赤紅球菌組氨酸激酶的融合表達(dá)和功能分析

吳鐘昊，彭 仁

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

組氨酸激酶是一種膜蛋白，它的功能主要發(fā)生在雙組分系統(tǒng)途徑中。在原核生物中，雙組分系統(tǒng)通常僅限于兩個(gè)功能模塊之間的通信——組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)控蛋白之間的磷酸化轉(zhuǎn)移。在經(jīng)典的原核系統(tǒng)中，信號(hào)感知可調(diào)節(jié)組氨酸激酶在保守組氨酸殘基上的自磷酸化，然后轉(zhuǎn)移至組氨酸激酶的C端結(jié)構(gòu)域中的保守天冬氨酸殘基，最后傳遞至反應(yīng)調(diào)控蛋白的保守天冬氨酸殘基，從而磷酸化反應(yīng)調(diào)控蛋白影響下游基因的轉(zhuǎn)錄[1]。組氨酸激酶是細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心，它的多樣性、多功能性、廣泛的分布以及與下游相關(guān)組件配合的特殊性，使其成為生物治療[2]和生物技術(shù)操作[3]的重要目標(biāo)，并成為生物傳感器系統(tǒng)工程的基礎(chǔ)[4-5]。

紅球菌作為一類(lèi)重要的模式微生物，在自然環(huán)境中分布廣泛且菌株種類(lèi)多樣。它具有降解有機(jī)污染物[6-8]、生物轉(zhuǎn)化[9-10]、產(chǎn)色素[11]和胡蘿卜素[12]、產(chǎn)表面活性劑[13]、降解毒素[14]等作用，在環(huán)境治理、生物合成與轉(zhuǎn)化以及醫(yī)藥領(lǐng)域都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前尚鮮有紅球菌組氨酸激酶的研究報(bào)道。

赤紅球菌（Rhodococcus ruber）SD3是1 株耐受多種有機(jī)溶劑耐受菌，在前期工作中發(fā)現(xiàn)在苯酚和甲苯的脅迫下，組氨酸激酶基因的表達(dá)均發(fā)生下調(diào)。為研究組氨酸激酶在R.ruberSD3獨(dú)特生理特性中的作用，本研究通過(guò)異源表達(dá)得到有活性的組氨酸激酶融合蛋白，并確定組氨酸激酶與R.ruber有機(jī)溶劑耐受性之間的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步揭示R.ruberSD3中組氨酸激酶涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與R.ruber有機(jī)溶劑耐受性的關(guān)聯(lián)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

R.ruberSD3保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO：M2012035。pGEX-4T-2質(zhì)粒、大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10和BL21（DE3）感受態(tài)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基二乙胺、還原型谷胱甘肽、核酸染料、ATP、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒 上海Beyotime公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒 美國(guó)Axygen公司；GoTaq?GreenMaster Mix、Kinase-GloTMLuminescent Kinase Kit 美國(guó)Promega公司；BamH I、Hind III等限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶 美國(guó)New England Biolabs公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；TC-XP-G XP基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司；JY96-IIN細(xì)胞破碎儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；2524DN-384-04 24DN型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；MBE-150水平凝膠電泳儀 美國(guó)Major Science公司；E5331 GloMax熒光測(cè)量?jī)x 美國(guó)Promega公司；Nano-200超微量核酸分析儀 杭州奧盛儀器有限公司；D3024R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)SCILOGEX公司；MicroPulserTM電轉(zhuǎn)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ekspertTMnano液相色譜系統(tǒng)、Triple TOF 5600-plus高分辨串聯(lián)質(zhì)譜美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1R.ruberSD3組氨酸激酶基因（rhk）密碼子優(yōu)化和基因合成

對(duì)rhk基因（GenBank的序列登錄號(hào)為MN688330）進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其稀有密碼子較多，GC含量較高，存在一些重復(fù)序列，并且存在一段跨膜區(qū)。為了能在E.coli中進(jìn)行有效表達(dá)，采用通用生物公司開(kāi)發(fā)的密碼子優(yōu)化軟件對(duì)R.ruberSD3的rhk基因進(jìn)行序列優(yōu)化，將序列優(yōu)化后的基因命名為rhks。該基因已將原基因中終止密碼子去掉，其5’端和3’端分別加上限制性酶切位點(diǎn)分別為BamHI（G/GATCC）和EcoRI（G/AATTC），然后由通用生物公司合成帶有限制性酶切位點(diǎn)的rhks基因。

1.3.2 構(gòu)建含重組質(zhì)粒pGM-T-rhks的E.coliTOP 10菌株

將rhks基因與pGM-T載體按pGM-T克隆試劑盒的操作步驟進(jìn)行16 ℃過(guò)夜酶連，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTOP 10感受態(tài)細(xì)胞：然后在LB固體平板篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和DNA序列鑒定。

1.3.3 構(gòu)建含重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhks的E.coli重組菌

將pGM-T-rhks重組質(zhì)粒和pGEX-4T-2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟回收酶切產(chǎn)物，在16 ℃條件下進(jìn)行過(guò)夜酶連，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行菌落PCR和DNA序列鑒定。

1.3.4 組氨酸激酶基因的表達(dá)及其表達(dá)條件優(yōu)化

將含重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhks（重組質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1）的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培養(yǎng)基，培養(yǎng)到菌液OD600nm為0.6～0.8，取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)的對(duì)照樣品，剩余菌液加1 mmol/L IPTG溶液誘導(dǎo)，在37 ℃、180 r/min條件下再誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，分別將1 mL IPTG誘導(dǎo)的菌液和1 mL未誘導(dǎo)菌液在12 000×g離心2 min，去掉上清液，加150 μL 1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）充分重懸，分別取10 μL未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)的重懸液，各加入10 μL的1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，短暫離心后沸水浴10 min，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhksFig.1 Map of recombinant plasmid pGEX-4T-2-rhks

為了達(dá)到最大的可溶性表達(dá)，對(duì)含有pGEX-4T-rhks重組質(zhì)粒的E.coliBL21（DE3）重組菌株進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，分別設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度（16、20、25 ℃）、誘導(dǎo)時(shí)間（4、6、8 h）和IPTG濃度（0.1、0.5、1 mmol/L）。

1.3.5 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的純化

根據(jù)上述最優(yōu)培養(yǎng)條件培養(yǎng)重組菌，將菌液在5 000 r/min離心10 min，然后將菌體放入-40 ℃冰箱冰凍1 h以上，再加入PBS（pH 7.4）破碎緩沖液（含5 mmol/L二硫蘇糖醇、0.1% TritonX-100和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）。將菌懸液進(jìn)行超聲破碎，其中功率為60 W，破碎時(shí)間為3 s，間隙5 s，破碎總時(shí)間為15 min。破碎液4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液。將破碎裂解液上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾后上柱，加入預(yù)冷的1×PBS清洗層析柱，每次加入2 mL，共10 mL，然后加入預(yù)冷的Tris-HCl溶液（pH 8.0）洗滌層析柱，每次加入2 mL，共10 mL。加入15 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫液（pH 8.0）洗脫融合蛋白。每次1 mL，共10 mL，收集洗脫液，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將含有蛋白質(zhì)的洗脫液合并，得到純化的組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK。在提純過(guò)程中，分別取15 μL破碎裂解液、破碎裂解液上清液、破碎裂解液沉淀、最后收集的洗滌液和含有蛋白質(zhì)的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.6 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

將純化的重組蛋白GST-RHK進(jìn)行SDS-PAGE，切下目的膠條。加入終濃度10 mmol/L二硫蘇糖醇還原蛋白質(zhì)，接著加入終濃度55 mmol/L碘乙酰胺，最后加入1 μg的Trypsin酶，過(guò)夜酶解8～16 h。酶解產(chǎn)生的多肽用C18柱除鹽，已經(jīng)除鹽的多肽抽干后用15 μL Loading Buffer（含0.1%甲酸和3%乙腈）溶解多肽。多肽上LC-MS/MS儀器進(jìn)行分析，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

1.3.7 酶活性的測(cè)定

采用Kinase-GloTMLuminescent Kinase Kit檢測(cè)樣品的激酶活性。取10 μL樣品與5 μL ATP溶液混合，使反應(yīng)體系中ATP終濃度為5 μmol/L，25 ℃反應(yīng)10 min，在避光條件下各加入50 μL發(fā)光試劑，25 ℃反應(yīng)10 min，在GloMax熒光測(cè)量?jī)x上測(cè)定熒光值。本研究規(guī)定在25 ℃和pH 7.5條件下1 min內(nèi)酶催化消耗1 nmol ATP為1 U。

1.3.8 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

取10 μL融合蛋白GST-RHK分別與40 μL濃度為2、4、6、8、10 μmol/L和12.5 μmol/L的ATP溶液混合，使ATP終濃度分別為 1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 μmol/L和10 μmol/L，25 ℃反應(yīng)10 min，然后在避光條件下加入50 μL熒光試劑，25 ℃反應(yīng)10 min，在GloMax熒光測(cè)量?jī)x上測(cè)量熒光值。

1.3.9 pNV18-rhkE強(qiáng)化質(zhì)粒的構(gòu)建

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取R.ruberSD3基因組，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用TOLOBIO生物公司的2×P6 High-Fidelity Premix，rhkE的正向引物為5’-ATGGATCCGTGAGCCGCGTACGGCC-3’（BamHI），反向引物為5’-CGAAAGCTTTCACTCCA CCGGCATCCGC-3’（Hind III）。PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min；隨后94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，此3 步驟循環(huán)30 次，72 ℃再延伸5 min，于4 ℃低溫保存。采用天根DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟進(jìn)行切膠回收純化PCR產(chǎn)物，于-40 ℃保存。

將上述PCR產(chǎn)物與pNV18質(zhì)粒用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，用DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟回收酶切產(chǎn)物，然后過(guò)夜酶連，之后轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，隨后進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序鑒定，陽(yáng)性克隆中含有pNV18-rhkE強(qiáng)化質(zhì)粒。

1.3.10 pNV18-rhkD敲減質(zhì)粒的構(gòu)建

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取R.ruberSD3基因組，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用TOLOBIO生物公司的2×P6 High-Fidelity Premix，rhkD的正向引物為5’-CGAAAGCTTGTGAGCCGCGTACGGCC-3’（Hind III），反向引物為5’-ATGGATCCTCACTCCACCGGCATCCGC-3’（BamHI）[15]。PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min；隨后94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，此3 步驟循環(huán)30 次，72 ℃再延伸5 min，于4 ℃低溫保存。采用天根的DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟進(jìn)行切膠回收純化PCR產(chǎn)物，并-40 ℃保存。

同樣按1.3.9節(jié)方法構(gòu)建pNV18-rhkD敲減質(zhì)粒。

1.3.11 基因增強(qiáng)株sdrhkE和基因敲減株sdrhkD的制備

培養(yǎng)含有pNV18-rhkE、pNV18-rhkD重組質(zhì)粒的E.coliTOP10菌株，提取兩種質(zhì)粒。按照所示方法制備R.ruberSD3感受態(tài)細(xì)胞[16]，將pNV18-rhkE、pNV18-rhkD重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)到R.ruberSD3感受態(tài)細(xì)胞，其中電壓為1.5 kV，電擊時(shí)間為5.6 ms，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，隨后進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序鑒定，于是分別獲得sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkE基因敲減株。

1.3.12 sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株中組氨酸激酶基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）分析

sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株中總RNA的提取按照Kuang Sufang等[17]的方法。

real-time PCR分析組氨酸激酶基因表達(dá)情況的正向引物序列為CAACCTCGTCACCAACGC，反向引物序列為GATAGAAACGCTCGAAGACCC。16S rRNA基因作為內(nèi)參基因，其正向引物序列為ACTGGGCGTAAAGAGYTCGT，反向引物序列為CGCATTTCACCGCTACAC。反應(yīng)體系含有2×SYBR Green Mix（5 μL），上游引物和下游引物均為0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL，然后用雙蒸水補(bǔ)至10 μL。其程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性5 min；隨后95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸25 s，此3 步驟共40 個(gè)循環(huán)[17]。real-time PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行分析[18]。

1.3.13 sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株在有機(jī)溶劑脅迫下的生長(zhǎng)情況

分別制備野生型R.ruberSD3、sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株的種子液，將種子液1 mL分別轉(zhuǎn)移至100 mL LB液體培養(yǎng)基，再分別加入終質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的苯酚、0.1%（V/V）甲苯、0.1%（V/V）氯苯、0.1%（V/V）異辛烷，于35 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、60 h和72 h測(cè)量培養(yǎng)菌株的OD600nm值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhks的構(gòu)建

按1.3.4節(jié)步驟進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，然后將回收產(chǎn)物進(jìn)行酶連，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽(yáng)性克隆后進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，條帶大小符合預(yù)期。送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期基因序列相符，說(shuō)明表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhks構(gòu)建成功。

圖2 含有重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-rhks的E.coliBL21（DE3）菌落PCR鑒定Fig.2 PCR identification of E.coli BL21(DE3) colonies containing recombinant plasmid pGEX-4T-2-rhks

2.2 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK表達(dá)條件的優(yōu)化

膜蛋白與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊和細(xì)胞形態(tài)的維持等多種細(xì)胞功能有關(guān)。盡管它們?cè)诩?xì)胞中發(fā)揮起重要作用，但是膜蛋白表達(dá)仍然是蛋白質(zhì)表達(dá)中的難點(diǎn)。為使膜蛋白組氨酸激酶能夠有效表達(dá)，本研究嘗試了不同的質(zhì)粒，最后確定pGEX-4T-2作為重組表達(dá)質(zhì)粒。pGEX-4T-2表達(dá)載體含有GST標(biāo)簽，通常此標(biāo)簽?zāi)軌蛟鰪?qiáng)蛋白可溶性和提高蛋白表達(dá)量，可在不同的宿主中表達(dá)，純化條件溫和，并且能保留了蛋白的生物活性[19]。如圖3所示，組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK獲得成功表達(dá)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)為了獲得更大的表達(dá)量，還進(jìn)行了誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。SDS-PAGE結(jié)果表明在OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入1 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)8 h表達(dá)量最大（圖3）。錢(qián)英子等[20]用pET-28a作為載體表達(dá)了變形鏈球菌組氨酸蛋白激酶VicK，其中在最優(yōu)的表達(dá)條件為IPTG終濃度0.3 mmol/L，18 ℃誘導(dǎo)15 h。這說(shuō)明低溫可能更適合組氨酸激酶的表達(dá)。

圖3 pGEX-4T-2-rhks表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for optimization of expression conditions of pGEX-4T-2-rhks

2.3 GST-RHK蛋白的純化

分別取全蛋白、菌株裂解液上清液、菌株裂解液沉淀、最后收集的洗滌液、洗脫液與1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液按1∶1的比例混勻，沸水浴10 min，然后取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，如圖4所示，在上清液中表達(dá)較多，沉淀中表達(dá)較少，說(shuō)明大多數(shù)融合蛋白以可溶性的形式表達(dá)，因此將細(xì)胞裂解液的上清液用于親和層析純化。圖4泳道4表明在純化過(guò)程中已將雜蛋白洗滌干凈。泳道5～8洗脫液中，第7和第8泳道中對(duì)應(yīng)的洗脫液中有更多的目的蛋白。經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化，獲得電泳純的GST-RHK融合蛋白，其中純化倍數(shù)為3.1，得率為19.5%（表1）。

圖4 GST-RHK蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis for purification of GST-RHK protein

表1 GST-RHK蛋白質(zhì)的純化結(jié)果Table 1 Summary of the purification process of GST-RHK protein

2.4 GST-RHK融合蛋白的LC-MS/MS分析

當(dāng)設(shè)置可信度conf≥95%、Unique peptides≥1時(shí)，GST-RHK融合蛋白LC-MS/MS產(chǎn)生的二級(jí)譜圖數(shù)為1 326，解析的二級(jí)譜圖數(shù)為9，蛋白質(zhì)覆蓋率為25.81%。序列顯示為綠色其可信度在95%以上（圖5）。結(jié)果表明純化得到的蛋白為目的蛋白。

圖5 經(jīng)質(zhì)譜分析獲得的肽段與GST-RHK蛋白的覆蓋度Fig.5 Coverage of peptide fragments obtained by LC-MS/MS in the sequence of GST-RHK

2.5 GST-RHK融合蛋白的分子質(zhì)量和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)GST-RHK融合蛋白的SDS-PAGE圖譜，計(jì)算得到GST-RHK融合蛋白的分子質(zhì)量為72.75 kDa，與理論值72.17 kDa基本一致。采用雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算得到GST-RHK融合蛋白的Km和Vmax分別為20.92 μmol/L和0.17 μmol/（L·min）（圖6），進(jìn)一步計(jì)算得到Kcat值為1.4 min-1。Tawa等[21]測(cè)得E.coli中組氨酸激酶CheA的Kcat值約為0.028 s-1，說(shuō)明這兩種激酶的催化能力相當(dāng)。

圖6 GST-RHK融合蛋白的Km和Vmax值測(cè)定Fig.6 Determination of Km and Vmax of GST-RHK fusion protein

2.6 sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株中組氨酸激酶基因的表達(dá)情況

pNV18質(zhì)粒是E.coli和紅球菌之間的穿梭質(zhì)粒，能用于紅球菌中表達(dá)蛋白質(zhì)[22-23]。將組氨酸激酶基因正向連接到pNV18質(zhì)粒上建構(gòu)組氨酸激酶基因強(qiáng)化質(zhì)粒，然后將組氨酸激酶基因部分反向連接到pNV18質(zhì)粒上建構(gòu)組氨酸激酶基因敲減質(zhì)粒，然后采用real-time PCR進(jìn)一步鑒定是否成功構(gòu)建sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株，并分析組氨酸激酶基因的表達(dá)變化情況。如圖7所示，與野生型R.ruber相比，sdrhkE基因增強(qiáng)株中組氨酸激酶基因的表達(dá)擴(kuò)大到原來(lái)的46.57 倍。sdrhkD基因敲減株組氨酸激酶基因的表達(dá)減少到原來(lái)的5%。說(shuō)明增強(qiáng)質(zhì)粒中的組氨酸激酶基因表達(dá)后有效提高了R.ruber中總的組氨酸激酶mRNA含量，然而敲減質(zhì)粒產(chǎn)生的反義RNA能夠和R.ruber基因組產(chǎn)生的組氨酸激酶mRNA結(jié)合，從而能夠降低組氨酸激酶基因的表達(dá)。

圖7 R.ruber SD3野生株、增強(qiáng)株和敲減株中組氨酸激酶基因轉(zhuǎn)錄變化情況Fig.7 Transcriptional change of histidine kinase gene in wild-type,sdrhkE enhancement, and sdrhkD knockdown strains

2.7 有機(jī)溶劑脅迫下sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株的生長(zhǎng)情況

為研究組氨酸激酶基因?qū).ruberSD3有機(jī)溶劑耐受性的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)定野生型R.ruber、sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株在不同有機(jī)溶劑存在情況下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。如圖8所示，在苯酚、甲苯、氯苯、異辛烷4 種有機(jī)溶劑脅迫下，在前24 h內(nèi)，野生型R.ruber、sdrhkE基因增強(qiáng)株、sdrhkD基因敲減株生長(zhǎng)情況區(qū)別較小，在24～72 h，上述3 種菌株生長(zhǎng)情況呈現(xiàn)差異。其中sdrhkD基因敲減株的生長(zhǎng)情況都優(yōu)于野生型R.ruberSD3，sdrhkE基因增強(qiáng)株的生長(zhǎng)情況都低于野生型R.ruberSD3。這些結(jié)果表明組氨酸基因表達(dá)下調(diào)使菌株有機(jī)溶劑耐受性增加，然而組氨酸基因表達(dá)上調(diào)使菌株有機(jī)溶劑耐受性下降。在前期研究中發(fā)現(xiàn)R.ruberSD3在甲苯和苯酚處理下，組氨酸激酶基因均下調(diào)，這說(shuō)明R.ruberSD3的有機(jī)溶劑耐受性和組氨酸激酶基因負(fù)相關(guān)，和R.ruberSD3、sdrhkE基因增強(qiáng)株和sdrhkD基因敲減株的生長(zhǎng)情況一致。

圖8 不同有機(jī)溶劑處理下野生株、敲減株和增強(qiáng)株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.8 Growth curves of wild-type, sdrhkD knockdown and sdrhkE enhancement strains cultured in the presence of different organic solvents

3 討 論

紅球菌屬于專(zhuān)性好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于其具有代謝多樣性和功能的多樣性，能夠廣泛用于環(huán)境修復(fù)、生物轉(zhuǎn)化、生物合成等方面。目前對(duì)紅球菌屬在分類(lèi)[24]、組學(xué)[17,25]、遺傳改造[26]及其應(yīng)用等方面開(kāi)展了許多研究，然而對(duì)于紅球菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有待于進(jìn)一步深入研究。對(duì)于生物制備和生物修復(fù)過(guò)程，紅球菌屬微生物都會(huì)接觸化學(xué)物質(zhì)，其中一些化學(xué)物質(zhì)對(duì)微生物具有一定毒性，影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，因此紅球菌如何感知這些化學(xué)物質(zhì)信號(hào)并作出響應(yīng)是紅球菌研究中一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。

組氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑廣泛存在各種細(xì)菌中，它作為雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的一部分，參與調(diào)控細(xì)菌的各種生命活動(dòng)，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取、代謝作用、適應(yīng)環(huán)境的變化、孢子和生物膜形成、毒性等[27]。在適應(yīng)環(huán)境的變化中往往涉及滲透壓、光、趨藥性、溫度、氧等因素。例如E.coli的EnvZ-OmpR雙組分系統(tǒng)中EnvZ是一種組氨酸激酶，它感受到外界滲透壓的變化進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓[28]。Deng Chaoying等[29]發(fā)現(xiàn)在野油菜黃單胞菌組氨酸激酶VgrS與該菌的滲透壓抗性相關(guān)。另外一種與細(xì)菌趨化系統(tǒng)密切相關(guān)是一種組氨酸激酶CheA，其中趨化受體MCP感受外界刺激，并通過(guò)組氨酸激酶CheA和反應(yīng)調(diào)節(jié)器CheY將信號(hào)傳遞給鞭毛馬達(dá)，從而使得細(xì)菌趨向或遠(yuǎn)離化學(xué)物質(zhì)[30]。迄今為止鮮見(jiàn)有R.ruber中有關(guān)組氨酸激酶的研究報(bào)道。本研究從R.ruberSD3中克隆了組氨酸激酶基因，并成功地進(jìn)行了融合表達(dá)。融合蛋白與E.coli中組氨酸激酶CheA的激酶活性相當(dāng)。此外，本研究通過(guò)pNV18質(zhì)粒增強(qiáng)或降低了組氨酸激酶的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)組氨酸基因的表達(dá)變化與R.ruber的有機(jī)溶劑耐受性相關(guān)，然而尚未發(fā)現(xiàn)其他菌株存在該現(xiàn)象。目前還未找到組氨酸激酶的底物，因此組氨酸激酶如何對(duì)R.ruber有機(jī)溶劑耐受性產(chǎn)生影響的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究從R.ruberSD3發(fā)現(xiàn)了一種新的組氨酸激酶，證實(shí)了其激酶活性，并且它與R.ruberSD3的有機(jī)溶劑耐受性存在關(guān)聯(lián)，通過(guò)強(qiáng)化或敲減該組氨酸激酶可以改變R.ruberSD3的有機(jī)溶劑耐受性，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示組氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與R.ruberSD3有機(jī)溶劑耐受性提供研究依據(jù)，也為R.ruberSD3的遺傳改造提供了新的靶標(biāo)。