)傳導(dǎo)分子，可結(jié)合其他蛋白激活宿主體內(nèi)代謝及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主代謝。在堿性膽汁中，膽汁酸常以鉀鹽或鈉鹽的形式存在，因此又簡稱膽鹽，負(fù)責(zé)宿主脂肪的消化和吸收。

圖1 體內(nèi)膽固醇合成代謝過程Fig.1 Process of cholesterol metabolismin vivo

膽固醇廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，對于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和維護(hù)是至關(guān)重要的，是組織細(xì)胞不可或缺的重要物質(zhì)，也是合成膽酸和性激素等類固醇激素的重要原料，可促進(jìn)脂肪的消化[9]。人體膽固醇的來源主要分為外源性和內(nèi)源性。外源性來源主要指通過對外源食物例如動(dòng)物器官和禽類動(dòng)物的攝入；內(nèi)源性來源主要指通過人體器官合成的膽固醇。因此，不同的器官所含膽固醇含量也有所不同[10]。肝臟是膽固醇代謝的主要調(diào)節(jié)部位，在肝臟中，以乙酰輔酶A為原料，以羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）為關(guān)鍵限速酶，對膽固醇進(jìn)行合成與分解代謝，并向膽汁分泌大量甾醇[11,12]。正常人體血液中膽固醇含量為2.82～5.95 mmol/L[13]。膽固醇水平失衡會(huì)導(dǎo)致多種疾病，威脅宿主健康。膽固醇水平低于正常值時(shí)，導(dǎo)致血管壁變脆弱，易引起腦出血，不僅如此，也會(huì)使得機(jī)體對異物的清除能力顯著下降，增加致癌率。膽固醇水平過高時(shí)，容易引起肥胖，形成動(dòng)脈硬化斑塊，是心血管疾病的高危因素[14]?？偰懝檀妓矫吭黾? mmol/L，冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)便升高35%，相比之下，總血清膽固醇水平下降1%，心血管疾病的發(fā)病率便可下降2%～3%[15]。因此，體內(nèi)膽固醇水平是心血管疾病發(fā)病率的主要決定因素，有效控制體內(nèi)膽固醇水平對于維持機(jī)體健康是至關(guān)重要的。如今常采用他汀類藥物控制膽固醇水平，但藥物價(jià)格昂貴且易帶來副作用[4]，由于益生菌產(chǎn)品具有綠色安全，價(jià)格優(yōu)惠等特點(diǎn)，已被廣泛用于控制人體膽固醇水平。大量研究表明，使得益生菌起到降膽固醇作用的主要物質(zhì)是其菌體內(nèi)的膽鹽水解酶[16]。

2 膽鹽水解酶

膽鹽是由肝臟中的膽固醇在合成限速酶CYP7A1催化下合成的，也是體內(nèi)排泄膽固醇的主要途徑[17]。膽鹽可促進(jìn)腸道對膳食脂肪和脂溶性維生素的消化和吸收[1]。膽鹽水解酶（BSH）是腸道微生物在生長過程中產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，可催化水解結(jié)合膽鹽，屬于Ntn-CGH蛋白家族，其氨基酸序列與青霉素V?；父叨缺Ｊ豙18]。BSH可通過水解酰胺鍵產(chǎn)生游離氨基酸和游離態(tài)膽汁酸來催化水解結(jié)合膽汁酸，此反應(yīng)在小腸膽汁酸代謝中至關(guān)重要，也是BSH影響機(jī)體生理的重要原因[19]。

BSH主要分布于革蘭氏陽性的腸道細(xì)菌中，例如乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬等[20]，不同來源的BSH酶活性存在著差異，在pH環(huán)境為3.5～6，37～45 ℃時(shí)活性最佳。然而BSH活性不僅與pH、溫度等環(huán)境條件相關(guān)，也與活性位點(diǎn)相關(guān)[21]。據(jù)報(bào)道，其主要活性位點(diǎn)包括Cys2、Arg18、Asp21、Asn175以及Arg228。其中Cys2具有高度保守性，也是目前已被證實(shí)的經(jīng)過定點(diǎn)誘變的殘基，對BSH活性至關(guān)重要[8]。BSH可特異性識(shí)別底物的氨基酸基團(tuán)并進(jìn)行水解，目前已鑒定的BSH底物譜較窄，主要包括甘氨結(jié)合膽鹽和?；墙Y(jié)合膽鹽，且大多BSH在水解甘氨結(jié)合膽鹽時(shí)表現(xiàn)出更高的活性[22-24]，這可能與?；墙Y(jié)合膽鹽中硫原子引起的位阻有關(guān)[25]。然而，在不同pH下，BSH對不同的底物的偏好性和水解能力也有一定差異，這可能是由于pH介導(dǎo)的BSH結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致的。

編碼BSH的基因包括四種，分別是bsh1、bsh2、bsh3、bsh4，但并不是所有含BSH的微生物中都具有這四種基因且能夠表達(dá)。Kumar等[26]鑒定發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵乳桿菌NCDO394中的一個(gè)bsh基因，F(xiàn)ang等[27]在唾液乳桿菌中發(fā)現(xiàn)了bsh1和bsh2基因。也有研究鑒定發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌WCFS1中的4個(gè)bsh基因且均可表達(dá)[28]，因此這些基因在微生物中是高度可變的。

3 膽鹽水解酶的功能

3.1 營養(yǎng)成分

BSH水解膽鹽的過程中會(huì)釋放出甘氨酸和?；撬岬劝被幔拾彼峥赡鼙淮x為氨和二氧化碳，牛磺酸可被代謝為氨、二氧化碳和硫酸鹽，這些代謝物質(zhì)作為微生物生長過程中的碳源、氮源等能量來源被利用，因此，有BSH活性的菌株較BSH陰性菌株而言，在生長過程中具有營養(yǎng)優(yōu)勢。Huijghebaert等[29]發(fā)現(xiàn)在生長培養(yǎng)基中只有添加含硫氨基酸（0.1%的?；撬幔r(shí)，才可誘導(dǎo)菌株活菌數(shù)顯著增加，由不可生長或最高活菌數(shù)為104cfu/mL，增加至106～107cfu/mL，不僅如此，牛磺酸的添加也使得菌株在瓊脂平板上的菌落直徑增加約5倍。因此認(rèn)為，BSH陽性的梭屬菌株可利用?；撬釣殡娮邮荏w，從而加快菌株單位時(shí)間的生長速度。

3.2 改變細(xì)胞膜透性

細(xì)胞膜在保護(hù)細(xì)胞免受外界侵害方面起重要作用，其防御功能主要與其流動(dòng)性、電荷及疏水性等密切相關(guān)[30]。據(jù)報(bào)道，BSH可促進(jìn)膽固醇或膽汁進(jìn)入細(xì)胞膜，并通過改變bsh介導(dǎo)的脂質(zhì)分子間氫鍵而改變細(xì)胞膜流動(dòng)性，增加細(xì)胞膜的電化學(xué)特性和膜強(qiáng)度，從而保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)微生物在宿主的胃腸道上定殖生存，改善免疫系統(tǒng)，從而增加宿主的免疫能力[30]。

3.3 水解結(jié)合態(tài)膽鹽

當(dāng)細(xì)胞中膽鹽濃度過高時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，對人體產(chǎn)生不利影響，因此需有效控制體內(nèi)膽鹽的水平。膽鹽包括結(jié)合態(tài)膽鹽和游離態(tài)膽鹽，結(jié)合態(tài)膽鹽易溶解，可經(jīng)腸道循環(huán)隨糞便排出體外。BSH可通過特異性水解?；撬峤Y(jié)合態(tài)膽鹽和甘氨酸結(jié)合態(tài)膽鹽，降低膽鹽濃度，解除細(xì)胞膽鹽毒性，防止細(xì)胞膜破裂，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[31]。Kaya等[23]將鼠李糖乳桿菌中的bsh基因克隆至大腸桿菌并表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，相較于?；撬崮扄}，重組BSH顯示其對甘氨酸膽鹽的偏好，這可能與催化活性位點(diǎn)有關(guān)。但也有研究表明，即便有相同的催化位點(diǎn)，不同菌屬的BSH對底物的水解能力也有所不同[32]。因此，BSH通過特異性水解結(jié)合膽鹽，調(diào)節(jié)腸道代謝，解除膽鹽毒性，改善宿主健康，而其水解膽鹽的能力與催化活性位點(diǎn)相關(guān)，也可能受到菌株的影響。

3.4 提高腸道中益生菌存活率

對微生物而言，人體腸道環(huán)境惡劣，不利于生長及定殖。但由于BSH水解結(jié)合膽鹽后增加了菌株對腸道細(xì)胞的黏附作用，因此BSH陽性菌株含有更高的膽汁耐受性，并且在腸道環(huán)境中有更高的存活率。Yang等[33]將植物乳桿菌灌胃小鼠后發(fā)現(xiàn)，BSH陽性的菌株較對照菌株在胃腸道中的存活時(shí)間延長3 d，且對腸細(xì)胞的黏附能力也顯著增強(qiáng)。因此，BSH活性也成為益生菌篩選的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。但也有研究表明，以三株不同BSH活性的乳酸菌灌胃小鼠，兩周后發(fā)現(xiàn)菌株在小鼠腸胃環(huán)境中的生長能力并無顯著性差異。這可能與不同菌株中BSH的結(jié)構(gòu)差別有關(guān)，因此，BSH對微生物存活率的影響仍需要深入研究[34]。

3.5 降膽固醇

肝細(xì)胞中膽固醇的過度積累易引起冠心病，動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病。大量研究證明，除了可以通過服用相應(yīng)的藥物外，口服益生菌也可降低體內(nèi)膽固醇。然而分子層面的益生菌降膽固醇機(jī)制還未完全解析清晰，但對該現(xiàn)象已提出很多假說。例如，膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇[20]、短鏈脂肪酸的產(chǎn)生[35]以及細(xì)胞壁與膽固醇間的相互作用[36]，而具有活性的BSH被認(rèn)為是降低體內(nèi)膽固醇的關(guān)鍵因素[37,38]。也已有大量研究證明具有BSH活性的益生菌可顯著減少腸內(nèi)細(xì)胞對膽固醇的吸收，降低體內(nèi)膽固醇水平[39-41]，同時(shí)可降低體重，改善肥胖現(xiàn)象[42]。

4 膽鹽水解酶降膽固醇機(jī)制

4.1 降低膽固醇穩(wěn)定膠束的形成

膠束的形成需要膽鹽、磷脂和膽固醇分子，中斷的膠束將不能將脂肪酸運(yùn)輸至腸黏膜表面，導(dǎo)致膽固醇水平降低。具有BSH活性的益生菌進(jìn)入腸道中，會(huì)增加腸腔內(nèi)膽汁酸的水解，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)游離態(tài)膽鹽水平的增加。而與結(jié)合態(tài)膽鹽相比，游離態(tài)膽鹽的乳化能力較弱，膽固醇形成穩(wěn)定的膠束的效率也隨之降低，從而降低了機(jī)體對膽固醇和甘油三酯的吸收，因此，BSH陽性菌株可利用膽汁酸水解的游離態(tài)膽鹽消弱穩(wěn)定膠束的形成，降低體內(nèi)膽固醇水平[43]。但目前關(guān)于膽鹽水解酶對膽固醇膠束影響的報(bào)道較少，需要進(jìn)一步通過動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2 催化形成游離膽汁酸

由于膽固醇在水中的不溶性，因此對其有效吸收的必要條件是膽固醇的溶解，而不被吸收的膽固醇將會(huì)進(jìn)入腸肝循環(huán)并被排出體外。由于結(jié)合膽汁酸比游離膽汁酸更易溶解且更易被腸腔吸收，因此，游離膽汁酸在腸道微生物BSH的催化下被釋放，因其不易被吸收而通過腸道循環(huán)被糞便清除，便增加了膽固醇對膽汁酸從頭合成的需求，降低了體內(nèi)膽固醇水平[32]。Tsai等[16]利用高BSH活性的益生菌培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腸腔內(nèi)的膽固醇被分解為不易被吸收的游離膽汁酸，隨后隨糞便共同排出，降低了血清膽固醇水平。除此之外，菌株對膽鹽的水解能力隨菌株和BSH活性的變化而變化。?ner等[44]評估了幾株具有高BSH活性的乳酸菌的水解?；撬崮扄}能力與膽酸釋放量，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和乳酸菌表現(xiàn)出了最高的水解膽鹽能力，且膽汁酸釋放量更顯著。

4.3 調(diào)控受體蛋白和酶的表達(dá)

4.3.1 提高CYP7A1及LXR的表達(dá)

促進(jìn)膽固醇分解為膽汁酸是降低體內(nèi)膽固醇水平的一個(gè)重要途徑，該途徑每日可清除體內(nèi)一半的總膽固醇，而這一復(fù)雜的過程受到了多種蛋白的表達(dá)調(diào)控。研究表明，核受體家族的成員具有控制體內(nèi)脂代謝的平衡的功能，尤其是法尼醇X受體（Franesoid X receptor，F(xiàn)XR）和肝臟X受體（Liver X receptor，LXR），二者可調(diào)節(jié)肝臟中的膽固醇合成膽汁酸，從而清除體內(nèi)多余膽固醇，是體內(nèi)膽汁酸合成和膽固醇清除的關(guān)鍵調(diào)控因子[45]。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）是促進(jìn)膽固醇外排的脂蛋白受體，ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子G1（ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1）也具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的功能[46,47]。膽固醇7α-烴化酶（CYP7A1）是促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的合成限速酶，每天可協(xié)助人體排出400～600 mg的膽固醇[6]。

通過對大鼠灌胃具有BSH活性的植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)CYP7A1基因和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且膽固醇水平顯著降低，糞便中膽汁酸排泄也顯著增加[48]。Thang等[49]發(fā)現(xiàn)具有BSH活性的鼠李糖乳桿菌BFE5246和植物乳桿菌NR47可以顯著促進(jìn)ABCA1和ABCG1基因和蛋白的表達(dá)從而激活LXR，誘導(dǎo)膽固醇外排，降低體內(nèi)膽固醇水平。由于游離膽汁酸與FXR間的高結(jié)合力，導(dǎo)致CYP7A1的轉(zhuǎn)錄受到抑制，同時(shí)由膽汁酸激活的FXR還可進(jìn)一步誘導(dǎo)腸道膽汁酸結(jié)合蛋白（Intestinal bile acid binding protein，IBABP）基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)由腸道返回至肝臟的膽汁酸的循環(huán)，降低了膽固醇重新合成膽汁酸的需求[50]。

4.3.2 抑制NPC1L1的表達(dá)

小異二聚體伴侶（Small heterodimer partner，SHP）與上述提到的調(diào)控蛋白不同的是該受體沒有DNA結(jié)合域，但可作為固醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子，通過固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控膽固醇含量[49]，抑制肝臟膽固醇的生物合成或抑制其轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而參與肝臟的脂質(zhì)代謝[51]。NPC1L1是降膽固醇藥物依齊麥布（EZE）的作用靶點(diǎn)，可以在腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的管狀膜大量表達(dá)，是哺乳動(dòng)物腸道吸收膽固醇的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體，也是膳食膽固醇吸收的重要載體[52]。

Wang等[37]等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BSH陽性菌株植物乳桿菌AR113和干酪乳桿菌pWQH01可顯著降低小鼠肝臟TC和LDL-C水平，改善了肝臟脂肪變性。進(jìn)一步通過對代謝通路的分析發(fā)現(xiàn)，AR113和pWQH01下調(diào)表達(dá)了FXR和SHP，同時(shí)上調(diào)表達(dá)了CYP7A1、LXR和低密度脂蛋白受體（LDLR）。Kim等[51]檢測了敲除SHP基因小鼠的基因表達(dá)與膽固醇吸收水平，發(fā)現(xiàn)SHP敲除小鼠的腸道內(nèi)NPC1L1基因上調(diào)，膽固醇吸收增加。因此得出結(jié)論，SHP可抑制SREBP2，從而抑制NPC1L1的表達(dá)和膽固醇的吸收，因此，BSH可參與調(diào)控NPC1L1的表達(dá)，達(dá)到控制體內(nèi)膽固醇的目的。所以，激活SHP可被開發(fā)用于高膽固醇的治療。

5 BSH的爭議性

BSH雖可以增加菌株的營養(yǎng)優(yōu)勢并最大化益生菌在腸道中的存活率，也可降低結(jié)合膽鹽的毒性與機(jī)體膽固醇水平，但同時(shí)也可能會(huì)擾亂正常的腸道環(huán)境，造成腸道疾病，帶來不利影響。游離膽汁酸的乳化脂肪和形成穩(wěn)態(tài)膠束的效率與結(jié)合膽汁酸相比較低，因此，BSH可能擾亂油脂消化，導(dǎo)致對脂肪酸和甘油單酯的吸收率降低。另外，游離膽鹽可產(chǎn)生對DNA有損害的次級膽汁酸而引發(fā)結(jié)腸黏膜功能受損，導(dǎo)致腹瀉或炎癥，甚至結(jié)腸癌[53]。由BSH引起的膽汁酸濃度的改變使得膽固醇與卵磷脂相對濃度發(fā)生改變，當(dāng)呈現(xiàn)過飽和狀態(tài)時(shí)，多余的膽固醇與鈣鹽可形成沉淀，導(dǎo)致結(jié)石的產(chǎn)生[54]。因此，如何最大化BSH有利影響的同時(shí)，盡量避免其帶來的負(fù)面影響也將是日后需要進(jìn)一步研究的方向。

6 結(jié)論

6.1 目前心血管疾病的高病發(fā)率，促使研究人員盡快尋找綠色安全有效的防治方法。常用的他丁類藥物具有副作用，且價(jià)格昂貴。而大量研究已證明許多益生菌可有效降低人體膽固醇，并據(jù)大量研究報(bào)道，BSH可協(xié)助益生菌在腸胃環(huán)境中最大化地發(fā)揮益生作用，調(diào)控宿主代謝，改善宿主健康。然而目前對BSH的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)，底物特異性，催化活性位點(diǎn)及生理功能方面，對其降膽固醇作用機(jī)理研究較少。本文通過對BSH特性及生理功能的總結(jié)，強(qiáng)調(diào)其降膽固醇作用，并分析總結(jié)其降膽固醇機(jī)理，發(fā)現(xiàn)BSH降膽固醇主要與膽固醇的形成方式以及相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，為BSH的研究提供理論基礎(chǔ)。

6.2 然而，BSH對宿主也會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)面影響，如何控制其安全性，防止疾病發(fā)生也值得關(guān)注。但目前關(guān)于膽鹽水解酶降膽固醇的研究結(jié)論主要集中于鼠、豬等動(dòng)物體的實(shí)驗(yàn)，因此，仍需要深入的臨床研究進(jìn)一步揭示BSH特性及降膽固醇機(jī)理，這將對降膽固醇的益生菌保健品及藥物開發(fā)有重要意義。