鉏 曦， 邢練軍

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 脾胃二科， 上海 200000

1 背景

1.1 原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC) PBC舊稱原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種進(jìn)行性、非化膿性、破壞性的針對(duì)肝內(nèi)小膽管的炎癥，可以導(dǎo)致肝損傷、肝內(nèi)膽汁淤積甚至最終進(jìn)展至肝硬化[1]。

PBC的疾病發(fā)生率在全球不同地區(qū)存在較大區(qū)別。整個(gè)亞太地區(qū)(含中國(guó)、日本、新西蘭、韓國(guó)、澳大利亞)的PBC發(fā)病率約為1.188%(每100萬(wàn)人中118.75例)，其中中國(guó)為1.912%(每100萬(wàn)人中191.12例)[2]。該病好發(fā)于中年女性，其主要臨床首發(fā)表現(xiàn)為乏力和瘙癢，之后可逐漸出現(xiàn)黃疸，隨后至終末期可見肝硬化失代償?shù)呐R床表現(xiàn)(腹水、脾大等)，PBC終末期患者中可并發(fā)出現(xiàn)原發(fā)性肝癌[3]。PBC的臨床治療方案主要為熊去氧膽酸(UDCA)和奧貝膽酸。其他口服藥物，諸如環(huán)孢素、皮質(zhì)醇、霉酚酸酯等并沒(méi)有顯示出明顯優(yōu)于UDCA的療效[1,3-4]。

目前關(guān)于 PBC 發(fā)病機(jī)制尚未闡明，根據(jù)其流行病學(xué)特征，學(xué)者們認(rèn)為是由多種因素共同作用產(chǎn)生。有關(guān)PBC發(fā)病機(jī)制的研究當(dāng)前聚焦在兩個(gè)方面：膽管微環(huán)境變化所引起的膽汁酸細(xì)胞毒性增加和對(duì)于膽管上皮細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)增強(qiáng)。有學(xué)者[5]認(rèn)為這兩者存在先后關(guān)系，存在一個(gè)始作俑者，后者由前者誘發(fā)。然而，筆者認(rèn)為這樣的探討值得商榷，兩者并不是單向的因果關(guān)系，而是彼此互為因果的循環(huán)因果關(guān)系，陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2, AE2)的研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。

1.2 陰離子交換蛋白2(AE2) AE2是AE家族中的一員，是一種在細(xì)胞膜上的陰離子交換蛋白，主要作用是交換細(xì)胞膜內(nèi)外的HCO3-/Cl-，同屬于這一家族的還有AE1、AE3。AE2分為AE2a、AE2b、AE2c三個(gè)變體，變體各自在生理學(xué)功能上的區(qū)分目前仍處于研究中。AE2主要分布在上皮細(xì)胞的外側(cè)基底部(正常肝臟的小膽管的外側(cè)基底部)[6-7]。在PBC發(fā)病過(guò)程中至關(guān)重要的膽管上皮細(xì)胞上亦有AE2。

2 AE2在PBC發(fā)病中的作用

最初，AE2被人們注意，是發(fā)現(xiàn)在PBC患者肝臟組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中AE2數(shù)量明顯降低，而經(jīng)過(guò)UDCA或其他一些有效治療后，AE2水平又出現(xiàn)了上調(diào)[4，8-9]。隨著對(duì)AE2和PBC發(fā)病之間的研究逐漸深入，目前認(rèn)為，AE2主要通過(guò)兩種方式參與到PBC的發(fā)病過(guò)程中：參與膽管微環(huán)境的改變以及參與對(duì)膽管上皮細(xì)胞(BEC)的自身免疫反應(yīng)，且都發(fā)揮了重要作用。

2.1 AE2維持膽管微環(huán)境的穩(wěn)定 在正常健康人群的BEC周圍存在一個(gè)成分以HCO3-為主的屏障，稱為碳酸氫鹽屏障。在PBC患者中發(fā)現(xiàn)該屏障遭到破壞從而導(dǎo)致BEC發(fā)生損傷以及凋亡[10-11]。如前所述，AE2可以調(diào)節(jié)HCO3-濃度，因此認(rèn)為它是碳酸氫鹽屏障維持穩(wěn)定的保障[12]。

動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明了上述觀點(diǎn)。在小鼠中人為結(jié)扎膽管制造梗阻性膽汁淤積后，肝細(xì)胞內(nèi)和外周血中的AE2 mRNA和AE2數(shù)量均有減少。并且結(jié)扎后，小鼠細(xì)胞中對(duì)于HCO3-/Cl-離子交換的效率同對(duì)照組相比出現(xiàn)了下降，AE2活性降低。證明膽汁和其中毒性物質(zhì)在破壞碳酸氫鹽屏障后對(duì)BEC和AE2造成損傷，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞衰老及相應(yīng)細(xì)胞毒性作用[13]。除此之外，膽汁酸所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性及膽汁酸的結(jié)構(gòu)和PH值存在聯(lián)系：疏水程度越高、pH越低，則AE2數(shù)量就更低[14-15]。而在服用UDCA，改變膽汁分泌的成分后，PBC以及一些非梗阻性膽汁淤積的患者在病情得到控制的同時(shí)，其體內(nèi)的AE2數(shù)量上升，也從側(cè)面說(shuō)明AE2功能對(duì)于維持膽道微環(huán)境至關(guān)重要[9]。經(jīng)過(guò)處理后抑制了AE2的人類BEC可以產(chǎn)生更多的可溶性腺苷酸環(huán)化酶(soluble adenylyl cyclase，sAC)，而sAC可以導(dǎo)致膽汁酸對(duì)BEC的毒性增強(qiáng)，對(duì)其進(jìn)行抑制則可以降低膽汁酸對(duì)細(xì)胞的毒性。這表明AE2數(shù)目減少會(huì)破壞膽管微環(huán)境[16]。

綜上，AE2在維持對(duì)BEC相對(duì)無(wú)害的膽管微環(huán)境中起到重要作用。當(dāng)AE2功能由于各種原因受損或數(shù)量下降時(shí)，膽管微環(huán)境發(fā)生變化，碳酸氫鹽屏障受損，BEC受到細(xì)胞毒性損傷而導(dǎo)致凋亡引起惡性循環(huán)。

2.2 AE2參與自身免疫反應(yīng)調(diào)控 將PBC小鼠模型表達(dá)AE2a、b的基因敲除后，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生了和PBC類似的改變，包括：AMA抗體陽(yáng)性、血清IgG和IgM升高、外周血ALP升高、CD8+T淋巴細(xì)胞水平增加、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)水平降低、膽管內(nèi)存在大量炎癥細(xì)胞[17-18]。進(jìn)一步研究[19]顯示，在AE2敲除的早期(1～9個(gè)月)，肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，PD-1/PD-L1被激活；在10個(gè)月后CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目增加使得PD-1受到抑制從而更有利于誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。進(jìn)一步研究AE2和自身免疫反應(yīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AE2數(shù)量減少時(shí)，BEC會(huì)產(chǎn)生更多的趨化因子和細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、CXCL10)，進(jìn)一步導(dǎo)致BEC受到更多的自身免疫損傷，并使得更多的免疫細(xì)胞向BEC周圍移動(dòng)，讓BEC更易受損和衰老[14]。研究[20]還發(fā)現(xiàn)肽鏈(p17AE2)的水平和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、Treg的數(shù)量及表達(dá)水平有關(guān)，而其有助于AE2蛋白完成離子交換。對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行篩選及分離之后進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)有多種淋巴細(xì)胞存在時(shí)，AE2缺失對(duì)于離子交換的影響要遠(yuǎn)小于單純只有CD8+T淋巴存在的環(huán)境[21]。提示相較于其他淋巴細(xì)胞，CD8+T淋巴細(xì)胞更加依靠AE2進(jìn)行HCO3-/Cl-的交換來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，從而維持CD8+T淋巴細(xì)胞的穩(wěn)定[22]。而CD8+T淋巴細(xì)胞是膽管損傷的關(guān)鍵，在PBC患者的肝臟組織、外周血、肝淋巴結(jié)中均可以被檢測(cè)到較正常人增加[21]。

以上研究表明，AE2對(duì)T淋巴細(xì)胞和一些細(xì)胞因子及趨化因子可以起到調(diào)控作用。推測(cè)AE2可能通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)PH值，影響其特定細(xì)胞作用和功能，從而參與自身免疫反應(yīng)的調(diào)控，進(jìn)而參與到PBC發(fā)病過(guò)程中的自身免疫反應(yīng)。

2.3 PBC相關(guān)的AE2調(diào)控 當(dāng)前對(duì)于AE2的調(diào)控主要聚焦在2個(gè)方面，表觀遺傳學(xué)和microRNA(miRNA)。

對(duì)表觀遺傳學(xué)的研究顯示，基因甲基化是常見的表觀遺傳學(xué)改變，是轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制。在PBC患者肝組織及PBMC中分離出AE2的mRNA后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在某些片段[AE2的啟動(dòng)子區(qū)域(-274a、-254a、-249)、AE2的可變啟動(dòng)子區(qū)域(-307b2、-280b2、-263b2、-261b2)]上PBC相比其他肝臟疾病及正常對(duì)照存在特有的甲基化。從而可能導(dǎo)致后續(xù)AE2 mRNA表達(dá)降低,從而對(duì)AE2產(chǎn)生負(fù)調(diào)控[23]。對(duì)于進(jìn)一步的甲基化原因以及上述不同甲基化片段各自是否存在不同之處，進(jìn)而導(dǎo)致PBC不同時(shí)期的不同表現(xiàn)仍有待進(jìn)一步研究。

對(duì)miRNA的研究顯示，其通過(guò)和mRNA之間互相作用從而影響編碼和翻譯過(guò)程，并進(jìn)一步影響基因及對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)。在肝臟疾病中有許多的miRNA參與了發(fā)病的各個(gè)過(guò)程[24-25]。和正常人相比，PBC患者中發(fā)現(xiàn)有35個(gè)獨(dú)立的miRNA水平出現(xiàn)了變化，其中11個(gè)上調(diào)、24個(gè)下調(diào)[26-27]。miRNA-506(miR-506)是上調(diào)的11個(gè)miRNA之一，其上調(diào)導(dǎo)致BEC上AE2活動(dòng)及表達(dá)水平的下降。當(dāng)受到促炎癥因子包括IL-12、IL-17、IL-18和TNFα刺激時(shí)，miR-506的水平會(huì)提升，之后與AE2 mRNA的3′端未翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，抑制其蛋白的翻譯，導(dǎo)致AE2活性下降并進(jìn)一步對(duì)AE2的表達(dá)進(jìn)行抑制[28-29]。與此同時(shí)研究[26]發(fā)現(xiàn)抑制miR-506可以改善BEC中細(xì)胞凋亡及損傷，并且降低膽汁酸對(duì)它的毒性。提示AE2的水平受到miR-506的調(diào)控。

除了上述兩大方面，碳酸酐酶(CA)中的CAⅫ對(duì)于激活正常人體細(xì)胞上的AE2功能同樣重要，因此有研究者認(rèn)為CAⅫ發(fā)生突變后糖基化異常及錯(cuò)誤的構(gòu)型折疊也會(huì)引起AE2活性減退，從而引起疾病[30]。另外有相當(dāng)多的研究[31-32]發(fā)現(xiàn)一些藥物諸如戒酒硫(disulfiram)、利福平均對(duì)于特定細(xì)胞上的AE2表達(dá)存在調(diào)控及影響。但是此類研究并沒(méi)有針對(duì)PBC患者或BEC，因此是否對(duì)于PBC中的AE2同樣具備調(diào)控作用仍然有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 結(jié)論

膽管微環(huán)境和自身免疫反應(yīng)是PBC發(fā)病機(jī)制中不可忽視的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，研究顯示AE2對(duì)上述兩方面均有參與，因此通過(guò)AE2可以將PBC中的部分自身免疫反應(yīng)和膽管微環(huán)境改變聯(lián)系起來(lái)。進(jìn)一步研究以期更好地闡明膽管微環(huán)境和自身免疫反應(yīng)之間關(guān)系以及PBC發(fā)病機(jī)制的相關(guān)假說(shuō)。

與此同時(shí)，有關(guān)AE2仍然有許多問(wèn)題等待進(jìn)一步研究和解決：AE2變體之間的區(qū)別；miR-506調(diào)控AE2的具體機(jī)制；miR-506的影響因素；引起AE2表觀遺傳學(xué)改變的因素；AE2是否參與到更多的免疫反應(yīng)；膽管上皮細(xì)胞上的AE2如何和其他細(xì)胞上的AE2進(jìn)行區(qū)分等。更進(jìn)一步，通過(guò)探索AE2調(diào)控及起效的上下游物質(zhì)，希望可以尋找到潛在的新的PBC治療方法以及相關(guān)診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)，從而為PBC的診斷和治療提供更多幫助。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：鉏曦負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；邢練軍負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并幫助修改論文。