李婷婷，王書夢(mèng)，項(xiàng) 艷

0 引言

膿毒血癥是一種死亡率極高的全身性炎癥反應(yīng)疾病，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[1]。嚴(yán)重膿毒血癥患者可出現(xiàn)多器官功能衰竭，而腎臟是最容易受損的臟器之一[2]。因此，緩解膿毒血癥引起的腎臟損傷具有重要的臨床意義。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，AG)是從中藥穿心蓮中提取分離得到的一種二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[3-5]。近年來(lái)研究顯示，AG對(duì)膿毒血癥大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，該作用與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[6]。但由于AG口服生物利用度較差，很難應(yīng)用于臨床。

近年來(lái)，納米給藥系統(tǒng)在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛發(fā)展，因其可提高藥物的溶解度和生物利用率，解決了許多難溶性或難吸收藥物的給藥問(wèn)題。脂質(zhì)聚合物納米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNs)是納米給藥系統(tǒng)的一種，目前已應(yīng)用于遞送藥物和診斷成像劑等領(lǐng)域[7]。為了解決AG的口服生物利用度，本研究通過(guò)納米沉淀法制備載穿心蓮內(nèi)酯脂質(zhì)聚合物納米粒(AG-LPNs)并對(duì)其進(jìn)行表征，通過(guò)建立膿毒血癥大鼠模型，觀察AG-LPNs對(duì)膿毒血癥腎損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，[SCXK(京)2016-0001]，動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房中，每籠3～4只，自由飲水、攝食，12 h光照/12 h黑暗，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 試劑 穿心蓮內(nèi)酯原料藥(分子式：C20H30O5；含量>98%)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；大豆卵磷脂購(gòu)自德國(guó)Lipoid公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇購(gòu)自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)和腎損傷分子-1(KIM-1)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物公司；乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；RPMI裂解液，BCA蛋白定量試劑盒，TUNEL、HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、GAPDH抗體、抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自上海愛(ài)必信公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 SIGMA 2-16K離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品)；Nano ZS 90激光粒度儀(英國(guó)Malvern公司產(chǎn)品)；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司產(chǎn)品)；JEM-2100場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品)；AI600凝膠成像儀(美國(guó)GE公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 AG-LPNs的制備 采用納米沉淀法制備AG-LPNs。將23 mg磷脂用250 μl無(wú)水乙醇溶解，分散到20 ml去離子水中，65 ℃水浴，300 r/min攪拌30 min，此為水相備用。將60 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物和10 mg AG用10 ml乙腈溶解，作為有機(jī)相。將有機(jī)相與水相混合，100 r/min攪拌2 h。37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙腈。將得到的溶液4 000 r/min離心10 min，除去未包載的AG沉淀，得到AG-LPNs，冷藏備用。

包封率測(cè)定：將AG-LPNs分散液中加入乙腈，超聲破乳，0.45 μm針式濾器過(guò)濾，取濾液經(jīng)高效液相色譜測(cè)定AG含量。同時(shí)取AG-LPNs于超濾離心管中，3 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜測(cè)定其AG含量。

粒徑和電位測(cè)定：采用激光粒度儀測(cè)定AG-LPNs粒徑和Zeta電位。

形態(tài)觀察：取制備的AG-LPNs，去離子水稀釋，將樣品滴加到銅網(wǎng)上，自然干燥，利用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)。

2.2 膿毒血癥模型建立和分組給藥 參考文獻(xiàn)[6]，采用盲腸結(jié)扎法制備膿毒血癥大鼠模型。用異氟烷將大鼠麻醉并仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)面上，剪開(kāi)腹部，暴露盲腸并結(jié)扎。假手術(shù)組進(jìn)行手術(shù)，但不結(jié)扎。將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、AG組、AG-LPNs組。同時(shí)以只進(jìn)行手術(shù)，但不結(jié)扎的大鼠作為假手術(shù)組。術(shù)后12 h開(kāi)始灌胃給藥。AG組和AG-LPNs組給予AG量50 mg/kg，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水，每12小時(shí)給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

2.3 血液中Scr和BUN測(cè)定 取大鼠靜脈血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，記錄吸光度值，參考說(shuō)明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品Scr和BUN濃度。

2.4 尿液中NGAL和KIM-1的測(cè)定 收集大鼠尿液，尿液靜置后1 500 r/min離心5 min，取上層液進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算NGAL和KIM-1濃度。

2.5 TUNEL染色檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況 將腎臟組織置于10%中性福爾馬林中固定，而后修剪、脫水、透明、石蠟包埋，制作切片，加入細(xì)胞通透液處理8 min，冰浴孵育，按說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色，滴加50 μl TUNEL染色液37 ℃濕盒內(nèi)孵育1 h，PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

2.6 HE染色檢測(cè)腎臟組織病理變化 將腎臟組織制成切片，經(jīng)梯度二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，自來(lái)水沖洗，切片分別以伊紅和蘇木素染色，自來(lái)水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，稍晾干后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

2.7 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)水平 腎臟組織經(jīng)RPMI裂解液提取總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后制備蛋白樣品，樣品經(jīng)PAGE電泳分離蛋白，后將分離的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉4 h，4 ℃孵育Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)及caspase-3(1∶1 000)抗體過(guò)夜。TBST洗膜后孵育抗兔IgG-HRP二抗1 h。膜經(jīng)TBST洗后淋ECL發(fā)光液，置于凝膠成像儀下成像。

3 結(jié)果

3.1 AG-LPNs體外表征 如圖1所示，AG-LPNs的平均動(dòng)力學(xué)直徑分別為(180±23) nm，Zeta電位為(-18±2.6) mV，其包封率和載藥量分別為86%和12%。透射電鏡下，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見(jiàn)明顯的核殼結(jié)構(gòu)。

圖1 AG-LPNs體外表征圖注：A.AG-LPNs粒徑，B.AG-LPNs電位，C.透射電鏡下AG-LPNs形態(tài)

3.2 大鼠血清和尿液指標(biāo)檢測(cè) 如表1所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清Scr和BUN升高，尿液中NGAL和KIM-1升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相較于模型組，AG組和AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與AG組相比，AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1下調(diào)更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平比較

3.3 大鼠腎臟細(xì)胞凋亡分析 如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，AG組和AG-LPNs組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)，其中AG-LPNs組細(xì)胞降低更為明顯(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡水平注：與假手術(shù)組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

3.4 大鼠腎臟組織HE染色 如圖3所示，與假手術(shù)組相比，模型組腎臟組織可見(jiàn)廣泛腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡、變性、脫落，同時(shí)腎臟組織還可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和核質(zhì)分離現(xiàn)象。AG和AG-LPNs組出現(xiàn)明顯改善，其中AG-LPNs組改善更為明顯。

圖3 各組大鼠腎臟組織HE染色

3.5 大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)水平 如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。與模型組相比，AG和AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。與AG組相比，AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)

圖4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)水平注：與假手術(shù)組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

4 討論

近年來(lái)，納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用取得了進(jìn)步，極大地改善了小分子藥物、大分子生物藥品及診斷顯像劑等的臨床應(yīng)用效果[8]。納米載體具有眾多優(yōu)勢(shì)，如改善藥物的整體藥代動(dòng)力學(xué)、增強(qiáng)藥物的溶解性和生物利用度、增強(qiáng)藥物的靶向性、規(guī)避固有生物學(xué)障礙、遞送不同化學(xué)性質(zhì)的藥物等[9-10]。在眾多納米載體中，最突出的兩種為脂質(zhì)體和聚合物納米粒[11]。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性，但其靶向分布欠佳[11-12]。而聚合物納米粒能夠有效控制藥物釋放，并在一定程度上提高藥物穩(wěn)定性，但其生物相容性較差[11-12]。因此，二者的應(yīng)用都受到了一定的限制。LPNs具有殼核結(jié)構(gòu)，兼有脂質(zhì)體和聚合物納米粒兩者的優(yōu)點(diǎn)[13]，具有較好的發(fā)展前景。

AG作為天然化合物，在抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面發(fā)揮一定作用[3-5]。但AG的口服生物利用度不高，為了解決這一問(wèn)題，本研究制備了AG-LPNs。結(jié)果顯示，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見(jiàn)明顯的核殼結(jié)構(gòu)。檢測(cè)AG-LPNs直徑、Zeta電位、包封率和載藥量，確定其可滿足實(shí)驗(yàn)要求。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了膿毒血癥模型大鼠，并發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1明顯升高。研究證實(shí)，血清Scr、BUN以及尿液NGAL、KIM-1升高與腎損傷相關(guān)[14]。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組腎臟組織可見(jiàn)廣泛腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性以及脫落，并有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和核質(zhì)分離現(xiàn)象。這提示本研究構(gòu)建的膿毒血癥大鼠伴隨腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，AG和AG-LPNs治療均可降低模型大鼠血清Scr和BUN，以及尿液中NGAL和KIM-1水平，且AG-LPNs效果更為顯著。組織學(xué)分析結(jié)果顯示，AG和AG-LPNs均明顯改善了膿毒血癥大鼠腎臟組織細(xì)胞的病理變化，同樣AG-LPNs效果更佳。提示以LPNs載AG可增強(qiáng)后者對(duì)腎損傷的保護(hù)作用。TUNEL染色觀察腎臟組織凋亡情況發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡增多，而AG和AG-LPNs可降低細(xì)胞凋亡水平，并且AG-LPNs的作用更具優(yōu)勢(shì)。在分子水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，以及Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而AG和AG-LPNs可抑制模型大鼠腎臟組織上述3種蛋白表達(dá)變化，并且AG-LPNs的抑制作用更強(qiáng)。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白中的代表成員；而Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，其剪切體Cleaved Caspase-3增多與凋亡明顯相關(guān)[15-16]。提示AG-LPNs可調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制膿毒血癥腎損傷大鼠腎細(xì)胞凋亡。

與傳統(tǒng)脂質(zhì)體和聚合物納米粒相比，LPNs在藥物包封、控制藥物釋放及增強(qiáng)藥物攝取方面顯示出明顯優(yōu)勢(shì)[16]。這些可能是本研究AG-LPNs對(duì)膿毒血癥大鼠腎損傷具有較好保護(hù)作用的原因。但AG-LPNs在體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。綜上所述，與AG相比，AG-LPNs對(duì)膿毒血癥大鼠腎損傷保護(hù)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，這一優(yōu)勢(shì)可能與AG-LPNs較強(qiáng)的抗凋亡作用有關(guān)。