CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其在腫瘤研究中的進展*

韓云蕾，郄蓓蓓,2，何艷潔，金 兵

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都市石室天府中學(xué) 生物教研組(成都 610041)；3.唐山學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系(唐山 063000)

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅中國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]顯示，惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.91%，2015年惡性腫瘤發(fā)病392.9萬人，死亡233.8萬人。隨著多重基因分型和高通量基因組分析等測序技術(shù)的迅猛發(fā)展[2-3]，大多數(shù)癌癥基因組的遺傳變異已在結(jié)構(gòu)上得到鑒定，但由于腫瘤的遺傳異質(zhì)性特點，篩選和鑒定新的腫瘤驅(qū)動突變和治療靶點，仍是一項艱巨工作。2013年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease9，Cas9)被成功用于哺乳動物細胞基因編輯[4]，其后被廣泛應(yīng)用于癌癥研究，通過特定基因的編輯了解該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的最新特點及近年來在腫瘤研究中的應(yīng)用進展方面作一綜述。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的特點

1.1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)基本原理

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR)于1987年在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[5]。根據(jù)核酸內(nèi)切酶的識別及切割機制的不同，CRISPR系統(tǒng)分成5型，共16個亞型，其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)依賴于單個Cas蛋白來靶向一個確定的DNA序列，因此展現(xiàn)出良好的基因編輯工具特性[6]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)首先將crRNA與tracrRNA連接成為sgRNA(single guide RNA)并優(yōu)化sgRNA結(jié)構(gòu)，從而簡化系統(tǒng)并提高Cas9與目標(biāo)DNA的結(jié)合能力[7]?；撔枣溓蚓鶦as9(SpCas9)在與sgRNA結(jié)合和激活后，通過sgRNA 5′端crRNA對目標(biāo)DNA上核苷酸系列為NGG的候選識別位點毗鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM)前20個核苷酸系列進行識別定位，引導(dǎo)SpCas9蛋白特應(yīng)性結(jié)合并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，造成特定位點上DNA雙鏈損傷(double strand break,DSB)[7]。

與通過調(diào)整蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域或氨基酸模塊來識別不同DNA序列的ZFN或TALEN基因編輯技術(shù)相比[8]，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過sgRNA進行定位，對不同位置的識別僅需要調(diào)整sgRNA上前20個堿基，可降低哺乳動物基因編輯的工具構(gòu)建成本和時間；同時CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)核酸內(nèi)切功能(Cas9)與定位功能(sgRNA)相互獨立的特征也與上述兩種基因編輯技術(shù)不同，只需同時在細胞內(nèi)表達Cas9蛋白和多條sgRNA，即可在同一細胞中同時進行多個位點的基因編輯，明顯增加編輯效率和研究范圍。此外，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)識別的PAM序列在哺乳動物基因組中廣泛存在，因此可編輯的位點也明顯增加。

1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基因編輯功能

基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基本特點，通過進一步對Cas9蛋白、sgRNA或編輯體系進行特定的改良，可使CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)完成多種不同基因的編輯。例如，基于CRISPR/Cas9對DNA造成的DSB的基本功能，以及哺乳動物的DNA損傷修復(fù)機制，就可實現(xiàn)對目標(biāo)細胞的基因突變甚至染色體重組編輯。靶細胞對DSB有兩種不同的修復(fù)機制。NHEJ是一種容易出錯的修復(fù)機制，常常導(dǎo)致插入或刪除，這些刪除可導(dǎo)致目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變、過早終止密碼子和/或無義突變，從而導(dǎo)致基因功能喪失[9]。而同源重組修復(fù)是利用DNA模板進行同源重組來重建斷裂的DNA。如果將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與預(yù)先設(shè)計的DNA同源重組模板同時轉(zhuǎn)移到靶細胞中，則可通過這種機制來引入預(yù)先設(shè)計的突變[10]。此外，在同一條染色體上引入兩個DSB，可誘導(dǎo)染色體大片段缺失，而在不同染色體上引入DSB，則可導(dǎo)致染色體重排[11]。

除了利用野生型Cas9進行定點的DNA切割外，利用修飾后核酸酶活性缺陷型Cas9(dCas9)融合和引導(dǎo)不同的調(diào)控蛋白，也可實現(xiàn)包括基因表達干擾(CRISPRi)、激活(CRISPRa)及表觀遺傳調(diào)控在內(nèi)的多種不同形式的基因表達調(diào)控。在sgRNA的引導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄抑制因子融合蛋白dCas9-KRAB可被引導(dǎo)到目標(biāo)基因啟動子區(qū)域，通過直接抑制RNA聚合酶活性或修飾染色質(zhì)，有效抑制目標(biāo)基因的表達[12]。dCas9也可通過多種不同方式，參與激活目的基因。最早用于CRISPRa的是dCas9-VP64，通過在dCas9上融合1個VP64轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄激活[12]，在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展出轉(zhuǎn)錄激活能力更強的dCas9-VP64-p65-Rra(VPR)[13]。除了直接融合轉(zhuǎn)錄激活因子外，也可通過改造dCas9和/或sgRNA實現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子的招募。這一策略的代表有SunTag和SAM，前者通過在dCas9上融合多個重復(fù)GCN4肽段，招募連接VP64的GCN4特異性單鏈抗體實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活[14]；后者通過dCas9蛋白融合VP64轉(zhuǎn)錄激活蛋白，改造sgRNA使其可結(jié)合連接p65和HSF1轉(zhuǎn)錄激活因子的MS2蛋白，通過多種轉(zhuǎn)錄激活蛋白的協(xié)同作用，更好地模擬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活[15]。通過類似原理，dCas9與表觀遺傳調(diào)控蛋白的融合也可進行表觀遺傳調(diào)控。dCas9-DNMT3A或DNMT3A-DNMT3L融合蛋白，可選擇性提高目標(biāo)基因CpG區(qū)域甲基化水平，從而抑制基因表達[16]。相反，dCas9-TET1則可選擇性抑制目標(biāo)區(qū)域甲基化水平[17]。此外，dCas9-p300還可通過調(diào)控目標(biāo)染色體區(qū)域組蛋白乙?；?，增加基因組相應(yīng)區(qū)域的可及性[18]。

盡管傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可通過HDR引入定向突變，但額外引入DNA模板誘導(dǎo)HDR靶向效率較低。利用保留DNA單鏈核酸內(nèi)切酶活性的Cas9-D10Anickase與堿基編輯因子的融合蛋白，可實現(xiàn)直接在DNA特定位置中引入單個堿基替換，而不需要外源DNA模板，這一技術(shù)被稱為堿基編輯(baseediting，BE)，分為胞嘧啶堿基編輯(CBE)和腺嘌呤堿基編輯(ABE)，通過DNA目的鏈上對特定堿基的脫氨基作用，互補鏈上的單鏈損傷修復(fù)過程，分別實現(xiàn)C:G替換為T:A以及A:T替換為G:C[19-20]。除此以外，另一種被稱為Prime editing的新型工具進一步拓展了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。該工具采用一種3′端增加了特定RNA模板的sgRNA(prime editing sgRNA, pegRNA)，融合了逆轉(zhuǎn)錄酶的Cas9 nickase，將預(yù)先設(shè)計的突變通過RNA模板逆轉(zhuǎn)錄整合到目標(biāo)基因位置，因此，理論上可引入所有類型的基因突變，包括插入、缺失和點突變。研究[21]顯示，Prime Editing除了順利完成各種堿基替換外，還可引入長達44 bp的DNA插入以及80 bp的堿基刪除。Prime Editing完全成熟后，將成為一個非常強大的系統(tǒng)，可在常規(guī)基因編輯系統(tǒng)不可能的水平上，輕松完成基因編輯操作，對腫瘤研究等領(lǐng)域意義重大。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

腫瘤作為一種由累積的遺傳/表觀遺傳異常導(dǎo)致的疾病，對其遺傳特征的研究和突變基因功能的識別，對腫瘤疾病出現(xiàn)、發(fā)展的認(rèn)識及治療靶點的篩選有重要意義。CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)簡單、高效及多功能的特點，使其迅速成為實驗室常用的腫瘤遺傳研究工具之一，在多個領(lǐng)域推動腫瘤基礎(chǔ)研究。

2.1 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立腫瘤模型

腫瘤動物模型在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療等研究領(lǐng)域具有重要價值，但采用傳統(tǒng)的基因改造技術(shù)建立動物模型，如基因打靶和插入突變，通常需要消耗巨大的工作量和時間。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可直接通過受精卵注射Cas9 mRNA和sgRNA建立胚系突變的小鼠腫瘤模型。研究[22]報道，采用此技術(shù)同時靶向DNA甲基化酶Tet1和Tet2，在不到1個月的時間內(nèi)產(chǎn)生兩種基因雙等位基因突變的小鼠效率為80%。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動物腫瘤模型建立中，不僅可實現(xiàn)胚系突變，還可直接進行動物體細胞基因編輯，引入體細胞驅(qū)動突變，重現(xiàn)由少量乃至單克隆突變體細胞開始的腫瘤發(fā)生，模擬真實的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。在肝細胞癌小鼠腫瘤模型的建立中，常使用小鼠尾靜脈高壓注射將表達Cas9和靶向Pten、Trp53的sgRNA的質(zhì)粒直接遞送至小鼠肝臟[23]；在腦、肺、胰腺、結(jié)直腸、乳腺等其他器官的腫瘤模型中通過局部注射病毒載體、電穿孔等方式遞送Cas9和靶向特定基因的sgRNA；此外，還可通過體外改造和回輸?shù)姆绞浇⒀耗[瘤模型[24]。

條件性基因編輯動物模型可研究基因改變在時間和空間上對腫瘤生物學(xué)過程的影響，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合到這一動物模型，可有效研究腫瘤驅(qū)動基因之間在時間和空間上的相互作用。例如，在KrasLSL-G12D/+、Trp53flox/flox(KP)條件性敲除小鼠中，通過慢病毒在氣管內(nèi)載入Cas9、Cre以及靶向Nkx2.1和Pten的sgRNA，顯示引入Nkx2.1和Pten的突變小鼠肺腺癌發(fā)生時間早于KP突變小鼠，表明引入的突變在腫瘤驅(qū)動中的協(xié)同作用[25]；同樣也可將Cas9作為條件性表達基因首先敲入動物基因組的策略來進行類似研究，在KrasLSL-G12D/+、R26LSL-Tom、H11LSLCas9(KT、Cas9)小鼠模型中，通過逆行胰管注射在胰腺中載入Cre和靶向Lkb1的sgRNA，在2個月內(nèi)發(fā)展成胰腺腫瘤，并且與KT、Lkb1flox/flox條件性敲除小鼠表現(xiàn)出明顯不同的組織學(xué)特征[26]。

2.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進行腫瘤機制研究

腫瘤是一種遺傳性疾病，在基因編輯模型中識別驅(qū)動腫瘤進展和維持的基因，在腫瘤機制和治療研究中是非常重要的一步。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為這一領(lǐng)域的研究提供了一種便捷而有效的編輯工具。

除了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基因突變功能，采用類似腫瘤動物模型建立的策略，每次對少量可疑基因進行腫瘤機制研究外，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也可用于操縱多個基因，以探索人類惡性腫瘤的遺傳復(fù)雜性。在急性髓細胞白血病研究中，通過一對分別靶向RUNX1T1第1個內(nèi)含子(位于8號染色體)以及RUNX1第5個內(nèi)含子(位于21號染色體)的sgRNA，可以在1%～4%的細胞中誘導(dǎo)發(fā)生染色體重排，用于研究RUNX1T1-RUNX1融合基因在急性髓性白血病中的驅(qū)動機制[27]。髓系惡性腫瘤常由多個基因的改變驅(qū)動發(fā)生，在單個小鼠造血干細胞中修飾包括Tet2、Runx1、Dnmt3a、Ezh2、Nf1、Smc3、Trp53和Asxl1在內(nèi)的多達5個基因的不同組合，觀察小鼠髓系惡性腫瘤的發(fā)生，可重現(xiàn)和研究不同基因突變組合對腫瘤的誘導(dǎo)及其不同的病理特征[28]。

由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定位僅取決于sgRNA，因此，該技術(shù)可作為一種高效的腫瘤驅(qū)動和耐藥機制的篩選工具。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基因敲除能力(CRISPRko)，在表達Cas9細胞中進行低感染復(fù)數(shù)感染，使每個細胞理論上可攜帶一個獨特的sgRNA，通過細胞擴增和細胞sgRNA豐度檢測，篩選相關(guān)突變基因。目前，通過CRISPRko基因編輯技術(shù)已篩選出與肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、肝癌、直腸癌等多種腫瘤相關(guān)的不同腫瘤抑制基因[29]。在腫瘤研究中，非編碼RNA的表達及啟動子/增強子對基因的表達調(diào)控同樣重要。有研究[30]表明，CRISPRi基因編輯技術(shù)在細胞系中對超過16 000種lncRNA進行篩選，并鑒定出其中499種與細胞生長相關(guān)的lncRNA。對腫瘤相關(guān)基因CUL3的ORF附近700 kb范圍設(shè)計sgRNA進行CRISPRko篩選發(fā)現(xiàn)，對增強子區(qū)域的突變明顯影響細胞對藥物的耐受性[31]。CRISPRa基因編輯技術(shù)也可被用于與腫瘤耐藥性相關(guān)篩選，例如dCas9-VP64基因編輯技術(shù)被Braun等[32]用于在B淋巴瘤細胞篩選與已知或未知的與耐藥相關(guān)的DNA損傷修復(fù)基因。堿基編輯(BE)系統(tǒng)目前尚不能進行準(zhǔn)確的堿基替換，但可利用其在編輯窗口內(nèi)可誘導(dǎo)多個突變的能力來進行特定基因上的突變篩選。例如，Hess等[33]研究表明，利用dCas0-AID融合蛋白開發(fā)的CRISPR-X基因編輯技術(shù)，通過定制的sgRNA文庫靶向PSMB5基因的全外顯子范圍，篩選與硼替佐米治療相關(guān)的耐藥突變。

2.3 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療靶點

與篩選抑癌基因的思路一致，通過CRISPRko基因編輯技術(shù)篩選癌細胞生長所必需，但對正常細胞不必要的基因，可鑒定出毒性和/或副作用較小的有效治療靶點。通過該方法在5種急性髓性白血病(acute myelond leukemia,AML)細胞系中，鑒定出492中AML特異基因，其中許多基因可通過重新利用現(xiàn)有的抑制劑或進行新的小分子抑制劑的篩選而成為治療靶點[34]。

由于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中特定的腫瘤抑制或激活基因的活性異常，導(dǎo)致生長代謝中以前非必須基因可能在腫瘤細胞中成為必須基因。因此，基于合成致死概念，也可在特定驅(qū)動突變的腫瘤中篩選特異的藥物靶點。例如，在14種RAS突變或野生型AML細胞系中，通過CRISPRko系統(tǒng)篩選，發(fā)現(xiàn)包括PREX1在內(nèi)的與RAS突變相關(guān)的合成致死基因，顯示這些基因為新的藥物靶點可治療RAS突變型AML[35]。另一種篩選思路是通過在給予腫瘤藥物治療的條件下進行CRISPRko篩選，以鑒定與藥物有合成致死能力的基因靶點或具有該藥物耐藥性的突變類型。Szlachta等[36]利用該思路在患者來源的胰腺癌中篩選與MEK抑制劑具有協(xié)同效果的潛在靶點，在體外篩選中發(fā)現(xiàn)多個潛在的靶點基因和信號通路。另一項在給予阿匹莫德治療的淋巴瘤細胞中的CRISPRko篩選結(jié)果則顯示，與溶酶體途徑相關(guān)的基因突變，是增加腫瘤對該藥物耐藥性的重要原因[37]。此外，采用2個相關(guān)sgRNA進行聯(lián)合式CRISPR篩選的方案，不僅可解析成對基因敲除的遺傳相互作用，同時也可識別協(xié)同藥物靶點。Han等[38]基于超過20 000對sgRNA文庫，在AML細胞系中進行篩選發(fā)現(xiàn)，MLC1和BCL2L1在腫瘤生長中具有強相互作用，是潛在的聯(lián)合治療靶點。

免疫治療現(xiàn)在已經(jīng)成為重要的腫瘤治療手段，但只有少數(shù)基因被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞免疫逃避的內(nèi)在機制相關(guān)，其中PD-L1在腫瘤細胞上的表達已經(jīng)被證明在多種癌癥類型中對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)相關(guān)，然而PD-L1在不同的腫瘤細胞內(nèi)表達水平不同。因此，篩選和研究PD-L1表達的調(diào)節(jié)機制，不僅能更好地了解腫瘤生物學(xué)，而且能開發(fā)新的改善抗腫瘤反應(yīng)的治療策略。采用CRISPR/Cas9篩選腫瘤PD-L1表達調(diào)控因子的sgRNA文庫構(gòu)建與抑癌基因篩選的思路基本一致，然后基于PD-L1細胞表達模式的不同，通過流式細胞分選目的癌細胞?；谶@一思路，Burr等[39]在一種胰腺癌腫瘤細胞系中，篩選到CMTM6基因作為一種新的細胞PD-L1表達調(diào)控因子。在免疫治療中另一個重要的療效影響因素是MHC-I的減少。在MHC-I低表達的K562細胞系中，通過CRISPRko篩選顯示，靶向Eed、Ezh2、Ezh1和PRC2的細胞MHC-I表達量升高，顯示MHC-I的表達調(diào)控與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)[40]。

相同的思路也可用于動物模型腫瘤免疫微環(huán)境的研究中，通過分別在免疫正常和缺陷小鼠皮下移植經(jīng)CRISPR篩選系統(tǒng)處理后的腫瘤細胞，對培養(yǎng)后采集到的腫瘤進行測序，從免疫活性動物癌細胞中缺失的sgRNAs推斷特定的基因敲除對產(chǎn)生更強抗腫瘤反應(yīng)的重要性?；谶@一思路，有研究[41-43]報道，已鑒定出的Ptpn2等可能是腫瘤免疫治療效果相關(guān)的新潛在靶點。另一方面，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也可用于研究腫瘤微環(huán)境中CD8+、CD4+或NK細胞等免疫細胞活性降低的作用機制。Dong等[44]通過在表達Cas9的CD8+細胞中注射sgRNA文庫，并將編輯后T細胞輸注到進行了皮下腫瘤移植的小鼠，發(fā)現(xiàn)RNA解旋酶Dhx37是調(diào)控CD8+細胞腫瘤浸潤的關(guān)鍵因子。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用研究

作為一種方便快捷的基因編輯工具，直接將CRISPR/Cas9應(yīng)用于腫瘤臨床治療的嘗試也一直未中斷過。

3.1 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)糾正異?；?/h3>

直接通過CRISPR/Cas9糾正致癌基因突變或表觀遺傳畸變是腫瘤臨床治療的一個研究方向。在膀胱癌細胞模型中，通過腫瘤特異性的hTERT啟動子和尿路上皮特異性的hUPⅡ啟動子，分別控制sgRNA和Cas9在膀胱癌細胞中特異性表達，靶向激活p21、E-cad和hBax等腫瘤抑制因子，從而抑制腫瘤細胞生長[45]。但是，CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)的體內(nèi)遞送載體及其脫靶問題，一直限制著臨床使用。此外，由于腫瘤在不同患者、不同階段和不同位置上都存在異質(zhì)性，使得腫瘤基因組操作具有很大的挑戰(zhàn)性，而且，由于未編輯的腫瘤細胞比以治療為目的的編輯細胞更具生長優(yōu)勢，因此該策略很容易導(dǎo)致治療迅速失效。

3.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)清除致癌病毒

HPV、HBV、HCV、EBV等致癌病毒感染，是很多種腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)最初作為細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，具有防御和清除這些致癌病毒的潛力。以HBV為例，研究[46]顯示，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HBVDNA突變，可在細胞和小鼠模型中有效清除或抑制病毒，其中基于TVHI遞送至小鼠肝臟的靶向HBV的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，有效清除肝細胞內(nèi)的HBVcccDNA。盡管這一策略可有效控制和清除致癌病毒，但除了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的遞送載體限制外，病毒靶點的高度變異性也對這些治療方法提出了挑戰(zhàn)。

3.3 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)優(yōu)化免疫治療效果

在腫瘤免疫治療中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除包括PD-1基因和CTLA-4基因在內(nèi)的免疫檢查點相關(guān)基因，可提高腫瘤免疫治療效果。這一策略的第一個臨床試驗在2016年已開始第一個患者的治療，在多線治療后的非小細胞肺癌患者中體外敲除T細胞PD-1基因，經(jīng)體外篩選、擴增，然后回輸入患者體內(nèi)[47]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在免疫治療中，另一種臨床應(yīng)用策略是協(xié)助改造CAR-T等，通過對T細胞內(nèi)源TCR、HLA-I以及PD-1的失活編輯[48]，乃至通過CRISRP/Cas9介導(dǎo)的HDR直接引入位點特異性CAR，提高CAR-T的制備效率。

4 小結(jié)與展望

自從CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展成為一種基因組編輯工具以來，它通過提供一種簡單而多功能的方法來操縱基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組，從而徹底改變生物學(xué)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤機制研究、藥物靶點篩選和臨床治療等腫瘤基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的潛力，正在開始顯現(xiàn)。堿基編輯和Prime Editing等多功能CRISPR的技術(shù)發(fā)展，有助于改善通過同源定向修復(fù)進行精確基因改變效率低下的問題。例如spCas9-NG和xCas9等Cas9蛋白的進化改良，擴大了PAM序列范圍及潛在編輯位置，并為未來減低編輯脫靶率提供了研究思路。saCas9、Cas13、Cpf1等其他類型Cas蛋白的研究和應(yīng)用，可將增加CRISPR基因編輯載體的選擇范圍，提高編輯效率或增加編輯范圍。此外，隨著CRISPR基因編輯技術(shù)與單細胞RNA測序、單細胞追蹤和表型分析平臺的結(jié)合，將使研究人員能全面剖析腫瘤內(nèi)在異質(zhì)性，并揭示更多潛在的治療靶點。總之，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)并將繼續(xù)大大加快諸多領(lǐng)域的腫瘤研究。