火腿微生物發(fā)酵劑研究進(jìn)展

趙婧含鞠銘孫德鵬董微巍樸春香

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002)

西式發(fā)酵火腿是以豬后腿肉為原料，通過(guò)不同技術(shù)進(jìn)行腌制，再經(jīng)過(guò)干燥(煙熏或不煙熏)達(dá)到成熟后制成的肉制品。這種類型的火腿具有穩(wěn)定的色澤、典型的芳香氣味和緊實(shí)的質(zhì)地，可以直接食用。西式發(fā)酵火腿種類繁多，不同品牌火腿的生產(chǎn)技術(shù)和感官屬性也大不相同，而風(fēng)味是影響火腿整體接受度的一個(gè)關(guān)鍵因素，其受到火腿原料、加工技術(shù)和成熟時(shí)間的顯著影響。火腿是經(jīng)過(guò)發(fā)酵和長(zhǎng)時(shí)間的成熟生產(chǎn)出來(lái)的。6～30個(gè)月的成熟期促進(jìn)了西式發(fā)酵火腿典型風(fēng)味的形成[1]。其中的風(fēng)味化合物主要來(lái)源于蛋白水解、脂解、糖酵解和次生代謝產(chǎn)物。西式發(fā)酵火腿中蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，蛋白質(zhì)被微生物轉(zhuǎn)化為多肽，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為各種氨基酸。氨基酸被確定為許多揮發(fā)性化合物的前體，包括發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酮、醛、醇、酸、酯、烯烴和烷烴。源于支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨作用的風(fēng)味化合物(BCAAs，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)因其類型復(fù)雜、豐度高和風(fēng)味閾值低而受到關(guān)注，這突出了其在發(fā)酵肉風(fēng)味發(fā)展中的重要作用。在肉制品中，支鏈醛類是最豐富的風(fēng)味化合物，包括通過(guò)亮氨酸的轉(zhuǎn)氨基作用和α-酮基異抑肽酶的進(jìn)一步脫羧作用產(chǎn)生的3-甲基丁醛。因此，在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，提高支鏈氨基酸衍生的揮發(fā)性化合物對(duì)發(fā)酵肉的風(fēng)味至關(guān)重要。發(fā)酵肉成熟過(guò)程中的分解代謝主要是由微生物氨基轉(zhuǎn)移酶的作用引起的。包括乳酸菌(LAB)在內(nèi)的許多微生物參與了亮氨酸向3-甲基丁醛的轉(zhuǎn)化。

發(fā)酵劑是指活的或休眠狀態(tài)的微生物制劑，理想的發(fā)酵劑在促進(jìn)肉制品發(fā)酵的同時(shí)，還起著抑菌防腐、保證質(zhì)量的作用，且能產(chǎn)生良好的代謝活性，從而改善發(fā)酵肉制品的感官品質(zhì)[2]。自然發(fā)酵肉制品的歷史悠久，1940年，詹森和帕多克開(kāi)始使用乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵香腸，乳酸菌可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和其它香氣化合物[3]。葡萄球菌是近年來(lái)使用最廣泛的微生物發(fā)酵劑[4]，凝固酶陰性葡萄球菌是發(fā)酵產(chǎn)品中通過(guò)降解支鏈氨基酸和脂肪酸而形成顏色和風(fēng)味所必需的[5]，其能夠迅速減弱肉制品的產(chǎn)酸能力，縮短發(fā)酵成熟期，抑制肉的腐爛和致病微生物的繁殖，從而提高產(chǎn)品品質(zhì)。毫無(wú)疑問(wèn)，接種發(fā)酵劑是以較短的發(fā)酵時(shí)間和高質(zhì)量生產(chǎn)安全產(chǎn)品的重要工具。目前，微生物在肉制品中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而且在成熟過(guò)程中，微生物對(duì)火腿風(fēng)味的形成有促進(jìn)作用[6]。因此，本文總結(jié)了不同微生物發(fā)酵劑在火腿發(fā)酵中的應(yīng)用，以期通過(guò)加入微生物來(lái)改善火腿的風(fēng)味，為火腿生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 不同微生物發(fā)酵劑在火腿發(fā)酵中的應(yīng)用

1.1 凝固酶陰性葡萄球菌

由于凝固酶陰性葡萄球菌是生腿腌制后自生菌群的一部分，因此很可能成為火腿發(fā)酵劑中的候選者。一些凝固酶陰性葡萄球菌，如肉葡萄球菌(S.carnosus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)，作為發(fā)酵肉制品中的發(fā)酵劑具有悠久的歷史[7,8]，其在火腿發(fā)酵過(guò)程中可以改善色澤并產(chǎn)生香氣。這些積極的影響是由于不同的代謝活動(dòng)(如硝酸鹽還原和蛋白水解)所引起的，其通常也能夠在高鹽濃度下生長(zhǎng)。與木糖葡萄球菌和馬胃葡萄球菌(S.equorum)相比，S?ndergaard和Stahnke[9]研究的肉葡萄球菌菌株比這2個(gè)物種的耐鹽性更高。研究表明，某些肉葡萄球菌能夠在氯化鈉濃度為15%～20%的條件下生長(zhǎng)[10]。

在腌制的生腿上或在火腿加工使用中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)主要菌種是木糖葡萄球菌(S.xylosus)和馬胃葡萄球菌(S.equorum)。盡管木糖葡萄球菌以香腸模型系統(tǒng)中的香氣產(chǎn)生而聞名，但尚無(wú)關(guān)于將木糖葡萄球菌用作火腿中單一菌株發(fā)酵劑培養(yǎng)物的研究報(bào)道。Sánchez Molinero和Arnau[11]進(jìn)行的火腿實(shí)驗(yàn)中使用的木糖葡萄球菌是市售發(fā)酵劑的一部分。在火腿中作為微生物發(fā)酵劑的馬胃葡萄球菌也很少見(jiàn)，Hammes和Hertel[12]則認(rèn)為,馬胃葡萄球菌適合作為火腿發(fā)酵劑，因?yàn)樵撐锓N的菌株可以在低于10℃的溫度下生長(zhǎng)良好。發(fā)酵劑的使用始于添加微球菌屬和葡萄球菌屬(凝固酶陰性球菌——CNC)菌株，使得顏色更好，降低pH值，抑制病原微生物，降低工藝的經(jīng)濟(jì)要求，并對(duì)火腿的風(fēng)味和顏色作出了積極貢獻(xiàn)。

1.2 乳酸菌(LAB)

作為大多數(shù)肉類加工所使用發(fā)酵劑的一部分，在一些研究中已經(jīng)測(cè)試了乳桿菌屬并將其用于火腿發(fā)酵。乳酸菌能代謝碳水化合物主要產(chǎn)生乳酸，以及少量乙酸、二乙酰。還可產(chǎn)生肽酶和氨肽酶以及通過(guò)降低pH提高組織蛋白酶的活性，從而直接或間接參與蛋白質(zhì)降解。Toledano等[13]研究了11種市售乳酸菌菌株對(duì)豬肉肌球蛋白的水解能力，用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)水解是否影響西式發(fā)酵火腿的最終風(fēng)味；提出嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)可以作為候選發(fā)酵劑，顯示出了對(duì)肌球蛋白的高水解活性。Alicia Rodriguez等[14]在西式發(fā)酵火腿表面使用商業(yè)發(fā)酵劑，除了葡萄球菌和霉菌外，還包括沙克乳桿菌和戊糖乳桿菌(L.pentosus)菌株，以研究發(fā)酵劑對(duì)氣味、風(fēng)味和外觀的影響；其認(rèn)為加入發(fā)酵劑處理的西式發(fā)酵火腿存在感官特性的差異，改善了火腿的風(fēng)味。Md.Kauser-Ul-Alam等[15]研究LAB作為發(fā)酵劑代替亞硝酸鹽改善肉制品色澤，對(duì)其在不同條件下的表型特性進(jìn)行了研究。在乳酸菌中，片球菌屬和乳桿菌屬菌株已被廣泛研究并用作發(fā)酵劑，如乳酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、薩基乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、戊糖乳桿菌和干酪乳桿菌。此外，乳酸菌還可以用作其它腌肉制品的發(fā)酵劑。

1.3 霉菌和酵母菌

脂解和蛋白質(zhì)水解的過(guò)程會(huì)提高火腿的感官質(zhì)量[16,17]。據(jù)報(bào)道，普通青霉(P.commune)、產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)、納地青霉(P.nalgiovense)和枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)菌株顯示出高脂解和蛋白水解活性，被認(rèn)為可以增強(qiáng)最終產(chǎn)品的典型風(fēng)味。

為了篩選適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵劑，Ockerman等[18]從西班牙火腿表面分離出5株青霉屬菌株，并在肉模型中測(cè)試了風(fēng)味。黃灰青霉(P.aurantiogriseum)和沙門(mén)柏青霉(P.camemberti)菌株在3～8℃的范圍內(nèi)提高了火腿的風(fēng)味品質(zhì)，但超過(guò)12℃時(shí)風(fēng)味品質(zhì)降低。這些結(jié)果有力地表明，不同揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生依賴于菌株。Andrade等[19]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，其從伊比利亞火腿中分離出117種酵母菌株，主要是漢遜德巴利酵母(D.hansenii)和涎沫念珠菌(C.zeylanoides)，并比較了體外58種揮發(fā)性化合物的產(chǎn)量，在未接種的對(duì)照品與漢遜德巴利酵母和涎沫念珠菌的接種批次之間，檢測(cè)到揮發(fā)性化合物(支鏈醛、醇和酮)的含量差異。有人建議將漢遜德巴利酵母的2種生物型作為火腿發(fā)酵劑中的主要微生物，因?yàn)槠鋵?duì)西式發(fā)酵火腿的風(fēng)味化合物的產(chǎn)生有很大影響，如3-甲基丁醛[20]。在豬里脊肉中測(cè)試了產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)和漢遜德巴利酵母(D.hansenii)對(duì)蛋白水解過(guò)程和揮發(fā)性化合物形成的影響。與漢遜德巴利酵母相反，產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)對(duì)肌原纖維蛋白具有蛋白水解活性，并導(dǎo)致氨基酸分解及其代謝衍生化合物的增加，如羧酸和支鏈醛。漢遜德巴利酵母的應(yīng)用能夠產(chǎn)生更高濃度的環(huán)醇和芳香醇。Rodríguez等[21]對(duì)伊比利亞干腌火腿中分離出來(lái)的微生物蛋白水解酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉對(duì)干腌肉制品中蛋白質(zhì)的水解起重要作用，能顯著提高火腿中游離氨基酸的含量。多數(shù)霉菌在人工培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生霉菌毒素，因此霉菌發(fā)酵劑需驗(yàn)證安全無(wú)毒后方可應(yīng)用，產(chǎn)黃青霉和納地青霉是常用的不產(chǎn)毒霉菌發(fā)酵劑[22]。

1.4 混合菌種發(fā)酵劑

目前，乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌被認(rèn)為是肉類發(fā)酵中2種重要的細(xì)菌，其抗菌代謝產(chǎn)物(包括有機(jī)酸、溶菌酶和過(guò)氧化氫)是抑制病原菌的最重要因素[23]。凝固酶陰性葡萄球菌有助于抑制脂質(zhì)氧化和亞硝酸鹽肌肉蛋白的形成，促進(jìn)硝酸鹽的還原能力[24]。有些葡萄球菌也參與了蛋白水解和脂解，如金黃色葡萄球菌。在發(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)水解決定了發(fā)酵肉的感官和營(yíng)養(yǎng)特性[25-29]。近十年來(lái)的許多研究表明，蛋白質(zhì)水解不僅與內(nèi)源酶的活性有關(guān)，還與某些細(xì)菌群有密切聯(lián)系，如葡萄球菌[30-32]。葡萄球菌在肉類發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)分解受到乳酸菌的影響[33]。因此，在篩選多菌種發(fā)酵劑時(shí)，應(yīng)考慮乳酸菌和葡萄球菌之間的協(xié)同作用[34]。

Tremonte等[35]認(rèn)為，葡萄球菌和肺炎鏈球菌混合培養(yǎng)比單一培養(yǎng)葡萄球菌效果更好?；旌习l(fā)酵過(guò)程中微生物的相互作用以及葡萄球菌蛋白水解能力對(duì)發(fā)酵質(zhì)量的影響尤為重要。從傳統(tǒng)肉制品中分離的微生物有望成為肉類發(fā)酵的候選菌種，其對(duì)肉中的環(huán)境有很好的適應(yīng)性[36]。從自然發(fā)酵中分離出來(lái)的乳酸菌和葡萄球菌可以根據(jù)特定的代謝活性提供獨(dú)特的誘人香味[37-39]。王永霞等[40]從20多種傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中分離出菌株198株，并篩選出2株過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性球菌，初步鑒定為肉糖葡萄球菌(StapHylococcus carnosus)S15和S113，并研究了戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P20、米酒乳桿菌(Lactobacillus sake)J17分別同2株葡萄球菌在模擬肉湯中混合培養(yǎng)的相互關(guān)系，初步確定了混合肉品發(fā)酵劑P20加 J17可以改善火腿的品質(zhì)。在Schlafmann等[41]的研究中，將馬胃葡萄球菌與嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus halophilus)結(jié)合用于西式發(fā)酵火腿模型系統(tǒng)中，總體上改善了火腿品質(zhì)并減少金黃色葡萄球菌的數(shù)量。在Black Forest火腿的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合菌種實(shí)現(xiàn)了顏色的改善，并且金黃色葡萄球菌的數(shù)量減少了3～5log cfu·g-1。Chen等[42]還研究了3種乳酸菌(戊糖乳桿菌、彎曲乳桿菌和薩凱乳桿菌)和1種葡萄球菌(木糖乳桿菌)對(duì)發(fā)酵肉制品中脂類和蛋白質(zhì)氧化水解的影響。研究結(jié)果表明，細(xì)菌發(fā)酵可以抑制肉中蛋白質(zhì)和脂類的氧化，促進(jìn)肉中蛋白質(zhì)和脂類的水解，從而改善其風(fēng)味和感官品質(zhì)。

2 微生物發(fā)酵劑對(duì)火腿安全性的影響

有學(xué)者將有硝酸鹽還原酶活性的凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)或微球菌添加到西式發(fā)酵火腿中，該菌使火腿中的NO3-還原為NO2-。研究表明，具有高硝酸還原酶活性的微生物可以彌補(bǔ)火腿顏色缺陷和降低生火腿產(chǎn)品中殘留的硝酸鹽含量[43]。在Bosse等[44]的研究中，將2種不同的肉葡萄球菌用作北歐火腿的發(fā)酵劑，以研究其不同的硝酸還原酶活性以及對(duì)最終產(chǎn)品的顏色形成、硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響。1株LTH 7036菌種在體外顯示出較高的硝酸鹽還原能力，另1株LTH 3838菌種卻相反。同樣，在火腿內(nèi)部也觀察到了這些影響，接種LTH 7036的火腿比接種LTH 3838的火腿產(chǎn)生更高的亞硝酸鹽含量和更低的硝酸鹽含量，LTH 3838菌株在體外還具有針對(duì)肌漿蛋白的水解活性。Héquet等[45]在火腿中對(duì)比使用了產(chǎn)細(xì)菌素的清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)2512 和不產(chǎn)細(xì)菌素的清酒乳桿菌L110，雖然二者有相似的培養(yǎng)基酸化速率，但產(chǎn)細(xì)菌素的處理組中英諾克李斯特菌(Listeria innocua)的數(shù)量更低，且整個(gè)貯藏期60d內(nèi)目標(biāo)菌株均未顯著生長(zhǎng)。Ramaroson等[46]發(fā)現(xiàn),在接種乳酸菌的火腿中除精胺外的生物胺產(chǎn)量極少，這也可能包括了肉中自然存在的精胺。

霉菌和酵母菌的應(yīng)用有時(shí)也能有助于提高產(chǎn)品的安全性。Rodríguez等[47]在伊比利亞火腿上施用了產(chǎn)黃青霉RP42C，結(jié)果表明，減少了產(chǎn)生OTA的霉菌數(shù)量。這些發(fā)現(xiàn)也得到了其它研究的證實(shí)。如，Comi[48]和Iacumin將霉菌和酵母菌，如納地青霉(P.nalgiovense)、季也蒙假絲酵母(C.guilliermondii)和扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)應(yīng)用于火腿的表面，同時(shí)接種產(chǎn)毒霉菌，結(jié)果顯示，其有效地阻止了產(chǎn)OTA霉菌的生長(zhǎng)，從而抑制毒素的產(chǎn)生。Virgili等[49]還用分離自意大利發(fā)酵火腿的12種酵母菌株在體外進(jìn)行研究，即使通過(guò)增加真菌接種量具有降低酵母拮抗作用的潛力，但氯化鈉的存在卻起到增強(qiáng)作用。在另一項(xiàng)研究中，Simoncini等[50]研究了漢遜德巴利酵母78菌株、馬拉馬氏酵母(D.marama)51菌株和伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichia burtonii)120菌株在肌肉中的繁殖能力；發(fā)現(xiàn)漢遜德巴利酵母(D.hansenii)78菌株、馬拉馬氏酵母51菌株均能夠在肌肉中穩(wěn)定繁殖，而馬拉馬氏酵母51菌株最能滿足作為微生物發(fā)酵劑的要求，由于伯頓絲孢畢赤酵母120菌株不能在意大利發(fā)酵火腿的表面繁殖，因此被排除在潛在的發(fā)酵劑之外。

3 微生物發(fā)酵劑的生存方式

在食品系統(tǒng)中應(yīng)用微生物發(fā)酵劑時(shí)會(huì)面臨2個(gè)挑戰(zhàn)，即引入的方式；發(fā)酵劑是否能夠在給定加工條件的食品系統(tǒng)中生存并進(jìn)行所需的代謝活動(dòng)。盡管發(fā)酵劑適用于肉類發(fā)酵，但到目前為止，其應(yīng)用主要局限于發(fā)酵香腸。將其與香腸肉混合可以很容易地引入，而在火腿中，則必須將其引入整個(gè)肌肉系統(tǒng)并且不會(huì)破壞火腿的質(zhì)地結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^(guò)在火腿表面涂抹或噴霧的形式添加發(fā)酵劑，驗(yàn)證微生物是否能進(jìn)入肌肉內(nèi)部，在不同的研究中已經(jīng)有學(xué)者對(duì)這種形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在腌制之前或之后將馬胃葡萄球菌(S.equorum)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus halophilus)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)和干酪乳桿菌(L.casei)摩擦在整個(gè)肉塊的表面上。在最終產(chǎn)品中，乳酸菌主要位于表面，而葡萄球菌則位于內(nèi)部，這表明微生物在整個(gè)肌肉塊都有遷移。在Bosse等[51]的研究中，細(xì)菌遷移到肌肉組織中的有效擴(kuò)散系數(shù)被確定為1.9×10-10～1.1×10-8m2·s-1。除了噴灑之外，在添加了發(fā)酵劑的鹽水中浸泡也可以用于將發(fā)酵劑轉(zhuǎn)移到肉中。浸泡在添加肉葡萄球菌和植物乳桿菌(L.plantarum)的鹽水中，腌制結(jié)束后，從產(chǎn)品中檢測(cè)出該微生物數(shù)量增加。如果要在腌制的生腿內(nèi)部應(yīng)用微生物，則可以通過(guò)注射的方式引入[51]。已經(jīng)有人應(yīng)用該技術(shù)注入肉葡萄球菌、植物乳桿菌(L.plantarum)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、清酒乳桿菌(L.sakei)和變異微球菌(M.Varians)。盡管僅注射就足以將細(xì)菌引入到肉類結(jié)構(gòu)中，但是其它過(guò)程，如翻滾、真空浸漬、真空翻滾和凍融等也有助于其均勻分布。這些操作程序和每一個(gè)不同注射位置都為相應(yīng)的微生物提供了不同的環(huán)境；施加到肌肉內(nèi)部為微生物提供厭氧環(huán)境，而表面微生物則不需要。

北歐風(fēng)格的火腿如果在加工開(kāi)始時(shí)應(yīng)用發(fā)酵劑，則微生物必須能夠在煙熏處理中存活；南歐風(fēng)格的火腿則不需要這個(gè)條件。南歐風(fēng)格的火腿中被經(jīng)常用作表面發(fā)酵劑的霉菌是原生微生物群的一部分，但這種微生物很少在北歐風(fēng)格的火腿中使用。這種差異可能是由煙熏引起的，但到目前為止，尚無(wú)研究調(diào)查煙熏西式發(fā)酵火腿對(duì)表面微生物影響的研究。通常，在腌制過(guò)程中約5℃的低溫會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，因此，要選用微生物發(fā)酵劑，至少可以耐受該溫度，如清酒乳桿菌(L.sakei)。生腿腌制過(guò)程中微生物存活的另一個(gè)障礙是氯化鈉的含量相對(duì)較高，最高可達(dá)5%。因此，用作發(fā)酵劑的微生物必須具有耐鹽性并能適應(yīng)這種特定的腌制條件。

4 結(jié)論與展望

微生物發(fā)酵劑的高產(chǎn)酸和快速降低火腿水分活性的能力，有利于縮短肉制品的發(fā)酵成熟期；而發(fā)酵肉制品的低pH值，不僅能夠抑制細(xì)菌和病原體的生長(zhǎng)以及毒素的產(chǎn)生，還有利于促進(jìn)產(chǎn)品干燥?；鹜壬a(chǎn)中的一些困難，特別是產(chǎn)品安全性的問(wèn)題，可以通過(guò)使用發(fā)酵劑來(lái)解決。但是，由于存在不同的障礙和環(huán)境條件，將生產(chǎn)發(fā)酵香腸使用的發(fā)酵工藝應(yīng)用到火腿生產(chǎn)中并不適用。對(duì)于微生物發(fā)酵劑，引入技術(shù)以及其對(duì)火腿實(shí)際影響的進(jìn)一步研究是非常令人感興趣的。發(fā)酵劑的篩選優(yōu)化也將會(huì)成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)，特別是在混菌發(fā)酵方面，篩選出2種或多種沒(méi)有互補(bǔ)拮抗作用的混合發(fā)酵劑也將成為發(fā)酵肉制品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。