Eph/Ephrin信號(hào)通路在缺血性心臟病血管生成中的研究進(jìn)展

施國(guó)榮 劉婷婷 田欣 祝自新 鄭文榮 王宇峰 孫芳玲 王文

(北京市老年病醫(yī)療研究中心 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京 100053)

近年來缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率居高不下，如何有效地改善心臟功能和預(yù)后一直是缺血性心臟病治療的難題。尋求有效的靶點(diǎn)和策略解決心肌受損和微血管數(shù)量減少的問題，對(duì)增加心肌再灌注和恢復(fù)心臟功能有重大的意義[1]。Eph/ephrin家族是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的酪氨酸激酶受體家族，在心臟發(fā)育過程中至關(guān)重要[2]。研究證實(shí)，缺乏EphrinB2或EphB4的小鼠胚胎會(huì)死于嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)畸形[3]。而在缺血性心血管疾病中，缺血缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)、周細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等不同細(xì)胞的Eph/ephrin信號(hào)的表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成，進(jìn)而恢復(fù)受損心臟的功能[4]。現(xiàn)對(duì)Eph/ephrin信號(hào)家族在心血管發(fā)育和缺血性心臟病中的作用進(jìn)行綜述，此外還將介紹幾種有關(guān)Eph/ephrin信號(hào)潛在的治療方式，以期為缺血性心臟病后的再生修復(fù)治療研究提供線索。

1 Eph/ephrin家族

1.1 Eph/ephrin家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能

Eph/ephrin信號(hào)通路是一類非常保守的蛋白受體酪氨酸激酶家族，根據(jù)序列的同源性、錨定方式及結(jié)合嗜性等分為A和B兩個(gè)亞型，目前Eph/ephrin在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)共有14個(gè)受體和8個(gè)配體，包括EphA(A1～A8和A10)、EphB(B1～B4和B6)、EphrinA(A1～A5)和EphrinB(B1～B3)。Eph受體都具有相似的結(jié)構(gòu)：細(xì)胞外部分、單個(gè)跨膜區(qū)域和胞漿內(nèi)部分[5]。細(xì)胞外部分由球形配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)類似表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、富含半胱氨酸的區(qū)域和兩個(gè)纖連蛋白Ⅲ型的重復(fù)序列。細(xì)胞內(nèi)部分由近膜部分、酪氨酸激酶區(qū)域、無菌α基序結(jié)構(gòu)域和postsynaptic density-95/discs large/zona occludens-1(PDZ)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成[6]。與Eph相比，EphrinA和EphrinB具有不同的結(jié)構(gòu)，EphrinA在細(xì)胞外部分具有Eph受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域并通過糖基磷脂酰肌醇連接至細(xì)胞膜，無胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；而EphrinB包含一個(gè)Eph受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)胞質(zhì)部分，其中胞質(zhì)部分具有多個(gè)酪氨酸和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)以及一個(gè)PDZ結(jié)合基序[7]。研究發(fā)現(xiàn)，EphB4是EphrinB2的特異性受體[7]。

Eph/ephrin信號(hào)的傳導(dǎo)是雙向的，即Eph和Ephrin可互相激活。Ephrin激活相鄰細(xì)胞，Eph受體的胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域通過自磷酸化來啟動(dòng)正向信號(hào)傳導(dǎo)；Ephrin的末端區(qū)域可通過PDZ依賴的方式來啟動(dòng)反向信號(hào)傳導(dǎo)。Eph/ephrin調(diào)控的雙向信號(hào)傳導(dǎo)在心臟發(fā)育中具有重要意義，可指導(dǎo)心肌循環(huán)的完成、心內(nèi)膜的擴(kuò)張、心肌小梁形成和心臟瓣膜的形成以及心臟譜系分化的發(fā)展[8]。除心臟發(fā)育外，Ephrin信號(hào)還參與病理性心臟重構(gòu)過程，包括心肌缺血后線粒體功能調(diào)節(jié)和心臟損傷或心肌纖維化后的血管新生等過程。

1.2 EphB4下游信號(hào)傳導(dǎo)方式

EphB4下游信號(hào)傳導(dǎo)具有復(fù)雜的機(jī)制。PI3K/Akt信號(hào)通路可介導(dǎo)EphB4誘導(dǎo)EC增殖，抑制EphB4可降低Akt磷酸化，從而抑制細(xì)胞的增殖[5]。使用PI3K、Akt、PKG和甲乙酮(methyl ethyl ketone，MEK)的阻滯劑可抑制EphB4誘導(dǎo)EC增殖。但Ras和Src信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)增殖反應(yīng)無影響[3]。Akt可特異性磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，增加EphB4激活后的亞硝酸鹽的產(chǎn)生，從而激活cGMP-PKG信號(hào)通路[6]。cGMP-PKG信號(hào)通路可激活下游信號(hào)Raf產(chǎn)生MEK，因而EphB4誘導(dǎo)的增殖信號(hào)部分可能是通過PI3K/Akt-eNOS/NO-cGMP/PKG-Raf/MEK激酶級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的[6]。

1.3 EphrinB2下游信號(hào)傳導(dǎo)方式

與正向EphB4信號(hào)傳導(dǎo)不同，由于缺乏內(nèi)在的催化活性，EphrinB2介導(dǎo)的反向信號(hào)依賴于募集信號(hào)分子[2]。EphrinB2的反向信號(hào)募集信號(hào)分子的方式有兩種。其一，EphrinB2的磷酸化由Src家族激酶的募集介導(dǎo)，然后與含SH2/SH3域的銜接子蛋白如Grb4和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3結(jié)合[2]。Grb4誘導(dǎo)多種細(xì)胞骨架調(diào)控信號(hào)介導(dǎo)EC的遷移，例如局部黏著斑激酶、G蛋白偶聯(lián)受體激酶1、動(dòng)力蛋白、Cbl相關(guān)蛋白、Abl相互作用蛋白和p21活化激酶[2]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3蛋白將EphrinB信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，通過EphrinB反向信號(hào)傳導(dǎo)參與到細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的EC和周細(xì)胞的組裝過程中。其二，含PDZ的蛋白質(zhì)被募集到EphrinB2的PDZ結(jié)合基序上，用于介導(dǎo)磷酸化無關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)，這對(duì)于血管生成過程以及新生血管的穩(wěn)定非常重要[2]。含PDZ蛋白質(zhì)的G蛋白信號(hào)調(diào)控因子和蓬亂蛋白2可能與依賴PDZ的EphrinB2反向信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[2]。含PDZ蛋白質(zhì)的G蛋白信號(hào)調(diào)控因子可能通過調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)通路來介導(dǎo)EphrinB2反向信號(hào)傳導(dǎo)，但是EphrinB2反向信號(hào)介導(dǎo)血管生成的準(zhǔn)確機(jī)制還需進(jìn)一步地研究。

1.4 Eph/ephrin信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的串?dāng)_

Eph/ephrin信號(hào)通路參與腫瘤血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的關(guān)鍵過程。通過腫瘤細(xì)胞-血管細(xì)胞相互作用和血管細(xì)胞中受體非依賴性的Ephrin功能，EphrinB2和EphB4調(diào)節(jié)腫瘤新血管的形成[9]。通過傳導(dǎo)腫瘤血管生成信號(hào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor rcceptor,VEGFR)的受體VEGFR2和VEGFR3，EphrinB2可調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)和血管形成[9]。

在缺血性心臟病中，DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信號(hào)通路都會(huì)與Eph/ephrin信號(hào)通路發(fā)生串?dāng)_且影響血管的新生。通過VEGF誘導(dǎo)DLL4/Notch是新生血管形成中必不可少的途徑，且可選擇性地促進(jìn)EphrinB2的表達(dá)[10]。VEGF通過PI3K/Akt途徑激活叉頭框轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)DLL4-Notch信號(hào)傳導(dǎo)[10]。Notch信號(hào)通過轉(zhuǎn)錄介質(zhì)RBPJ蛋白參與EphrinB2的表達(dá)[7]。通過阻斷DLL4和使用可溶性EphrinB2治療，誘導(dǎo)心臟中非功能性血管的生成，進(jìn)而增加血管密度。

2 Eph信號(hào)與血管生成

2.1 Eph信號(hào)在心臟血管發(fā)育中的作用

EphrinB2是Eph/ephrin家族在心臟發(fā)育中非常重要的成員。EphrinB2全基因敲除小鼠會(huì)在胚胎期的第11.5天死亡，該類小鼠的心臟經(jīng)觀察后發(fā)現(xiàn)有心臟循環(huán)不完全、心內(nèi)膜擴(kuò)張失敗和心肌小梁形成缺陷等問題[11]。敲除EphrinB2的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域(抑制EphrinB2反向信號(hào))導(dǎo)致的小鼠死亡率與EphrinB2整體敲除的無差異，說明在心臟早期發(fā)育的過程中EphrinB2是傳導(dǎo)反向信號(hào)的配體；而敲除EphrinB2的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域后注射β半乳糖則可使小鼠胚胎發(fā)育完全且正常出生，這表明EphrinB2突變蛋白保留了表面結(jié)合活性且可介導(dǎo)正向信號(hào)傳導(dǎo)。由此可見EphrinB2的雙向傳導(dǎo)都參與胚胎期的心臟發(fā)育過程[12]。

在心臟血管發(fā)育過程中，EC與其他支持細(xì)胞通過自分泌和旁分泌形式激活EphrinB2的雙向傳導(dǎo)[13]。EphrinB2參與VEGF信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)發(fā)育性血管生成，參與方式是通過EphrinB2依賴于PDZ的反向信號(hào)調(diào)控EC中VEGF的受體VEGFR2和VEGFR3[14]。EphB4也能通過磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶調(diào)節(jié)VEGFR2信號(hào)傳導(dǎo)。

2.2 Eph/ephrin信號(hào)在缺血性心臟損傷后血管生成中的作用

血管重建可治療心肌梗死和缺血再灌注損傷，且促進(jìn)受損的心肌恢復(fù)[15]。新血管的生成有以下三種方式：通過出芽的方式從先前存在的血管中生成毛細(xì)血管，由內(nèi)皮祖細(xì)胞生成新血管和由小側(cè)支動(dòng)脈形成血管。

EphrinB2和EphB4可促進(jìn)小鼠心肌梗死模型中功能性新血管的生成，但EphrinB2在體外培養(yǎng)的EC中的過度表達(dá)則無法導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能的改變[16]。因此使用EphrinB2-Fc(重組小鼠EphrinB2蛋白)可能成為促進(jìn)缺血性心血管疾病早期血管新生的有效途徑。在培養(yǎng)的人主動(dòng)脈EC中，EphrinB2-Fc可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；在小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管生成模型中，EphrinB2-Fc可誘導(dǎo)出芽式血管形成；小鼠心肌梗死后梗死區(qū)的EC增殖加速，在用EphrinB2-Fc治療后EC增殖速度更快[17]。在結(jié)扎小鼠左前降支動(dòng)脈誘發(fā)心肌梗死模型后的第2天開始每天腹腔注射EphrinB2-Fc 20 μg/25 g，分別取14 d和28 d的小鼠心臟進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)14 d的小鼠心臟在心肌中檢測(cè)出EC有絲分裂增加；28 d的小鼠梗死周圍的毛細(xì)血管密度增加28%，達(dá)到未梗死區(qū)域相同的水平[17]。

EphrinA1蛋白和EphA受體在心肌梗死后血管生成中也有顯著作用。由腫瘤壞死因子-α、白介素-1β和VEGF誘導(dǎo)EphrinA1通過整合素αvβ3刺激EC黏附和細(xì)胞骨架改變，最終引起舊血管的不穩(wěn)定[18-19]。VEGF和腫瘤壞死因子-α也通過誘導(dǎo)EphA1的表達(dá)，引起EC遷移和血管生成。而在心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞中EphrinA1的表達(dá)量增加。通過在永久性冠狀動(dòng)脈閉塞小鼠模型的心肌中注射EphrinA1-Fc可顯著調(diào)節(jié)Eph受體的mRNA表達(dá)變化：EphA1的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致梗死面積的減少[20]。通過阻塞冠狀動(dòng)脈左前降支30 min制作小鼠的缺血再灌注模型，結(jié)扎后立刻在梗死的邊緣注射EphrinA1-Fc，使梗死面積比對(duì)照組減少46%，蛋白代謝水平得以恢復(fù)正常，心臟能正常運(yùn)行[20]。對(duì)小鼠的缺血再灌注模型使用EphrinA1-Fc的優(yōu)異表現(xiàn)說明外源性給予EphrinA1-Fc起到的心臟保護(hù)作用可能是以后心肌梗死的有效治療方式。

3 Eph/ephrin信號(hào)潛在的治療方式

3.1 蛋白酶分解EphrinB家族配體

EphinB家族配體(EphrinBs)的蛋白酶調(diào)節(jié)對(duì)于發(fā)育和疾病具有廣泛的意義。特異性蛋白酶的阻斷可能是抑制異常的EphrinBs功能的有效方法。使用蛋白酶將EphrinBs的胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域分離，從而避免與Eph相互作用[21]。其中去整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)家族的蛋白酶ADAM10，可在細(xì)胞外裂解EphrinB2，而ADAM8和ADAM13可裂解其他EphrinBs[22]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶也可胞外裂解EphrinBs。通過與EphBs的相互作用，基質(zhì)金屬蛋白酶8裂解EphrinB1作用得到增強(qiáng)[22]。這些EphrinBs胞外域的蛋白水解片段保留了與EphBs的結(jié)合活性，還具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、血管生成和心肌纖維化的功能。另外γ分泌酶分解EphrinB2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可使EphrinB2反向信號(hào)得到增強(qiáng)[22]。

3.2 重組細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和抗體

Eph/ephrins的重組細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain，ECD)已被廣泛地研究，作為可溶性替代物激活和抑制雙向信號(hào)傳導(dǎo)[23]。EphrinB2-Fc可通過激活EphB正向信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)血管生成[23]。ECD與Fc結(jié)構(gòu)域或白蛋白的偶聯(lián)可進(jìn)一步延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期[23]。將EphrinB2 ECD與仿生纖維蛋白載體共價(jià)偶聯(lián)，可實(shí)現(xiàn)EphrinB2的靶向傳遞[24]。這種靶向傳遞可使得局部血管得以重建，促進(jìn)其局部治療性血管的生成[24]。近年來，新型的EphrinB2 ECD可溶性生物聚合物及EphrinAs ECD納米顆粒被制備出來，這些納米級(jí)技術(shù)可在靶細(xì)胞中準(zhǔn)確調(diào)節(jié)Eph/ephrin信號(hào)傳導(dǎo)，這在新興的納米療法中具有廣闊的前景[24]。

雖然EphrinB2 ECD可作為可溶性配體激活EphBs，但可溶性的EphB4(soluble EphB4,sEphB4)ECD及其優(yōu)化形式sEphB4-HAS(將人血清白蛋白和sEphB4融合)可抑制EphB4/ephrinB2雙向信號(hào)[22]。由于EphB4/ephrinB2雙向信號(hào)被抑制，體外EC會(huì)發(fā)生功能障礙以及體內(nèi)治療性血管重建無法正常運(yùn)行。因此，sEphB4可用于抗血管生成治療和抑制EphrinB2反向信號(hào)。此外，特異性靶向EphrinB2和EphB4的抑制性抗體在抑制血管生成以及治療腫瘤方面有較高的療效[25]。

4 總結(jié)與展望

Eph/ephrin信號(hào)通路作為心臟發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控途徑，在缺血性心臟病的病理生理過程和治療策略研究中具有重大意義。目前對(duì)其治療缺血性心臟病的研究還停留在臨床前研究階段。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過外源性地給予EphrinB2-Fc和EphrinA1-Fc等可促進(jìn)心臟中的血管生成。通過基質(zhì)金屬蛋白酶、ADAM和γ分泌酶等裂解EphrinB，合成Ephrin或Eph重組ECD，將為調(diào)控Eph/ephrin信號(hào)治療缺血性心臟病提供潛在方法。