張 群，王 騫，郭銘暉，王 碩，李雁冰，黃大鵬，魏國(guó)生，李井春 *

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

現(xiàn)如今，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們生活水平的提高，全球各地對(duì)優(yōu)質(zhì)肉、蛋、奶的需求急劇上升。在自然繁殖過(guò)程中，動(dòng)物后代的雌雄比例大概在1：1。但是實(shí)際生產(chǎn)中，奶牛場(chǎng)需要更多的母畜[1]，不同性別的家畜的肉品質(zhì)量差異也很大[2]，性別不符合生產(chǎn)需要的幼畜就會(huì)被淘汰，這大大影響了大型畜牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，如果能通過(guò)性別控制技術(shù)選育后代，就能大幅提升飼養(yǎng)場(chǎng)收益，更好地滿足社會(huì)需求[3]。

性別控制是根據(jù)XY精子的運(yùn)動(dòng)能力、抗原性、酸堿的敏感程度等差異，控制母畜繁殖生產(chǎn)的后代性別符合人們的預(yù)期。早在公元前400年前的古希臘就有哲學(xué)家提出了是否可以通過(guò)切掉男性一側(cè)睪丸控制產(chǎn)生后代的性別的設(shè)想。1902年，科學(xué)家Mc Clung首次提出了染色體理論。1923年，Painter在實(shí)驗(yàn)中證明了精子中存在兩種控制性別的染色體，分別為X和Y，與卵子結(jié)合會(huì)發(fā)育成不同性別的后代[4]。

實(shí)現(xiàn)性別控制意義非凡。首先，可以提高大型養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，增加所需性別后代的比例。其次，減少伴性遺傳的疾病在后代中發(fā)生。最后，在胚胎移植技術(shù)中，應(yīng)用性別控制技術(shù)可以避免或減少異性雙胎導(dǎo)致的不孕等問(wèn)題。但由于家畜品種、品系和個(gè)體之間的差異很大，想要實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度難度很大。

1 性別控制方法

從20世紀(jì)70年代后期開始，人們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中嘗試調(diào)節(jié)母畜的生殖道環(huán)境，使用化學(xué)試劑或是激素等處理激素，希望能夠提高所需性別的精子與卵子結(jié)合的概率。生殖道不同的酸堿環(huán)境可以抑制X精子或Y精子與卵子結(jié)合。這種方法準(zhǔn)確率并不高，但是由于操作簡(jiǎn)單便捷，價(jià)格較低，因此使用范圍也比較廣泛。在不同溫度解凍精液，母畜生產(chǎn)的后代性別也有不同。XY精子在對(duì)溫度的敏感程度也存在差異。因此，不同的解凍溫度使精子的運(yùn)動(dòng)能力和復(fù)蘇時(shí)間也不同。在是實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)用更多的是流式細(xì)胞儀，這種方法準(zhǔn)確度高，有很好的應(yīng)用價(jià)值。

1.1 流式細(xì)胞儀

X精子和Y精子在基因含量上差別很大，X精子上的基因數(shù)量超過(guò)3 000個(gè)，但Y上的基因則少于700，流式細(xì)胞儀根據(jù)這種差別對(duì)精子進(jìn)行篩選[5]。1976年Gledhill等人首先利用流式細(xì)胞儀測(cè)定X精子和Y精子的DNA。1986年Johnson和Pinkel改良了普通的流式細(xì)胞儀，使其專門適用于分離活精子，并采用這種方法分離了牛、豬、羊和兔子等幾種動(dòng)物的精液[6]。

首先對(duì)精液進(jìn)行稀釋處理，然后使用熒光染色劑染色，由于X、Y精子攜帶的DNA數(shù)量不同，染色的程度也不同，因此經(jīng)過(guò)激光照射后根據(jù)熒光強(qiáng)度不同被賦予不同電荷。在電磁場(chǎng)的引導(dǎo)下，帶不同電荷的精液微小液滴分別落入不同的收集容器中[7]。隨著科技水平的發(fā)展，研究人員們也在不斷對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行改良，包括對(duì)儀器的噴嘴，調(diào)整電磁場(chǎng)強(qiáng)度和與電壓結(jié)合調(diào)整等。如今，經(jīng)過(guò)調(diào)整后的流式細(xì)胞儀分離準(zhǔn)確度能夠達(dá)到90%左右[8]，是一種效率較高較為準(zhǔn)確的分離方法，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功地在實(shí)際生產(chǎn)中實(shí)施。在奶牛[9]后代選育過(guò)程中應(yīng)用較多，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，但在養(yǎng)豬行業(yè)內(nèi)使用比較少。2006年曾有權(quán)[10]使用經(jīng)流式細(xì)胞儀分離后的精液為母豬受精，輸入Y精子的母豬生產(chǎn)6頭仔豬，全部為雄性；輸入X精子的3頭母豬分別產(chǎn)下5頭、4頭、3頭仔豬，性別準(zhǔn)確率為91.67%。仔豬初生重、斷奶重和平均日增重都很正常。流式細(xì)胞儀分離技術(shù)在其他種類的動(dòng)物中的應(yīng)用也很多，包括奶山羊[11]，兔子和工作犬[12]等。流式細(xì)胞儀作為現(xiàn)今為止最準(zhǔn)確可靠的精子分離方法[13]，在培育優(yōu)良種畜進(jìn)程中起到不可或缺的作用。但是，流式細(xì)胞儀設(shè)備比較昂貴，分離成本較高，導(dǎo)致性控精液的價(jià)格也很高，并且有實(shí)驗(yàn)表明，豬精子對(duì)所處環(huán)境變化非常敏感，在經(jīng)流式細(xì)胞儀分離的過(guò)程中，染色和熒光照射的過(guò)程會(huì)對(duì)豬精子造成損傷[14]。

1.2 基因干擾法

X染色體偶聯(lián)鋅指蛋白（zin f inger protein, X-linked, Zfx）是一種決定睪丸基因的候選基因。Zfx和Zfy是一對(duì)等位基因，分別位于哺乳動(dòng)物的X和Y染色體上。由于含有鋅指結(jié)構(gòu)，可以選擇性結(jié)合特異靶基因，指引靶基因穿透細(xì)胞核膜，在核內(nèi)定位，在精子形成過(guò)程中發(fā)揮作用。

基因干擾是指在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中人為對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行干擾，使某一片段沉默，阻斷在體內(nèi)的表達(dá)。在家畜性別控制實(shí)驗(yàn)中，可以利用此項(xiàng)原理，干擾Zfx基因在體內(nèi)的表達(dá)，使X精子發(fā)育情況受阻或者降低X精子的活性、影響其受精能力，以此獲得較高的雄性后代[15]。寧孟影[16]實(shí)驗(yàn)中，篩選出3個(gè)效果較好的骨架載體，其中pll3.7/d重組表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)效果最佳，雄性仔豬率在69.9%。唐璐[17]在干擾豬Zfx基因?qū)δ肛i繁殖性能調(diào)控實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PLL3.7/N載體最有效注射量為1.5 mg/側(cè)，最佳注射次數(shù)是3針，性控有效時(shí)間從第2針開始，效果可持續(xù)2個(gè)月，在1個(gè)月內(nèi)配種的效果最好。產(chǎn)下的仔豬健康狀況良好，初生重和斷乳重等指標(biāo)都沒(méi)有不良影響。

1.3 其他分離方法

在哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體Y染色體上有一基因位點(diǎn)H-Y，其結(jié)構(gòu)基因與睪丸的關(guān)系密切，只要形成睪丸細(xì)胞就可以分泌睪丸素，從而抑制個(gè)體發(fā)育成雌性。使H-Y抗原對(duì)雌性動(dòng)物發(fā)生免疫，在雌性動(dòng)物的血清中就會(huì)產(chǎn)生排斥Y精子的抗體，抑制Y精子的基因表達(dá)。免疫分離法就是根據(jù)XY精子細(xì)胞膜上存在蛋白抗原不同，開發(fā)出具有針對(duì)性的特異性抗體，在引用其他技術(shù)（如流式細(xì)胞儀）將不同的精子分離開[18]。在不同物種個(gè)體差異比較大，分離的準(zhǔn)確度還有待提高，但免疫分離法相比于流式細(xì)胞法操作更簡(jiǎn)單快捷，性價(jià)比很高，值得我們進(jìn)行更深入地討論和研究[1]。

2 問(wèn)題與展望

實(shí)現(xiàn)早期性別選擇和鑒定是現(xiàn)代化家畜育種行業(yè)一直在突破的難題，近年來(lái)在技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)取得了很多突破性進(jìn)展，但仍存在著許多挑戰(zhàn)和阻礙。流式細(xì)胞儀作為現(xiàn)在準(zhǔn)確性最高的技術(shù)手段，在牛羊生產(chǎn)中使用的較多。并且由于在操作過(guò)程中對(duì)豬精子的刺激較大，設(shè)備昂貴，分離時(shí)間較長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題也制約了此項(xiàng)技術(shù)的在豬生產(chǎn)中大面積普及。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，又有更多新興技術(shù)運(yùn)用到性別控制技術(shù)中，如TLR-7/8受體可以調(diào)控精子的運(yùn)動(dòng)能力使其顯現(xiàn)差異，還有文章中介紹的制備H-Y特異抗體方法在各實(shí)驗(yàn)中顯示的結(jié)果也較好，但在豬生產(chǎn)中性別控制方面應(yīng)用還比較少。這些新型便捷的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)整個(gè)畜牧業(yè)的育種選種進(jìn)展都有積極的促進(jìn)作用，為今后的實(shí)驗(yàn)提供有力的支撐。