小檗堿對(duì)奧氮平誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠炎癥因子及TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

蘭建萍，劉守青，謝欣娥，王 俊

0 引言

奧氮平(Olanzapine，OLA)是臨床抗精神分裂癥的首選藥物之一[1]，但是易引起代謝紊亂，如體重增加、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)等[2]。IR發(fā)生或加重與胰島素受體底物信號(hào)的損害有關(guān)[3]。Toll樣受體-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)是模式識(shí)別受體家族的一員，其通過激活炎癥通路(如激活核因子κB，Nuclear factor kappa B，NF-κB)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[4]。因此,抑制胰島素靶組織(肌肉、肝臟和脂肪組織)中TLR-4/NF-κB信號(hào)通路有望成為預(yù)防長期服用奧氮平引起代謝紊亂的新靶點(diǎn)[5]。小檗堿(Berberine，BBR)是一種常見的異喹啉類生物堿，可被用于治療一些慢性代謝紊亂性疾病，并且在多種疾病模型中，TLR-4/NF-κB通路被證實(shí)是BBR發(fā)揮生理學(xué)作用的重要機(jī)制之一[6-8]。故本文旨在基于TLR-4/NF-κB通路，探討B(tài)BR對(duì)OLA誘導(dǎo)的胰島素抵抗的改善作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只6周齡SPF級(jí)的雄性SD大鼠(220±10)g購于湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。將動(dòng)物飼養(yǎng)在浙江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2019-0024。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。飼養(yǎng)環(huán)境：(22±2)℃，12 h光/暗交替，單籠飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500 型Real-time PCR儀購自美國Thermofisher公司；One Touch Ultra穩(wěn)豪系列血糖儀購自美國LifeScan Inc公司，試紙批號(hào)287695。奧氮平(貨號(hào)：LRAA9505，含量>99%)，小檗堿(貨號(hào)：67K1454)購自美國Sigma公司；胰島素(E-EL-R2466c)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)(E-EL-R0019c)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin 1beta，IL-1β)(E-EL-R0012c)及IL-6(E-EL-R0015c)ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特公司。初級(jí)單克隆抗體包括TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitor α，IκBα)、p-IκBα及β-actin和二級(jí)抗體均購自于賽信通(上海)生物試劑有限公司；

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 在實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)飼養(yǎng)1周。稱量大鼠體重，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、OLA組和OLA+BBR組，每組各12只。OLA組大鼠每日腹腔注射OLA 8 mg/kg，OLA+BBR組大鼠給予OLA(腹腔注射)8 mg/kg+BBR(灌胃)200 mg/kg，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水，連續(xù)給藥8周。應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模型法(HOMA model)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)，OLA組HOMA-IR與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表明建模成功。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 空腹血糖、體重及IR指數(shù)測定 常規(guī)記錄大鼠體重。最后1次給藥結(jié)束后，禁食14 h，從尾尖切口采集血液標(biāo)本約0.5 ml，置于EP管中抗凝后，3 500 r/min離心20 min(半徑22 cm)。用血糖儀測定空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平。并采用胰島素ELISA試劑盒測定各組大鼠血清空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)ins)水平，計(jì)算HOMA-IR。HOMA-IR = FBG (mmol/L) ×Fins(μg/L) /22.5。

1.4.2 組織樣本獲取 最后1次采血結(jié)束后，取大鼠肝臟和附睪白色脂肪組織(Epididymal white adipose tissues，eWAT)切開分成2部分：一半用液氮凍存后保存在-80 ℃下，直至用于Western blot分析；另一半用4%多聚甲醛在0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中浸泡固定。石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。

1.4.3 ELISA法檢測血清和組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取肝臟和eWAT組織，經(jīng)液氮碾磨，用RIPA裂解液提取組織中的蛋白。收集大鼠血清，采用BCA試劑盒對(duì)樣本蛋白進(jìn)行定量，ELISA法檢測血清和組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平。

1.4.4 Western blot法檢測肝臟和eWAT組織相關(guān)蛋白 取肝臟和eWAT組織蛋白。經(jīng)BCA定量后，采用Western blot技術(shù)，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。按抗體說明書進(jìn)行配比，分別用TLR4抗體(1∶200)、p-NF-κB p65抗體(1∶500)、NF-κB p65抗體(1∶250)、IκBα抗體(1∶500)、p-IκBα抗體(1∶500)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。加入帶HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。曝光儀曝光。

1.4.5 病理組織分析 利用標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)肝臟和eWATs進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，并進(jìn)行石蠟包埋。將組織切片(4 μm)在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)OLA誘導(dǎo)的IR大鼠模型體重、血糖和IR的影響 實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，OLA組大鼠體重、血清FBG、Fins和HOMA-IR均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而OLA+BBR組大鼠血清FBG、Fins和HOMA-IR低于OLA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠FBG、Fins、IR比較

2.2 BBR對(duì)OLA誘導(dǎo)的IR大鼠模型血清和組織中炎癥因子水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，OLA組大鼠血清和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6均高于對(duì)照組(P<0.05)；而OLA+BBR組大鼠血清和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于OLA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠血清和組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與OLA組相比，#P<0.05

2.3 BBR對(duì)OLA誘導(dǎo)的IR大鼠肝臟和eWAT組織病理改變的影響 顯微鏡下顯示，與對(duì)照組大鼠相比，OLA組以彌漫性肝大泡性脂肪變性為主要特征，胞漿內(nèi)可見大小不等的圓形空泡，脂肪細(xì)胞體積增大且形態(tài)大小不一，并且可見部分泡沫細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量增多。而OLA+BBR組肝臟和eWAT組織上述病理學(xué)改變較OLA組減輕，且中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，未見明顯纖維化改變，見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟和eWAT組織HE染色(100×)注：黃色箭頭表示胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的圓形空泡

2.4 BBR對(duì)OLA誘導(dǎo)的IR大鼠肝臟組織和eWAT組織中TLR4/NF-kB炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)Western blot法檢測，OLA組肝臟組織和eWAT組織中TLR4/β-actin、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα蛋白表達(dá)比值均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而OLA+BBR組肝臟組織和eWAT組織中TLR4/β-actin、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα蛋白表達(dá)比值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western blot法檢測各組蛋白表達(dá)注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與OLA組相比，#P<0.05

3 討論

長期服用非典型抗精神病藥物OLA所致胰島素抵抗可能導(dǎo)致藥物不依從，增加胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)等，是目前臨床上亟待解決的重要問題[9]。BBR是在黃連、黃柏等藥材中含量較高的異喹啉生物堿，能夠顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型體重增加和血糖血脂及炎癥因子水平升高，同時(shí)上調(diào)脂聯(lián)素濃度、下調(diào)瘦素水平、改善胰島素抵抗等[10]。黃平等[11]通過納入105例OLA致體重增加的精神分裂癥患者作為研究對(duì)象，證實(shí)黃連與肉桂配伍可改善長期服用奧氮平引起的糖脂代謝紊亂；此外，劉守青等[12]則利用長期服用OLA構(gòu)建的大鼠胰島素抵抗模型證實(shí)，黃連聯(lián)合枸杞子可顯著降低胰島素抵抗相關(guān)蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B、香葉基香葉基焦磷酸合成酶、G蛋白偶聯(lián)受體激酶2、三酰甘油脂肪酶的表達(dá)水平，進(jìn)而改善大鼠的胰島素抵抗，為臨床預(yù)防或降低OLA不良反應(yīng)提供了一定的參考依據(jù)。但是目前很少有學(xué)者討論BBR單獨(dú)用藥對(duì)OLA誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型的影響。本文結(jié)果初步證實(shí)，BBR通過抑制輕度炎癥反應(yīng)進(jìn)而明顯減輕OLA誘導(dǎo)的胰島素抵抗，其機(jī)制之一可能與阻止TLR-4/NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活有關(guān)。

BBR具有多種生物活性，例如通過抑制 TLR-4/NF-κB通路[13-15]，減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷、炎癥反應(yīng)以及高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[16]；改變肥胖大鼠模型腸道微生物組成并增加肝糖原合成量，進(jìn)而降低FBG、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和胰島素抵抗等[7，17]。此外Zhao等[18]發(fā)現(xiàn)，BBR還可抑制LPS誘導(dǎo)的TLR-4/NF-κB炎癥信號(hào)通路激活，導(dǎo)致胰島素受體和胰島素受體底物-1在肝臟中的表達(dá)增加，進(jìn)而減輕非酒精性脂肪肝引起的肝臟脂肪變性，說明抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路激活可能也是BBR改善胰島素抵抗的重要分子機(jī)制之一。在臨床實(shí)際中，OLA引起的體重增加可能導(dǎo)致藥物依從性差，并增加胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過大鼠模型證實(shí)，連續(xù)灌胃8周，BBR(200 mg/kg)可顯著降低OLA誘導(dǎo)的IR大鼠模型血清FBG水平和HOMA-IR，并減緩大鼠體重增加速度，且對(duì)于肝臟組織和eWAT組織脂肪變性有一定的預(yù)防作用。

近年來，炎癥在多種因素介導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視[19-20]。促炎性細(xì)胞因子與胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)性[21]。在本研究中，OLA可顯著增加血清、肝臟組織和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，而OLA+BBR組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平則低于OLA組，說明BBR有一定的抗炎作用，這可能是其有助于抑制大鼠IR的重要原因。TLR-4是TLRs家族中的一員，它通過激活炎癥途徑來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[22]。與相關(guān)配體CD14、MD2等結(jié)合之后，通過IκB激酶(IκB kinase，IKK)-NF-κB復(fù)合物和絲裂原活化激酶(Mitogen activated kinase，MAPK)途徑促進(jìn)下游信號(hào)傳遞，進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素受體信號(hào)[23]。另外，García-Bueno等[24]在精神分裂癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)TLR4促炎通路處于激活狀態(tài)。同時(shí)，長期使用OLA會(huì)進(jìn)一步上調(diào)TLR-4表達(dá)[25]，隨著時(shí)間的推移，這種上調(diào)會(huì)削弱胰島素的作用，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素靶組織(肌肉、肝臟和脂肪組織等)和免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中TLR-4表達(dá)增加和下游信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，引起胰島素抵抗。因此，TLR-4/NF-κB炎癥信號(hào)通路可能是治療OLA誘導(dǎo)的胰島素抵抗的有效分子靶點(diǎn)[26-27]。本研究結(jié)果表明,BBR能有效抑制OLA導(dǎo)致的TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活。這也與Zhu等[28]在糖尿病腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)的小檗堿通過抑制TLR4/NF-κB途徑改善糖尿病腎病的結(jié)論相佐證。

總之，本研究首次應(yīng)用BBR對(duì)OLA誘導(dǎo)的IR大鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，取得了良好的藥效學(xué)結(jié)果，證實(shí)BBR可明顯減緩IR大鼠的體重增加速度和炎癥反應(yīng)，可能有助于改善胰島素抵抗，其作用機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路激活有關(guān)。但是本研究也存在一定的局限性，一方面該結(jié)論無法證實(shí)BBR與OLA是否存在藥物之間的相互作用；另一方面BBR對(duì)于OLA誘導(dǎo)的胰島素抵抗的改善作用是否還受到其他通路或機(jī)制的影響尚不得知，這將是本課題組下一步工作的研究重點(diǎn)。