基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究甘松治療帕金森病伴發(fā)焦慮的作用機(jī)制

李佳園，徐 文，萬(wàn)國(guó)慧，魏曉嘉，楊 雪，劉金鳳，于佳禾，金重先，呂 研，王雨青，石晉麗

? 藥理與臨床 ?

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究甘松治療帕金森病伴發(fā)焦慮的作用機(jī)制

李佳園，徐 文，萬(wàn)國(guó)慧，魏曉嘉，楊 雪，劉金鳳，于佳禾，金重先，呂 研，王雨青，石晉麗*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)甘松治療帕金森病伴發(fā)焦慮（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并通過(guò)PDA模型大鼠進(jìn)行藥效學(xué)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的驗(yàn)證。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP）和文獻(xiàn)挖掘獲得甘松主要化學(xué)成分，利用SwissTargetPrediction、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得甘松化學(xué)成分治療PDA的潛在靶點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。大鼠采用頸背部sc魚(yú)藤酮制備PD模型，并通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)篩選出PDA模型大鼠；設(shè)置對(duì)照組、模型組、甘松（620 mg/kg）組、左旋多巴（49 mg/kg）組，利用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和免疫組化法對(duì)甘松治療PDA的藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)；并對(duì)關(guān)鍵蛋白和大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定?！俺煞?靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中包含甘松抗PDA的12個(gè)有效成分如甘松新酮、諾卡酮、金合歡素、β-谷甾醇等，絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等99個(gè)靶點(diǎn)，主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、雌激素、FoxO、TNF等信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘松延長(zhǎng)了PDA大鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間，增加了其在曠場(chǎng)的總活動(dòng)距離及在中央?yún)^(qū)的活動(dòng)時(shí)間和距離，提高了黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性表達(dá)（＜0.05）；甘松顯著降低大鼠紋狀體MAPK3、TNF-α含量以及STAT3蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），提高了多巴胺、3,4-二羥基苯乙酸、高香草酸、5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸水平（＜0.01、0.001）。甘松中的有效成分可能是通過(guò)MAPK3、TNF-α、STAT3等靶點(diǎn)調(diào)控多條信號(hào)通路來(lái)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，提高神經(jīng)遞質(zhì)水平以治療PDA疾病。

甘松；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；帕金森病伴發(fā)焦慮；炎癥因子；神經(jīng)遞質(zhì)；絲裂原活化蛋白激酶3；腫瘤壞死因子-α；信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；甘松新酮；諾卡酮；金合歡素

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是我國(guó)第2大類(lèi)神經(jīng)退行性疾病[1]，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直、靜止性震顫等運(yùn)動(dòng)障礙[2]。此外，一些非運(yùn)動(dòng)癥狀如焦慮、失眠、抑郁等也經(jīng)常伴隨PD發(fā)生，近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，這些非運(yùn)動(dòng)癥狀大多出現(xiàn)在整個(gè)病程中，有些甚至出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)癥狀發(fā)病之前[3]。其中，焦慮被認(rèn)為是PD最常見(jiàn)且損傷性較大的非運(yùn)動(dòng)癥狀之一[4]，PD伴發(fā)焦慮（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的患者在PD患者中占40%～50%[5]，焦慮不僅降低了PD患者的生活質(zhì)量，還會(huì)加重PD患者的運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知表現(xiàn)[6]，嚴(yán)重阻礙PD患者身體健康的恢復(fù)。目前PDA的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但隨著研究的不斷深入，認(rèn)為PDA的發(fā)病機(jī)制涉及炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá)[7]，下丘腦、黑質(zhì)、紋狀體的神經(jīng)元功能退化及所含的多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等神經(jīng)遞質(zhì)的含量下降等方面[8]。臨床上常用的一些藥物如左旋多巴、美多芭、勞拉西泮和丁螺環(huán)酮等對(duì)PDA患者具有一定的緩解作用，但長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)引發(fā)異動(dòng)癥、睡眠障礙等不良反應(yīng)，無(wú)法真正治療該疾病[9]。因此未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步明確PDA的發(fā)病機(jī)制，找尋治療PDA的有效靶點(diǎn)，提高藥物的臨床有效性和安全性。

甘松為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖，在藏藥中又被稱(chēng)為邦貝，具有理氣止痛、開(kāi)郁醒脾的功效[10-11]。李時(shí)珍在《本草綱目》中提出，甘松之甘源于“其味甘”，有補(bǔ)、和、緩之效，能理元?dú)?、去氣郁、健脾胃[12]；在藏藥中，甘松之松源于藏語(yǔ)bsung，意為“氣味芳香”，有清熱、解毒、消炎之效[13]?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定，甘松用量為3～6 g，且本品含甘松新酮（C15H22O3）不得少于0.10%。根據(jù)成人最高用量換算，得到大鼠口服劑量為620 mg/kg。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘松80%乙醇的提取物（620 mg/kg，以生藥量計(jì)）及甘松新酮均有良好的抗PD效果，其中甘松新酮治療PD的機(jī)制可能與抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路的激活，抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑，減少細(xì)胞的損傷有關(guān)[14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘松提取物具有潛在的抗焦慮活性并具有劑量相關(guān)性[15]；甘松提取物能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，抑制炎性細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抗炎作用[16]；此外，甘松還具有抗癲癇[17]、抗抑郁[18]等作用。綜合甘松的傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理研究結(jié)果，推測(cè)甘松具有治療PDA的潛力，但目前尚未有學(xué)者對(duì)甘松治療PDA的藥效和作用機(jī)制展開(kāi)深入研究。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)甘松治療PDA的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用PDA模型大鼠對(duì)其藥效學(xué)和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為甘松治療PDA的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)甘松治療PDA的作用機(jī)制

1.1.1 甘松化學(xué)成分的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/ tcmspsearch.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件，對(duì)甘松的化學(xué)成分進(jìn)行篩選；同時(shí)采用文獻(xiàn)挖掘的方式收集甘松中的化學(xué)成分；將檢索到的化學(xué)成分進(jìn)行整合并去重，得到最終化學(xué)成分。

1.1.2 化學(xué)成分和PDA的相關(guān)靶點(diǎn)收集 利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得上述化合物的SMILES號(hào)，通過(guò)SwissTarget Prediction網(wǎng)站（http://www.swisstargetprediction. ch/）預(yù)測(cè)甘松化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），以“Parkinson’s disease with anxiety”為檢索詞獲取相關(guān)性得分≥10的PDA靶點(diǎn)。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件對(duì)甘松化學(xué)成分和PDA的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到兩者的共同靶點(diǎn)，即甘松治療PDA的潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在STRING平臺(tái)（https://STRING-db.org/）輸入潛在作用靶點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化操作，根據(jù)Network Analyzer插件中的度值和介數(shù)評(píng)估每個(gè)靶點(diǎn)的重要性，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.1.4 靶點(diǎn)功能富集分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)甘松治療PDA的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用SangerBox平臺(tái)（http://sangerbox.com/）的高級(jí)氣泡圖對(duì)排名前20的通路進(jìn)行可視化分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Network Analyzer插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，確定關(guān)鍵化學(xué)成分。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度（20～22）℃，濕度（40～60）%，12 h光暗周期，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)要求，并獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020091406-3054）。

1.2.2 甘松藥材及其提取物制備 甘松購(gòu)自四川阿壩若爾蓋縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖。將藥材粉碎成粗粉，稱(chēng)取300 g，依次用10、8、8倍量80%乙醇超聲提取3次，溫度控制在35 ℃以下，時(shí)間分別為60、45、45 min，靜置，濾過(guò)，合并濾液，冷凍干燥后于干燥器中保存。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版和文獻(xiàn)方法[14]，測(cè)得甘松80%乙醇提取物中甘松新酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.2%，甘松的出膏率為10.7%，即甘松生藥中含甘松新酮0.56%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)圖1。

1.2.3 試劑與儀器 甘松新酮對(duì)照品（批號(hào) P19A10L86397，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DA ELISA試劑盒、3,4-二羥基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）ELISA試劑盒、高香草酸（homovanillicacid，HVA）ELISA試劑盒、5-HT ELISA試劑盒、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）ELISA試劑盒、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)202103D）購(gòu)自江蘇酶免生物科技有限公司；酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（批號(hào)GB11181）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（批號(hào)GB12176）、β-actin抗體（批號(hào)GB12001）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)GB23301）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；魚(yú)藤酮（批號(hào)R105076）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；葵花籽油（批號(hào)W24A11L122237）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；左旋多巴購(gòu)自北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司；烏拉坦（批號(hào)C10821103）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

圖1 甘松80%乙醇提取物(a) 及對(duì)照品(b) 中甘松新酮的HPLC圖

SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī)、JY96-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；RT-6100型多功能酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司）。

1.2.4 PDA大鼠模型建立及分組、給藥 51只SD大鼠在SPF級(jí)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用頸背部交替sc魚(yú)藤酮法建立PD模型。取40只大鼠sc魚(yú)藤酮葵花油溶劑（1.5 mL/kg）制備PD模型，取11只大鼠sc不含魚(yú)藤酮的葵花油溶劑作為對(duì)照組，1次/d，連續(xù)14 d。當(dāng)大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃、精神萎靡不振、弓背和四肢力量減弱等癥狀時(shí)，表明造模成功[19]，共得到35只PD大鼠，造模成功率為87.5%。將造模成功的PD大鼠采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)篩選得到PDA大鼠33只。將篩選的PDA大鼠隨機(jī)分為甘松（620 mg/kg）組、左旋多巴（49 mg/kg）組和模型組，每組11只，對(duì)照組11只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（0.2 mL/kg），1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.5 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 末次給藥次日進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和平衡能力。在測(cè)試之前，先對(duì)大鼠進(jìn)行為期3 d的訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練時(shí)將大鼠尾朝外側(cè)放置在旋轉(zhuǎn)棒上，適應(yīng)環(huán)境20 s后，將轉(zhuǎn)棒的轉(zhuǎn)速由4 r/min勻速增加至20 r/min，加速度為6 r/min，最長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)間為3 min。若大鼠中途掉落，將其再次放置轉(zhuǎn)棒上，確保訓(xùn)練時(shí)間為3 min。正式測(cè)試時(shí)，轉(zhuǎn)速和加速度與訓(xùn)練時(shí)一致，記錄大鼠第1次從轉(zhuǎn)棒上的掉落時(shí)間，每只大鼠檢測(cè)3次，每次間隔2 h，取3次測(cè)試時(shí)間的平均值[20]。

1.2.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)為考察動(dòng)物焦慮樣行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。將曠場(chǎng)（長(zhǎng)100 cm、寬100 cm、高50 cm）放置在燈光較暗、環(huán)境安靜的場(chǎng)所。曠場(chǎng)底面為黑色，被均分為25個(gè)方格，中間的9個(gè)方格為曠場(chǎng)的中央?yún)^(qū)，其余為邊緣區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠放置在空曠的環(huán)境中適應(yīng)5 min，然后將其放置在曠場(chǎng)的中央?yún)^(qū)，并記錄大鼠在曠場(chǎng)5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。每測(cè)試完1只大鼠，對(duì)曠場(chǎng)進(jìn)行酒精消毒，待酒精揮發(fā)后進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。檢測(cè)指標(biāo)為大鼠在曠場(chǎng)中的活動(dòng)總距離（cm），以及在中央?yún)^(qū)的活動(dòng)距離（cm）和停留時(shí)間（s）。

1.2.7 TH免疫組化染色 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 20%烏拉坦麻醉。剪開(kāi)大鼠的胸腔，將灌注針插入心臟左心室，剪開(kāi)右心耳進(jìn)行心臟灌注操作。在冰上迅速剝離出完整的大腦，浸泡于10倍體積的多聚甲醛溶液中靜置24 h。然后進(jìn)行石蠟包埋，冠狀面切片，梯度酒精脫水，染色，拍照，并將圖片導(dǎo)入至Image J軟件中，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的吸光度（）及區(qū)域總面積的比值進(jìn)行分析，得到TH的平均值，以確定其表達(dá)情況。

1.2.8 紋狀體MAPK3、TNF-α含量的測(cè)定 大鼠麻醉后，在冰上迅速取出紋狀體，稱(chēng)定質(zhì)量，采用超聲波粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，離心機(jī)離心，將采集到的上清液按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 紋狀體STAT3蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取各組大鼠紋狀體，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉30 min，加入STAT3抗體（1∶1000）和β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶5000），室溫孵育30 min，然后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，對(duì)ECL發(fā)光檢測(cè)成像，拍照，AlphaEase FC軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.2.10 紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)水平的檢測(cè) 取各組大鼠紋狀體，采用超聲波粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，離心機(jī)離心，將采集到的上清液按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量。

2 結(jié)果

2.1 甘松治療PDA的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

2.1.1 甘松化學(xué)成分及治療PDA的潛在靶點(diǎn) 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（OB≥30%、DL≥0.18）得到4個(gè)化合物，即表1中1～4。通過(guò)文獻(xiàn)挖掘[21]，同時(shí)利用TCMSP考察這些化合物的OB值和DL值（OB≥30%、DL≥0.10），共得8個(gè)化合物，即表中的5～12。利用SwissTargetPrediction平臺(tái)預(yù)測(cè)出甘松潛在靶點(diǎn)297個(gè)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到與PDA相關(guān)的1114個(gè)作用靶點(diǎn)。R語(yǔ)言軟件對(duì)甘松化學(xué)成分和PDA的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，共獲得99個(gè)甘松治療PDA的潛在作用靶點(diǎn)。

表1 甘松的主要活性成分

Table 1 Main active ingredients of

序號(hào)化合物ID化合物名稱(chēng)OB/%DL 1MOL010543刺槐苷39.840.71 2MOL001689金合歡素34.970.24 3MOL000358β-谷甾醇36.910.75 4MOL007088隱丹參酮52.340.40 5MOL010540甘松新酮66.340.17 6MOL004067諾卡酮33.040.10 7MOL000695廣藿香醇101.960.14 8MOL000935α-古蕓烯53.830.10 9MOL001566白菖烯52.160.11 10MOL001298去氫木香內(nèi)酯58.570.14 11MOL012168馬兜鈴烯56.060.11 12MOL010534青木香酮20.690.15