線粒體與卵母細(xì)胞成熟發(fā)育質(zhì)量的關(guān)系研究進(jìn)展

李 希，王 曦，周勝花，吳蘇君，李春艷，張 麗，郭慧慧，薛麗娜，王宏浩

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太原030032）

作為卵母細(xì)胞中數(shù)量最多且功能最復(fù)雜的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，線粒體在卵母細(xì)胞發(fā)生發(fā)育過程中有著不可替代的作用。大多數(shù)動(dòng)物物種的線粒體都遵循母性遺傳，因?yàn)榫釉谶M(jìn)入卵母細(xì)胞后，其線粒體很快被自噬降解，因此，卵母細(xì)胞是個(gè)體整個(gè)線粒體基因組的唯一來源。作為下一代線粒體基因組的來源，除了保持線粒體基因組的完整模板代代相傳，線粒體在卵母細(xì)胞中的作用更為復(fù)雜和多效[1]。線粒體除了產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），給細(xì)胞提供能量[2]，還參與鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、天然免疫信號(hào)通路等多種生物過程的調(diào)控[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞成熟早期，糖酵解有一個(gè)阻滯期，直到桑葚胚向囊胚期轉(zhuǎn)變時(shí)才會(huì)緩解[4]，因此，卵母細(xì)胞線粒體是卵母細(xì)胞及早期胚胎所需能量的最直接來源。卵母細(xì)胞對線粒體ATP 的依賴引發(fā)了人們對線粒體越來越多的關(guān)注[5]，可以說線粒體是卵母細(xì)胞質(zhì)量或后續(xù)發(fā)育力的主要決定因素。黃睿[6]研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中，線粒體的數(shù)量和形態(tài)發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化，線粒體的這種變化特性直接影響卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的質(zhì)量，線粒體形態(tài)和拷貝數(shù)的異常甚至?xí)?dǎo)致胚胎發(fā)育障礙。因此，線粒體的質(zhì)量和數(shù)量決定著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的能力、受精能力及受精后激活的能力或新胚胎持續(xù)發(fā)育的能力。

筆者就線粒體功能與卵母細(xì)胞成熟發(fā)育的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以了解線粒體功能及線粒體營養(yǎng)劑對卵母細(xì)胞成熟發(fā)育質(zhì)量的影響以及改善線粒體功能和提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的途徑。

1 線粒體結(jié)構(gòu)與功能

1.1 線粒體結(jié)構(gòu)

線粒體被譽(yù)為真核細(xì)胞的能量工廠，是細(xì)胞產(chǎn)能以及進(jìn)行三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、氧化磷酸化等重要生理生化反應(yīng)的場所[7]。其具有特殊的雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)膜相對于細(xì)胞器本身向內(nèi)高度折疊，形成了大小和形狀各異的凹陷叫做嵴。嵴上附著有大量功能蛋白，如氧化磷酸化的相關(guān)蛋白、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[8]，還附著有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)線粒體DNA（mtDNA）。線粒體DNA 呈雙鏈閉合環(huán)狀，長度一般為幾萬至數(shù)十萬堿基對，人類 mtDNA[9]長度約為16.51 kb，無內(nèi)含子，編碼區(qū)共37 個(gè)基因，編碼自身轉(zhuǎn)錄翻譯所需的22 種tRNA、2 種rRNA 以及氧化磷酸化所需的酶復(fù)合物亞單位的13 種蛋白多肽[10]，包括 I、III、IV 和 V 亞基的組成部分。mtDNA 能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及酶基因由細(xì)胞核基因組控制[11]。

1.2 線粒體功能

線粒體的主要功能就是通過呼吸鏈和氧化磷酸化的偶聯(lián)來產(chǎn)生能量并供給細(xì)胞[12]。卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的每一個(gè)步驟，諸如紡錘體形成、染色單體分離和卵母細(xì)胞受精等，都需要大量的能量來供給[13]。因此，卵母細(xì)胞線粒體所產(chǎn)生的ATP 量直接影響其成熟質(zhì)量和受精結(jié)果。

線粒體還可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)對于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和受精過程至關(guān)重要，過高濃度的Ca2+會(huì)抑制ATP 的生成，促進(jìn)活性氧產(chǎn)生[14]。線粒體在卵母細(xì)胞成熟期間逐漸靠近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成緊密聯(lián)系的微區(qū)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的鈣離子通過微區(qū)進(jìn)入線粒體[15]，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化能力[16]。線粒體還調(diào)節(jié)受精過程中的鈣振蕩，通過增加鈣振蕩來誘發(fā)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，這對胚胎發(fā)育至關(guān)重要[17]。所有的ATP 都是由線粒體氧化磷酸化過程產(chǎn)生，還會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS）。少量的ROS 對于細(xì)胞正常生理功能和細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)具有重要作用。

2 線粒體結(jié)構(gòu)與功能對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育質(zhì)量的影響

2.1 線粒體DNA 及拷貝數(shù)對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的影響

在不同組織不同類型細(xì)胞中，線粒體數(shù)量差異很大，具體數(shù)量由其代謝活性決定。在卵母細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等高能源需求的細(xì)胞中，有著最大數(shù)量線粒體和線粒體DNA 拷貝數(shù)。在卵母細(xì)胞成熟過程中，線粒體數(shù)量由原始生殖細(xì)胞中的不足10 個(gè)，至成熟的卵細(xì)胞中增加到10 萬個(gè)以上[18]。線粒體DNA 拷貝數(shù)在成熟過程中也在不斷增加，從原始生殖細(xì)胞的2 000 個(gè)拷貝，到發(fā)育至成熟的卵母細(xì)胞則有15 萬～25 萬個(gè)拷貝[19]。

成熟卵母細(xì)胞中的線粒體拷貝數(shù)明顯增多，這與支持受精及胚胎發(fā)育密切相關(guān)，雖然有證據(jù)顯示，線粒體DNA 拷貝數(shù)量的改變不影響卵母細(xì)胞成熟，但會(huì)影響卵母細(xì)胞受精的能力[20]。SANTOS 等[21]在體外受精研究中發(fā)現(xiàn)，正常受精卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA 拷貝數(shù)明顯要高于受精失敗及退化的卵母細(xì)胞，同時(shí)正常發(fā)育受精卵內(nèi)線粒體DNA 拷貝數(shù)明顯高于發(fā)育受阻的受精卵，提示線粒體DNA 拷貝數(shù)降低是卵母細(xì)胞受精失敗和體外胚胎早期發(fā)育受阻的重要原因。MAY-PANLOUP 等[22]研究表明，盡管較低線粒體拷貝數(shù)小鼠的卵母細(xì)胞能夠支持受精和著床前胚胎發(fā)育，但植入后情況不佳。WAI 等[23]對小鼠線粒體拷貝數(shù)的測定結(jié)果表明，胚胎植入后的發(fā)育卵母細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)所需閾值40 000～50 000 個(gè)。不同物種支持卵母細(xì)胞成熟發(fā)育的線粒體拷貝數(shù)閾值存在較大差異，線粒體拷貝數(shù)太少會(huì)阻礙能量代謝和胚胎質(zhì)量，太多了也會(huì)損害細(xì)胞功能。

另外，線粒體DNA 因?yàn)闆]有組蛋白的保護(hù)，容易發(fā)生突變或受損，而其又無內(nèi)含子，少量的堿基突變就會(huì)引發(fā)其重要功能區(qū)基因的表達(dá)和活性，從而造成質(zhì)量下降及胚胎發(fā)育障礙。

2.2 線粒體結(jié)構(gòu)變化對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的影響

在卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育過程中，為了更好適應(yīng)能量需求，線粒體形態(tài)呈動(dòng)態(tài)變化且有獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)。在成熟卵母細(xì)胞中，線粒體呈球形結(jié)構(gòu)，基質(zhì)致密，僅有少量嵴。到受精卵和2 細(xì)胞期，線粒體呈啞鈴狀，嵴集中分布。接著從4 細(xì)胞期到桑葚胚，線粒體結(jié)構(gòu)逐漸變長，呈現(xiàn)橫嵴[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞成熟過程中，線粒體內(nèi)嵴不斷伸長，甚至與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接構(gòu)成線粒體—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)集合體，基質(zhì)電子密度逐漸降低[25]。KACINSKIS 等[26]在奶牛上的研究和MONDADORI 等[27]在北非野牛上的研究結(jié)果也類似。

線粒體通過持續(xù)的融合和分裂來調(diào)控自身的形態(tài)、數(shù)量、分布和功能等[28]。線粒體形態(tài)在管狀和球狀結(jié)構(gòu)間來回變換[29]。融合初期，2 個(gè)線粒體相互靠近，融合調(diào)控蛋白Mfn1/Mfn2 彼此結(jié)合，使外膜開始逐漸融合[30]。隨后，在融合蛋白OPA1 的作用下，實(shí)現(xiàn)了線粒體的內(nèi)膜融合[31]，2 個(gè)線粒體合二為一。當(dāng)分裂開始時(shí)，胞質(zhì)中的發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白（Drp1）與外膜表面上的分裂因子Fis1、Mff、Mid49和Mid51 等蛋白結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)外膜的斷裂[32]。線粒體融合和分裂的異常常伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)功能的變化。有試驗(yàn)[31]證明，卵母細(xì)胞線粒體融合與分裂失衡的小鼠會(huì)出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)異常，使得線粒體膜電位下降、ATP 生成不足、卵母細(xì)胞紡錘體的組裝出現(xiàn)問題，導(dǎo)致染色體排列異常和非整倍體增加，從而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量。

2.3 線粒體的空間變化對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的影響

在卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育過程中，線粒體會(huì)根據(jù)細(xì)胞對局部能量的需求不斷改變其排列布局，以保持其功能狀態(tài)貫穿整個(gè)細(xì)胞周期以及其他重要的過程。線粒體在未成熟卵母細(xì)胞中主要聚集在生發(fā)泡周圍，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供能量。隨著卵母細(xì)胞生長，線粒體會(huì)逐漸外遷并增殖，為蛋白質(zhì)的合成以及分泌提供能量[33]。在成熟過程中，線粒體則主要位于紡錘體周圍，為微管活動(dòng)和細(xì)胞分裂供能[34]。在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中線粒體分布的這種階段特異性，保證了線粒體在不同發(fā)育階段能更好地發(fā)揮作用，以適應(yīng)能量代謝需求。

劉姍等[35]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在成熟前小鼠卵母細(xì)胞中分布相對均勻，但在GVBD 后，隨著紡錘體的形成，第1 個(gè)減數(shù)分裂中期線粒體在紡錘體周圍與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成集合體；排出第一極體后，線粒體在細(xì)胞質(zhì)周圍重新分布，為卵母細(xì)胞受精做準(zhǔn)備。湯連升等[36]研究發(fā)現(xiàn)，GV 期山羊卵母細(xì)胞中線粒體均勻分散在胞質(zhì)中，而后逐步由皮質(zhì)層移向染色質(zhì)周圍，到MⅡ期密集分布在染色體的周圍。紡錘體形成和極體形成過程中線粒體這些分布的變化與ATP 水平的增加有關(guān)，進(jìn)一步證明線粒體活動(dòng)是在滿足卵母細(xì)胞成熟發(fā)育不同時(shí)期的代謝需求。

在卵母細(xì)胞體外成熟的研究中也發(fā)現(xiàn)這種分布變化。體外成熟之前的卵母細(xì)胞需要顆粒細(xì)胞的支持，線粒體多分布于細(xì)胞質(zhì)的周邊，體外成熟以后，線粒體主要分布于細(xì)胞質(zhì)中央[34]。BREVINI 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在未成熟卵母細(xì)胞和發(fā)育潛能較低的體外成熟卵母細(xì)胞中呈現(xiàn)周邊分布，而在發(fā)育潛能較高的體外成熟卵母細(xì)胞中線粒體多呈均勻分布。

2.4 線粒體膜電位變化對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的影響

許多線粒體功能包括三磷酸腺苷的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)的輸入和脂質(zhì)生物的形成，都依賴于膜電位的維持[38]。膜電位的正常對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育也十分重要，卵母細(xì)胞中線粒體膜電位異常會(huì)造成線粒體功能障礙，繼而引發(fā)胚胎發(fā)育障礙。線粒體膜內(nèi)外的電位差（ΔΨm）大，又稱為線粒體極性高。使用活細(xì)胞成像，觀察到在小鼠卵母細(xì)胞中，ΔΨm 隨著卵母細(xì)胞成熟的時(shí)間進(jìn)程而增加，顯示第1 次減數(shù)分裂紡錘體的附近相對于其他地區(qū)的細(xì)胞質(zhì)，線粒體的ΔΨm 增加，到MⅡ期卵胞質(zhì)周邊ΔΨm 極高，受精后極性瞬間消失[39]。當(dāng)線粒體功能受損或下降時(shí)，線粒體膜電位會(huì)降低，玻璃化會(huì)降低小鼠卵母細(xì)胞線粒體膜電位[40]，玻璃化小鼠受精卵發(fā)育潛能較差。

2.5 ROS 對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育的影響

線粒體的氧化磷酸化過程不僅產(chǎn)生ATP，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），而且細(xì)胞內(nèi)95%的活性氧自由基都來自線粒體，是呼吸鏈中分子氧接受漏電子后還原形成的細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力與活性氧水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平始終維持在一個(gè)較低的生理范圍并調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，對維持細(xì)胞正常生理功能具有重要作用。一旦這種平衡被打破，細(xì)胞ROS 水平升高，高濃度的ROS 就會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激，損傷線粒體DNA，造成線粒體DNA 突變或缺失，ATP 生成減少，線粒體膜上離子交換通道破壞，膜電位消失等[41]，從多個(gè)方面影響卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育質(zhì)量，造成卵母細(xì)胞受精率下降、胚胎發(fā)育受阻、甚至植入后成活率降低。

3 線粒體營養(yǎng)劑及其提高線粒體功能的研究

卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常均會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞代謝受損和發(fā)育質(zhì)量下降，因此，可以通過提高卵母細(xì)胞線粒體功能和補(bǔ)充正常線粒體來改善卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育質(zhì)量。補(bǔ)充線粒體也稱作線粒體替代，是指將體外分離的線粒體供體，通過顯微注射法注入卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟并提高受精發(fā)育能力。方法有生發(fā)泡移植、紡錘體移植、原核移植、極體移植和線粒體移植。由于這些技術(shù)涉及倫理問題，目前已經(jīng)被禁止。而提高線粒體質(zhì)量可以通過補(bǔ)充線粒體營養(yǎng)劑來實(shí)現(xiàn)。已有研究證實(shí)，補(bǔ)充線粒體營養(yǎng)劑可以成功緩解與線粒體缺陷相關(guān)的各種疾病，且對母親和胎兒都是安全的。

線粒體營養(yǎng)劑是指能夠促進(jìn)線粒體產(chǎn)生能量，能夠靶向性保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)功能完整或促進(jìn)線粒體功能發(fā)揮的一類生物或化學(xué)化合物。這些營養(yǎng)劑可以是線粒體的組成成分或者代謝物，也可以是某些天然化合物[42]，主要包括 L- 肉堿、α- 硫辛酸、輔酶Q10、白藜蘆醇、褪黑素、肌酸、膽堿、磷脂、谷胱甘肽和生長激素等。它們具有改善或增強(qiáng)線粒體功能的重要作用，包括維持線粒體與細(xì)胞核、其他細(xì)胞器之間的信息交流[43]；促進(jìn)功能線粒體的生成和損傷線粒體的吞噬降解；直接或者誘導(dǎo)激活抗氧化酶系統(tǒng)，清除自由基，降低線粒體結(jié)構(gòu)的氧化；修復(fù)損傷的線粒體結(jié)構(gòu)等[44]。

研究已證實(shí)，在衰老小鼠膳食中補(bǔ)充α-硫辛酸（作為線粒體代謝中重要的輔酶），可以提高線粒體的活動(dòng)[45]。白藜蘆醇作為一種抗氧化劑，在超氧化物歧化酶和過氧化氫酶這2 種重要的抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用，通過激活各種線粒體代謝靶點(diǎn)如PGC-1、SIRT1、amp- 激酶和抗氧化酶來發(fā)揮作用[46]。對中年小鼠的研究表明，短時(shí)間注射白藜蘆醇，可以有效改善氧化應(yīng)激引起的輸卵管內(nèi)衰老卵母細(xì)胞的破碎和死亡[47]。TAKEO 等[48]研究證明，在卵母細(xì)胞體外成熟液中添加一定濃度的白藜蘆醇，可以通過改善線粒體數(shù)量和質(zhì)量來改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量。在豬的研究中同樣證明，白藜蘆醇可以改善豬卵母細(xì)胞的線粒體性能和發(fā)育能力[49]。研究表明，在小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中補(bǔ)充L- 肉堿（一種重要的脂肪酸β 氧化抗氧化劑），可提高玻璃化卵母細(xì)胞體外成熟后減數(shù)分裂紡錘體配置和線粒體分布[50]。輔酶Q10 作為電子傳遞鏈的重要組成單元，膳食補(bǔ)充輔酶Q10 可降低人卵母細(xì)胞的非整倍體率，逆轉(zhuǎn)人卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量隨年齡的下降[51]。在衰老小鼠飲食中，添加輔酶Q10 能夠改善卵泡減少和增加產(chǎn)仔數(shù)。生長激素是一種多效性激素，影響多種生理功能，包括碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)等[52]。有研究表明，生長激素還可以通過上調(diào)自身受體和增強(qiáng)線粒體活動(dòng)來改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，對低排卵反應(yīng)婦女使用生長激素治療后，增加了卵巢對外源性促性腺激素的敏感性，增加了MⅡ期卵母細(xì)胞的復(fù)蘇受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和妊娠率[53]。研究發(fā)現(xiàn)，生長激素調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞線粒體功能的效果與其劑量有關(guān)，即使用不同生長激素注射劑量作用于老年不孕雌鼠，發(fā)現(xiàn)高劑量生長激素能夠明顯增加總卵母細(xì)胞數(shù)和超數(shù)排卵獲得的卵母細(xì)胞數(shù)；中等劑量生長激素可改善卵母細(xì)胞線粒體功能而不增加線粒體數(shù)量[54]。

歸納起來，線粒體營養(yǎng)劑的作用機(jī)理有5 個(gè)方面。（1）提高線粒體酶的濃度，修復(fù)線粒體功能；（2）清除自由基，減少氧化產(chǎn)物的堆積；（3）修復(fù)線粒體膜；（4）誘導(dǎo)二相酶，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防護(hù)；（5）激活線粒體生成[55]。

4 小結(jié)

了解線粒體在卵母細(xì)胞成熟過程中的動(dòng)態(tài)分布變化，有助于揭示卵母細(xì)胞發(fā)生發(fā)育成熟機(jī)制及線粒體作用機(jī)制，更好地改善線粒體功能和卵母細(xì)胞發(fā)展?jié)摿?。利用線粒體營養(yǎng)劑來提高卵母細(xì)胞線粒體功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量是一種安全有效的途徑。其機(jī)制可能是增加了用于染色體分離的能量。線粒體營養(yǎng)劑對預(yù)防及治療線粒體相關(guān)疾病也具有重要意義，相對于線粒體替代，線粒體營養(yǎng)劑不存在異質(zhì)性問題。目前各種營養(yǎng)劑調(diào)節(jié)線粒體功能的確切機(jī)制仍不清楚，而且發(fā)揮最佳功能的使用劑量有待進(jìn)一步深入研究。