星形膠質(zhì)細(xì)胞連接蛋白在阿爾茨海默病中的作用研究進(jìn)展

涂娜，黃小敏，劉鳳玲，蘇一洵，易陳菊

1 星形膠質(zhì)細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和功能

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元接收、整合、組織和傳遞信息需與膠質(zhì)細(xì)胞尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用才能充分發(fā)揮功能。星型膠質(zhì)細(xì)胞組成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，向神經(jīng)元提供營養(yǎng)和代謝支持[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的通信通過縫隙連接（gap junction，GJ)來實(shí)現(xiàn)。連接蛋白（connexin，Cx）在細(xì)胞膜形成六聚體組成連接子；位于相鄰細(xì)胞膜表面的兩個(gè)連接子組成縫隙連接通道（gap junction channel，GJC），繼而大量GJC聚集形成GJ。連接子也可以作為半通道（hemichannel，HC）開放，介導(dǎo)胞內(nèi)外小分子物質(zhì)交換。另外，泛連接蛋白（pannexin，Panx）也可形成HC[2]。

Cx由4個(gè)α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域和2段胞外環(huán)連接而成[2]，在大腦所有類型的細(xì)胞中表達(dá)[1,3,4]，但不同的細(xì)胞類型表達(dá)不同的Cx，且表達(dá)水平不同。已知星型膠質(zhì)細(xì)胞Cx的表達(dá)量最高，其中又以Cx43和Cx30表達(dá)量最多，而小膠質(zhì)細(xì)胞則以Cx43、Cx32和Panx1為主[4,5]。同時(shí)，在膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中其表達(dá)水平也會發(fā)生變化[6]。在炎癥反應(yīng)等病理?xiàng)l件下，Cx可作為HC被激活開放，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的小分子交換[7,8,9]。Panx是編碼3種膜蛋白Panx1、Panx2、Panx3的基因家族[2,6]，雖與Cx有相似的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但二者之間并無同源性。迄今的研究表明，僅在少數(shù)病例中發(fā)現(xiàn)Panx在膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[9,10]。然而，膠質(zhì)細(xì)胞中Panx HC一旦被激活，就會參與介導(dǎo)膠質(zhì)遞質(zhì)如ATP和谷氨酸及趨化因子的釋放，從而造成神經(jīng)元功能損傷。這在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）[11]、自身免疫性腦脊髓炎[12]、肌萎縮側(cè)索硬化[13]和神經(jīng)性疼痛[14]小鼠模型中都有相應(yīng)的報(bào)道。

2 星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx在AD中表達(dá)的變化

AD以進(jìn)行性近記憶力下降，精神行為異常和人格改變?yōu)樘卣?，是變性病性癡呆的主要類型[15]。其病理學(xué)的顯著特征之一是大腦皮質(zhì)和海馬的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[16,17]，但目前對星形膠質(zhì)細(xì)胞在AD中的作用尚缺乏系統(tǒng)性的認(rèn)識。

在AD患者的腦組織切片中發(fā)現(xiàn)，Cx43和Cx30呈斑點(diǎn)狀密集分布于Aβ斑塊周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞中[18]。此外，在大于4月齡的APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠的大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)，Cx43和Cx30的免疫反應(yīng)性隨Aβ沉積增加而增強(qiáng)。半定量分析表明，當(dāng)存在大量的Aβ斑塊時(shí)，Cx表達(dá)上調(diào)。而位于新生成的Aβ斑塊附近的Cx則表達(dá)降低。由于Aβ斑塊隨著疾病的發(fā)展而積累，所以新生斑塊的比例在淀粉樣病變后期大幅降低[19]。因此在AD中后期，Cx的總量升高。這一結(jié)果也在AD患者的大腦標(biāo)本中被證實(shí)[19]。

然而，體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞受促炎因子（如IL-1β、TNF-α）刺激后，Cx43表達(dá)降低[20]，這與體內(nèi)研究結(jié)果相矛盾，可能是因?yàn)轶w內(nèi)斑塊周圍的炎癥網(wǎng)絡(luò)比體外要復(fù)雜得多。并且，體外培養(yǎng)星型膠質(zhì)細(xì)胞Cx的表達(dá)是在促炎因子短期（24～48 h）刺激后發(fā)生變化；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞因子受體因受到長期的刺激而靈敏度降低并導(dǎo)致參與調(diào)節(jié)Cx表達(dá)和相關(guān)通道功能的某些內(nèi)部信號網(wǎng)絡(luò)解耦連。已有研究表明，此過程是通過TNF-α信號通路途徑發(fā)生的；在AD患者和小鼠模型的海馬區(qū)，蛋白質(zhì)DENN/MADD（TNF受體-1的胞內(nèi)介質(zhì)）的下調(diào)支持了這一論點(diǎn)[21,22]。

3 APPswe/PS1dE9中星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx的通道功能

星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx既可以作為GJ又可以作為HC發(fā)揮作用。在體內(nèi)的病理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過GJ介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)向遠(yuǎn)處傳遞信號的功能保持不變或增強(qiáng)[23,24]。我們最近的研究利用一種可通過GJ的星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性攝取的小分子染料SR101（sulforhodamie 101），在9月齡APP/PS1和同齡野生型小鼠的活體腦切片中進(jìn)行FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）實(shí)驗(yàn)以檢測成年小鼠膠質(zhì)細(xì)胞GJ活性[25]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中，APP/PS1小鼠熒光恢復(fù)與野生型相同；當(dāng)加入GJ阻斷劑甘珀酸后，APP/PS1小鼠和同齡野生型小鼠中均有40%的熒光恢復(fù)被抑制。這表明GJ功能在APP/PS1小鼠中保持不變且不受星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響[25]。

在體外進(jìn)行溴化乙錠（Ethidium bromide，EtBr）攝入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35處理可分別導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中HC激活。其中，對Aβ最敏感的是小膠質(zhì)細(xì)胞，其次是星形膠質(zhì)細(xì)胞，最后是神經(jīng)元。通過利用抑制劑與小鼠敲除模型發(fā)現(xiàn)，在小膠質(zhì)細(xì)胞中，Cx43和Panx1 HC會被Aβ25-35激活；而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，主要是Cx43 HC被激活[7,12,26]。

在最近的研究中，我們通過EtBr攝入實(shí)驗(yàn)在9月齡的APP/PS1小鼠活體腦切片中檢測到星形膠質(zhì)細(xì)胞HC被激活[27]。并發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ斑塊的距離不同時(shí)，其表型有所不同。根據(jù)與Aβ斑塊的接近程度，我們將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為“近”和“遠(yuǎn)”2個(gè)不同的群體?！敖毙切文z質(zhì)細(xì)胞是指細(xì)胞直接接觸斑塊，并且GFAP信號增強(qiáng)；而“遠(yuǎn)”星形膠質(zhì)細(xì)胞則遠(yuǎn)離斑塊（定義為＞50μm），且膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)處于未活化狀態(tài)。在不含有Aβ斑塊（包括野生型小鼠和年輕的APP/PS1小鼠）中，EtBr熒光信號相對較弱，且不能被HC阻斷劑甘珀酸抑制，說明這些膠質(zhì)細(xì)胞HC未開放。而在有大量Aβ斑塊的年老APP/PS1小鼠中，膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的EtBr信號明顯上調(diào)，并且這種現(xiàn)象在“近”星形膠質(zhì)細(xì)胞中最為顯著。當(dāng)用甘珀酸干預(yù)時(shí)，信號則降低至野生型小鼠組水平，說明此時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的HC被激活，并且“近”組星型膠質(zhì)細(xì)胞的HC激活開放的程度高于“遠(yuǎn)”組[28]。

有趣的是，雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)Cx43和Cx30，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)只有Cx43參與了APP/PS1小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞HC激活，Cx30并未參與。這已經(jīng)通過使用特異性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43或全身性敲除Cx30的APP/PS1小鼠進(jìn)行EtBr攝入實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)[29]。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43被敲除時(shí)，“遠(yuǎn)”星形膠質(zhì)細(xì)胞的EtBr信號會消失，“近”星形膠質(zhì)細(xì)胞還剩下少部分的EtBr信號，證明主要是Cx43 HC被激活；同時(shí)，該少部分EtBr信號可被Panx1 HC特異性阻斷劑完全阻斷，表明“近”膠質(zhì)細(xì)胞的HC激活開放也可以通過Panx1 HC介導(dǎo)。簡言之，在APP/PS1小鼠的海馬區(qū)，“遠(yuǎn)”和“近”星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43 HC均被激活，但Panx1 HC僅在“近”膠質(zhì)細(xì)胞中有開放，且激活程度明顯低于Cx43 HC。我們進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，在APP/PS1小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43 HC激活的主要原因是細(xì)胞內(nèi)的高濃度[Ca2+]i。與此相反，體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞或活體腦切片中膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43 HC則主要被促炎癥信號激活。

4 APP/PS1中的星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx/Panx半通道開放造成神經(jīng)元功能損傷

在AD小鼠模型APP/PS1中，星型膠質(zhì)細(xì)胞HC激活后對疾病的發(fā)展起什么作用和影響？如上所述，星型膠質(zhì)細(xì)胞的高[Ca2+]i觸發(fā)Cx43 HC開放。而胞外的Ca2+再通過開放的HC進(jìn)入胞內(nèi)使[Ca2+]i維持在高濃度狀態(tài)，從而形成惡性循環(huán)。同時(shí)，Cx43 HC的慢性激活導(dǎo)致谷氨酸的釋放[7,30]。ATP同樣通過Cx HC和Panx HC釋放[31,32]。在AD中，通過HC釋放的ATP可作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。例如，ATP可直接作用于神經(jīng)元嘌呤受體，并且導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和神經(jīng)性營養(yǎng)不良[33]。最近的研究也表明，在神經(jīng)元中，ATP也可觸發(fā)Panx1 HC開放使Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[34]。此外，ATP轉(zhuǎn)化為腺苷后可調(diào)節(jié)突觸活性發(fā)生突觸抑制[35,36]，從而參與AD中的突觸損傷，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性神經(jīng)炎病變[33]。但ATP轉(zhuǎn)化為腺苷也可能對神經(jīng)元起到保護(hù)作用[37]。

在APP/PS1小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞HC的慢性激活使[Ca2+]i維持較高濃度水平，進(jìn)而導(dǎo)致膠質(zhì)遞質(zhì)持續(xù)釋放，這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為毒性效應(yīng)的放大器參與神經(jīng)退行性病變。為了解AD中神經(jīng)元的損傷和病變程度，我們用RTN3（reticulon-3）抗體標(biāo)記小鼠腦切片中營養(yǎng)不良性神經(jīng)突[38]。在APP/PS1-Cx43KO和對照APP/PS1小鼠的Aβ斑塊附近，均檢測到RTN3陽性的神經(jīng)突；但是APP/PS1-Cx43KO小鼠中的RTN3陽性的神經(jīng)突數(shù)量相比同齡的對照APP/PS1小鼠顯著降低。其次，APP/PS1-Cx43KO小鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元中超氧化物水平相比對照明顯降低[39]。這表明，當(dāng)Cx43 HC被阻斷時(shí)，神經(jīng)元損傷明顯減輕。阻斷Cx43 HC可以一定程度上減緩AD的病理進(jìn)程。

鑒于星型膠質(zhì)細(xì)胞HC在AD病程中的重要作用，HC可能成為治療AD的潛在靶點(diǎn)。目前已知可以使用藥物抑制劑、抗體或模擬肽等阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞HC開放。研究顯示，CBX和甘草酸等藥物抑制劑都能有效地抑制HC開放。但這些藥物往往也會影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJ功能，而GJ功能對維持星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)和代謝功能有重要的作用。所以最理想的是使用能阻斷HC但不改變GJ功能的藥物。如Cx特異性抗體或Panx模擬多肽可選擇性阻斷HC的通透性[40]。據(jù)報(bào)道，Cx43模擬肽Gap19可以在不改變GJ的情況下，抑制原代培養(yǎng)和活體海馬腦片中星形膠質(zhì)細(xì)胞的HC[41]。此外，我們選擇了一種從智利的boldo植物中提取的生物堿boldine。boldine能阻斷體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞的HC[42]，可穿過血腦屏障，無藥物毒性作用，并且可以口服。我們的研究結(jié)果表明，boldine不僅可以像CBX一樣阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的HC，同時(shí)不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJ功能。APP/PS1小鼠長期口服boldine，可以阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞HC開放，減少膠質(zhì)遞質(zhì)如谷氨酸和ATP的釋放，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i水平，從而減輕神經(jīng)元損傷，起到減緩AD疾病進(jìn)程的作用[43]。

5 總結(jié)與展望

膠質(zhì)細(xì)胞活化為AD等神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志性特征之一。在AD中，活化的膠質(zhì)細(xì)胞（包括星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）圍繞在Aβ斑塊周圍[44]。星型膠質(zhì)細(xì)胞的功能變化與Cx緊密相關(guān)。最近的研究通過使用AD小鼠模型進(jìn)一步揭示了AD中星型膠質(zhì)細(xì)胞Cx的表達(dá)和功能變化影響了整個(gè)疾病的病理進(jìn)程。

在生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJ維持著較高水平。AD小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ增強(qiáng)或者維持較高水平，增加多種小分子物質(zhì)的擴(kuò)散。一方面，大腦皮質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJ參與了胞內(nèi)Ca2+波的傳播，調(diào)控了K+穩(wěn)態(tài)維持、胞內(nèi)代謝物質(zhì)傳播、膠質(zhì)遞質(zhì)傳遞、血流控制及神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。另一方面，AD中星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJ增強(qiáng)可促進(jìn)葡萄糖代謝。GJ通過提供能量代謝物和稀釋谷氨酸等有毒物質(zhì)，減輕神經(jīng)損傷[23]。但由于目前沒有針對GJ或HC的特異性阻斷劑，很難直接界定膠質(zhì)細(xì)胞GJ在疾病中有益還是有害[45]。利用Cx基因敲除小鼠并不能直接解決這個(gè)問題，因?yàn)樵谶@些小鼠中兩種通道的功能都受到影響[45]。與GJ相比，HC在神經(jīng)元功能損傷中似乎發(fā)揮著更重要的作用[28,46,47]。因此，目前亟需研發(fā)一種能選擇性靶向膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的Cx和Panx，特異性區(qū)分GJ和HC的新藥物。靶向膠質(zhì)細(xì)胞逐漸成為神經(jīng)退行性病變的一種替代治療方法[48-50]，膠質(zhì)細(xì)胞Cx可成為潛在靶點(diǎn)。對星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx的綜合性研究可更好地理解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和病理過程，具有非常重要的意義。