陳躬浩，付漢清，童桂香，韋信賢，王乃萱，林 茂

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門 361021；2.廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021；4.廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)，為革蘭氏陰性短桿菌，無莢膜和芽孢，是廣泛存在于海水中的一種條件致病菌。它不僅對(duì)于魚[1]、蝦[2]、貝[3]有致病性，同時(shí)對(duì)于人類也有一定的致病性，能夠引起腹瀉和食物中毒[4]。而對(duì)于溶藻弧菌的防治，養(yǎng)殖戶通常使用傳統(tǒng)的抗生素或者消毒劑，但抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌產(chǎn)生耐藥性，不僅影響用藥效果，同時(shí)耐藥菌還會(huì)隨著食物鏈的傳播感染人類，危害人類生命安全[5]。另一方面，隨著人們生活水平的不斷提高，大眾在食品的選擇上對(duì)綠色理念越發(fā)的重視。因此，亟需尋找一種新的既環(huán)保、友好又能有效控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物溶藻弧菌病的方法。

噬菌體作為一種微生物病毒，能夠侵染并裂解細(xì)菌、螺旋體、放線菌等。早在20世紀(jì)初期，噬菌體就被認(rèn)為有替代抗生素的巨大潛力[6-7]。相比于抗生素的高效，有關(guān)噬菌體療法的研究始終落后于抗生素的研究[8]。但隨著近年來細(xì)菌耐藥性問題趨向嚴(yán)峻，研究者重新將目光投向噬菌體，期望能夠開發(fā)出高效的噬菌體制劑。2009年，Wright等[9]首次在感染多重耐藥銅綠假單胞菌的慢性耳炎患者身上使用噬菌體治療方案，經(jīng)過治療后，患者的癥狀均得到改善，并且沒有產(chǎn)生毒副作用。Cao等[10]從臨床患者體內(nèi)分離得到一株多重耐藥性肺炎克雷伯菌，并用其感染小鼠，隨后使用噬菌體進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未使用噬菌體治療的小鼠在24 h內(nèi)全部死亡，而使用噬菌體治療的小鼠存活率則高出許多。此外，噬菌體在弧菌病防治方面的研究也取得了一些成果。Stalin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對(duì)蝦幼體感染哈維氏弧菌后，使用噬菌體能夠有效提高幼體的存活率。胡蝶等[12]將副溶血弧菌制成噬菌體微膠囊，并拌于飼料中投喂方斑東風(fēng)螺和南美白對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)生物的腸道和水體中的宿主菌都有大幅度的減少。于鴿[13]從自然水體中分離得到一株溶藻弧菌噬菌體，并將其用于南美白對(duì)蝦的攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明108pfu/mL的噬菌體溶液的保護(hù)率達(dá)88.20%。Sasikala等[14]分離得到的一株溶藻弧菌噬菌體能夠有效抑制溶藻弧菌的生物膜形成，并且在數(shù)個(gè)小時(shí)后還對(duì)溶藻弧菌有殺滅作用。

本文以溶藻弧菌V039為宿主，分離得到一株新型溶藻弧菌噬菌體φV039C，并對(duì)其進(jìn)行了電鏡形態(tài)觀察、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線等生物學(xué)特性的研究，以及全基因測(cè)序、序列分析和功能預(yù)測(cè)，以期更好地了解其裂解機(jī)制，為溶藻弧菌的噬菌體治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

宿主菌：病原菌(溶藻弧菌V039)從福建漳浦的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中分離得到，并由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

主要試劑和儀器：LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、瓊脂粉、SM病毒提取緩沖液均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；DL15000、DL2000、DNase I、RNase A 和限制性內(nèi)切酶(EcoR I、EcoR V、BamH I、Hind Ⅲ)均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；TIANamp病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；透射電子顯微鏡(TEM)為美國(guó)FEI公司制造產(chǎn)品；離心機(jī)(Eppendorf 5427R)為德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離

將取自福建漳浦各對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的水樣混合于潔凈的水桶中，再把培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的溶藻弧菌V039菌液倒入水樣中，混勻后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，以富集潛在噬菌體。之后，取5 mL富集液10 000 r/min 離心3 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾備用。吸取100 μL V039菌液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(添加體積分?jǐn)?shù)為2%的NaCl)上，吸取10 μL富集液分?jǐn)?shù)滴點(diǎn)于平板上，晾干后置于30 ℃培養(yǎng)，24 h后觀察點(diǎn)接處是否有空斑出現(xiàn)，如有空斑即作為溶藻弧菌V039的噬菌體進(jìn)行挖斑純化[15]。

1.2.2 噬菌體的純化與效價(jià)測(cè)定

采用雙層平板法進(jìn)行純化和效價(jià)測(cè)定。將噬菌體形成的空斑挖到SM緩沖液中，4 ℃過夜。用無菌生理鹽水將浸提液稀釋到合適梯度，吸取100 μL稀釋液和100 μL宿主菌液至6 mL半固體(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65%的瓊脂)LB肉湯(提前置于50 ℃保溫)中混合均勻，傾倒在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(添加體積分?jǐn)?shù)為2%的NaCl)上，凝固后30 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單個(gè)噬菌斑至SM緩沖液中4 ℃過夜，重復(fù)上述操作對(duì)分離得到的噬菌體純化3～5次。噬菌體效價(jià)(TT)指的是每毫升樣品中含有的具有侵染性的噬菌體顆粒數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)(plaque-forming unit)[16]。檢測(cè)樣品梯度稀釋后做雙層平板法培養(yǎng)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，取噬菌斑顆粒數(shù)在30～300 pfu之間為有效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)計(jì)算噬菌體密度。

1.2.3 噬菌體電鏡觀察

取噬菌體增殖液 20 μL(>1010pfu/mL)滴到銅網(wǎng)上吸附 30 min，用2%(體積分?jǐn)?shù))磷鎢酸(PTA)負(fù)染10 min，室溫干燥后，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝噬菌體的形態(tài)，同時(shí)測(cè)量頭部直徑等數(shù)據(jù)[17]。

1.2.4 噬菌體基因組的提取和酶切分析

取噬菌體增殖液(≥1010pfu/mL)至無菌EP管中，分別加入DNase I與RNase A于37 ℃反應(yīng)1 h，以去除噬菌體增殖液中游離的宿主菌 DNA/RNA，80 ℃處理15 min使酶失活。之后，利用TIANamp病毒基因組DNA/RNA 試劑盒提取噬菌體基因組。

酶切反應(yīng)體系為10 μL[18]。分別取噬菌體基因組8 μL 于6個(gè)無菌PCR管中，再分別加入1 μL的酶(DNase I、RNase A、EcoR I、EcoR V、BamH I、Hind III)以及1 μL的10×Loading Buffer，于37 ℃反應(yīng)1 h。將酶切產(chǎn)物置于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠中電泳(110 V) 24 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，指的是噬菌體在感染開始時(shí)噬菌體與宿主菌的比值。測(cè)定方法參考張文惠等[19]的實(shí)驗(yàn)方法，培養(yǎng)宿主菌液至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，按MOI值為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01各吸取50 μL的噬菌體液和宿主菌液到900 μL無菌LB肉湯中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng) 8 h，10 000 r/min離心2 min，用0.22 μm濾膜過濾，測(cè)定噬菌體效價(jià)。效價(jià)最高的感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.6 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參考王九儒等[20]的研究方法，按照感染復(fù)數(shù)為0.1的比例，混合噬菌體液和宿主菌液，宿主菌液濃度為1×108cfu/mL，總體積為1 mL，30 ℃孵育10 min，讓噬菌體充分吸附在宿主菌上，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，用 LB 肉湯洗滌2次去除未吸附的噬菌體，加入1 mL LB肉湯重懸。置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，并開始計(jì)時(shí)，分別在0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定噬菌體效價(jià)并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 噬菌體的全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

噬菌體φV039C的基因組利用第三代單分子測(cè)序平臺(tái)(PacBio SMRT)進(jìn)行全基因組測(cè)序分析。利用 GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)網(wǎng)站進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。使用在線 blastp 工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行注釋。使用軟件DNA Plotter繪制全基因組圈圖。用MEGA 7.0軟件，選擇N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亞基終止酶(ORF19)兩種蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 噬菌體形態(tài)特征

以溶藻弧菌V039為宿主，采用點(diǎn)斑法篩選得到噬菌體φV039C(見圖1a)，經(jīng)純化后得到的噬菌斑清晰，直徑在1 mm左右，呈現(xiàn)出透明、無暈圈的形態(tài)(見圖1b)。通過電鏡觀察(見圖1c)，該噬菌體的頭部結(jié)構(gòu)是正廿面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑(58.9±2.9)nm，尾長(zhǎng)(105.2±5.7)nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第九次報(bào)告的病毒分類系統(tǒng)[21]，噬菌體φV039C在分類上可能屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。

2.2 噬菌體基因組酶切結(jié)果

酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果(見圖2)顯示：噬菌體φV039C的基因組能被DNase I降解，但不能被RNase A降解，說明其基因組類型是DNA；電泳結(jié)果也表明其基因組上有EcoR V、Hind Ⅲ和EcoR I的酶切位點(diǎn)，但沒有BamH I酶切位點(diǎn)。因此，噬菌體φV039C基因組類型屬于dsDNA。

2.3 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)

按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)混合噬菌體和宿主菌液培養(yǎng)8 h之后，用雙層板測(cè)定各個(gè)MOI 的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表1)表明，當(dāng)噬菌體與宿主比值為0.1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，能夠達(dá)到3.34×1010pfu/mL，因此噬菌體φV039C的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。

表1 不同感染復(fù)數(shù)下噬菌體φV039C的效價(jià)Fig.1 The titer of phage φV039C withdifferent multiplicity of infection感染復(fù)數(shù)MOI初始含量Initial content噬菌體Phage/(pfu·mL-1)宿主菌Host/(cfu·mL-1)噬菌體終含量Terminal contentof phage/(pfu·mL-1)10001071044.90×1081001071054.80×108101071062.40×10911061063.10×10100.11051063.30×10100.011041068.10×1090.0011031061.70×1090.00011021062.40×108

2.4 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

由噬菌體φV039C的一步生長(zhǎng)曲線(見圖3)可得出，噬菌體與宿主菌混合培養(yǎng)20 min，效價(jià)無明顯變化，因此噬菌體φV039C的潛伏期為20 min；20—30 min噬菌體效價(jià)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；30 min后噬菌體效價(jià)穩(wěn)定。由此得，噬菌體爆發(fā)期為培養(yǎng)后10 min。噬菌體裂解量=爆發(fā)期末期噬菌體密度/初始受感染宿主菌密度=(5.06×107)/(3.10×105)=163 pfu/cell。

2.5 噬菌體全基因組分析

第三代單分子測(cè)序平臺(tái)測(cè)序結(jié)果表明，噬菌體φV039C的基因組(GenBank登錄號(hào)MN956515)為環(huán)形雙鏈DNA，全長(zhǎng)為43 405 bp，G+C含量為42.95%(見圖4)。共注釋得到77個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)。其中，已知功能閱讀框有17個(gè)，假想蛋白有20個(gè)，未注釋出的閱讀框有40個(gè)。核酸序列長(zhǎng)度在213～2436 bp，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度在71～812。所有ORF共含有40 870 bp的堿基，基因組的基因密度為94.20%。

用NCBI網(wǎng)站的blastn(megablast)程序進(jìn)行噬菌體φV039C的基因序列比對(duì)，在得到的同源序列中，噬菌體φV039C與溶藻弧菌噬菌體NF(MN812722)、副溶血弧菌噬菌體Seahorse(MN512538)的比對(duì)覆蓋率最高，同為11%，一致性分別為92.2%和93.3%，即從基因組來看，噬菌體φV039C與這二者最為接近。二者在分類上均屬于有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體φV039C與溶藻弧菌噬菌體PVA1(KJ395778)的覆蓋率次之，為2%，其余檢索結(jié)果覆蓋率僅為1%。使用Mauve軟件對(duì)3個(gè)基因組進(jìn)行共線性比對(duì)分析(見圖5)，發(fā)現(xiàn)三者相互之間存在5個(gè)同源片段，但位置、順序不同，相似性也不高。

由全基因組的比對(duì)結(jié)果可見，噬菌體φV039C與現(xiàn)有NCBI登錄的其他噬菌體基因組相似區(qū)的比例很低，是一株新型的溶藻弧菌噬菌體。

2.6 噬菌體φV039C功能性O(shè)RF的分析

對(duì)噬菌體φV039C的基因組進(jìn)行ORF注釋，共注釋出74個(gè)ORF(見表2)。

表2 噬菌體φV039C的開放閱讀框注釋表

表2中的ORF1(重組酶)、ORF3(單鏈DNA結(jié)合蛋白)、ORF49(連接內(nèi)脫氧核糖核酸酶)、ORF57(DNA結(jié)合蛋白)、ORF58(轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)、ORF65(DNA螺旋酶)、ORF66(DNA結(jié)合蛋白)與噬菌體DNA復(fù)制有關(guān)；ORF6(N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶)為裂解酶，屬于噬菌體的裂解系統(tǒng)；ORF25(孔道蛋白)、ORF28(次要衣殼蛋白)、ORF29(主要衣殼蛋白)、ORF39(尾部裝配子)等屬于噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白。

2.7 噬菌體φV039C比較基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為探究噬菌體φV039C與其他噬菌體的進(jìn)化關(guān)系，選擇N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亞基終止酶(ORF19)兩種蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。從基于N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，φV039C與副溶血弧菌噬菌體Seahorse、溶藻弧菌噬菌體NF有著較近的親緣關(guān)系(見圖6)，這與全基因組的blast結(jié)果相近。而從基于大亞基終止酶構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，噬菌體φV039C與燦爛弧菌噬菌體1.144.0._10N.286.45.B3在同一分支上(見圖7)，后者在分類上也同樣屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。綜上所述，噬菌體φV039C在分類上應(yīng)歸屬有尾噬菌體目長(zhǎng)尾噬菌體科。

3 討論

在抗生素廣泛使用的今天，細(xì)菌耐藥性已然成為21世紀(jì)人類健康最大的威脅之一。而噬菌體在替代抗生素進(jìn)行細(xì)菌性疾病的治療方面有很大的應(yīng)用潛力。目前文獻(xiàn)報(bào)道的噬菌體大部分屬于有尾噬菌體目，其最大特點(diǎn)就是有與宿主識(shí)別和核酸注射有關(guān)的尾部[22]。而有尾噬菌體目包括短尾噬菌體科(Podoviridae)、肌尾噬菌體科(Myohoviridae)和長(zhǎng)尾噬菌體科。Lin等[23]和張建城[24]的研究中所分離得到的溶藻弧菌噬菌體屬于短尾噬菌體科；付漢清等[25]和歐陽(yáng)敏等[26]分離得到的溶藻弧菌噬菌體屬于肌尾噬菌體科；本研究分離得到的溶藻弧菌噬菌體 φV039C在分類上應(yīng)屬于長(zhǎng)尾噬菌體科，其擁有長(zhǎng)且靈活的尾部。溶藻弧菌的噬菌體尾部形態(tài)多樣，對(duì)噬菌體的吸附與侵染具有重要作用，同時(shí)也是分類上非常重要的判斷依據(jù)。

噬菌體φV039C的基因組與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的基因組相似區(qū)覆蓋率較低，是一株完全新型的噬菌體。在φV039C的基因組注釋出的74個(gè)ORF中，有20個(gè)是已知功能的ORF(占比27%)，其余為未知功能的假想蛋白。而據(jù)于浩[27]、沈嬋娟[28]、江莉莎等[29]、韋德源等[30]的報(bào)道，其研究對(duì)象——根瘤菌、嗜水氣單胞菌、分歧桿菌、大腸桿菌的噬菌體基因組中已知功能的ORF占比分別為18%、25%、34%、44%，這說明大部分噬菌體還存在許多未知功能的基因。

大多數(shù)烈性噬菌體的遺傳物質(zhì)中都有與編碼復(fù)制相關(guān)的酶的區(qū)域[31]。同樣，噬菌體φV039C已知功能ORF中也有多個(gè)與DNA復(fù)制調(diào)控、核酸代謝有關(guān)的ORF(ORF1、ORF49、ORF57、ORF58、ORF65等)，這些蛋白幫助其遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞后利用宿主的酶系統(tǒng)進(jìn)行自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制和蛋白的表達(dá)。其中，ORF49(交叉連接內(nèi)脫氧核糖核酸酶)能夠水解宿主細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸，以便為噬菌體合成DNA提供脫氧核糖核苷酸[32]。

噬菌體的基因組有多種類型，分別為ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA[22]。本研究中噬菌體φV039C基因組類型屬于dsDNA，而dsDNA噬菌體組裝的重要步驟就是將DNA緊緊包裹在衣殼中[33]。這一過程需要大亞基終止酶、小亞基終止酶和通道蛋白組合成一個(gè)“DNA包裝機(jī)”來協(xié)助完成[34]。另外，通道蛋白還能夠幫助噬菌體在自身衣殼中形成通道，使其能夠更好地將自己的基因組注射到宿主細(xì)胞中[35]。噬菌體φV039C的ORF19和ORF25分別編碼大亞基終止酶和通道蛋白，但是未發(fā)現(xiàn)編碼小亞基終止酶的ORF。

噬菌體可用于分類的形態(tài)特征太少，同源基因也不多。裂解酶是噬菌體中比較常見的一類基因，在分類上具有重要的價(jià)值。裂解酶根據(jù)作用方式可以分為三種，分別是溶菌酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶[36]。高明明等[37]分離到的肺炎克雷伯菌噬菌體的裂解系統(tǒng)僅有一個(gè)相關(guān)基因ORF48(細(xì)胞內(nèi)溶素)，屬于溶菌酶。溶菌酶是常見的裂解酶，其作用方式是作用于細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖，增加其溶解性，使細(xì)胞由內(nèi)部破裂，釋放子代噬菌體[38]。本研究中噬菌體φV039C的裂解系統(tǒng)也僅有一個(gè)相關(guān)基因，即ORF6(N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶)，屬于酰胺酶，其作用方式是水解細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵，從而使宿主細(xì)胞破裂，釋放子代噬菌體。此外，噬菌體因其宿主特異性較高，在實(shí)際應(yīng)用中有較大的限制，而裂解酶的宿主特異性較小，因此越來越多的學(xué)者開始專注于噬菌體裂解酶的研究及裂解酶的克隆表達(dá)。

噬菌體φV039C的結(jié)構(gòu)蛋白中，ORF28和ORF29分別編碼次要衣殼蛋白和主要衣殼蛋白。衣殼蛋白作為噬菌體的外殼，能夠緊緊地包裹住噬菌體的遺傳物質(zhì)。因其編碼序列具有高度的保守性，所以也常用于噬菌體的分類[39]。ORF39(尾部裝配配子)和ORF40(卷尺測(cè)量蛋白)與尾部的裝配以及部分功能有關(guān)，卷尺測(cè)量蛋白能夠在噬菌體尾部伸縮時(shí)控制尾部的長(zhǎng)度[40]。

雖然噬菌體在自然界豐度極高(據(jù)估計(jì)超過1031個(gè))，但是目前NCBI Genome數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有9000余條噬菌體完整基因組，且沒有對(duì)應(yīng)宿主的基因組信息，因此噬菌體在基因組及其功能注釋的研究方面還存在很多未知領(lǐng)域。本文對(duì)分離得到的一株新型溶藻弧菌噬菌體φV039C進(jìn)行生物學(xué)特性和全基因組的研究，對(duì)探索噬菌體未知領(lǐng)域，以及進(jìn)一步將噬菌體投入到實(shí)際應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。