★李龍雪 黃聲宏 徐鐵龍 劉隆霸 顧洲洋 楊志龍 劉志勇（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

衰老是機(jī)體損傷和防御相拮抗的一個(gè)復(fù)雜過程，表現(xiàn)為機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的衰退，以及抵抗力和修復(fù)力的減退。近年來我國人口老齡化程度加深，應(yīng)對老齡化已上升為國家戰(zhàn)略，抗衰研究逐漸成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。

亞精胺是生物體內(nèi)合成的一種代謝物，也見于成熟奶酪、豆類和全谷類等天然食品中。Eisenberg T等［1］研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺通過激活細(xì)胞自噬，延長酵母、蒼蠅、線蟲的壽命，提高人外周血單核細(xì)胞的存活率，降低小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮其有益的作用。Eisenberg T等［2］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠飲用水中添加亞精胺可延長它們的壽命，即使在小鼠已達(dá)中年時(shí)再開始也能產(chǎn)生效果。Liang Y等［3］研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體衰老過程伴隨著大腦線粒體功能的衰退，通過膳食補(bǔ)充亞精胺可改善線粒體呼吸功能和大腦的衰老進(jìn)程。因此，研究通過食源性補(bǔ)充亞精胺是一種安全、可靠的延緩衰老方法。

薏苡仁（coicis semen），為禾本科植物薏苡成熟干燥的種仁，功能利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)。而法薏苡仁是樟幫歷來使用的薏苡仁炮制品, 在《樟樹藥幫中藥傳統(tǒng)炮制法經(jīng)驗(yàn)集成及飲片圖鑒》中有記載, 經(jīng)過了浸制、蒸制和炒制等數(shù)種復(fù)制而成［4-5］，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值以及重要的藥用價(jià)值［6-8］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏苡仁具有抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力，降血脂，鎮(zhèn)痛消炎等作用。薏苡仁經(jīng)過法制的炮制方法后，祛除了寒涼之性，藥性由涼轉(zhuǎn)微溫，更適宜老年人群食用。民間常用作保健抗腫瘤提高免疫力的食材自主食用，探討其對衰老的調(diào)節(jié)作用具有實(shí)際意義。

本研究選用退役雌性SD大鼠，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究炮制后薏苡仁（法薏苡仁）對大鼠機(jī)體物質(zhì)代謝的影響，進(jìn)而探索法薏苡仁延緩衰老的作用，為法薏苡仁的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD雌性大鼠33只，12月齡大鼠23只，體重（310±30）g，2月齡大鼠10只為青年對照組，體重（200±20）g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心提供，合格證號：SCXK（贛）2018-0003。實(shí)驗(yàn)鼠用飼料原粉和墊料統(tǒng)一由湖北萬千佳興有限公司提供。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)在江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心SPF級屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，環(huán)境溫度為20~23 ℃、濕度45 %~55 % ，使用許可號為SYXK（贛）2018-0004。

1.2 藥物法薏苡仁粉由江西景德中藥股份有限公司提供。

1.3 試劑質(zhì)譜級甲醇、乙腈、甲酸購自Anaqua（Wilmington，DE USA）。

1.4 主要儀器高速冷凍臺式離心機(jī)（Allegra X-30R Centrifuge）；Triple TOFTM 5600 型液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司，配備 DuoSprayTM 離子源，30A 型液相色譜系統(tǒng)）；超純水機(jī)（密理博MILLI-Q-Integral 10）。

2 方法

2.1 樣品配制法薏苡仁高劑量組飼料含法薏苡仁3 %（即每加入291.0 g飼料原粉加入法薏苡仁粉9.0 g）；法薏苡仁低劑量組飼料含法薏苡仁0.5 %（即每加入298.5 g飼料原粉加入法薏苡仁粉1.5 g）；青年對照組和衰老模型組飼料僅為飼料原粉。

2.2 動物分組給藥與臨床觀察SPF級SD退役雌性大鼠33只，12月齡大鼠23只，隨機(jī)分為衰老模型組（C）7只、法薏苡仁低劑量組（FL）8只和法薏苡仁高劑量組（FH）8只。2月齡青年對照組大鼠（YC）10只，每天給足量相應(yīng)飼料和水，連續(xù)喂食90 d。期間，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的飲食飲水情況，并觀察毛發(fā)以及各組動物的臨床表現(xiàn)。

2.3 尿液采集與處理給藥90 d后用代謝籠隔夜收集4組大鼠12 h的尿液。第91 d腹腔注射3 %戊巴比妥鈉麻醉解剖。

2.4 UPLC-MS/MS

2.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脫（0~2 min，5 %~10 %；2~15 min，10 %~25 %；15~28 min，25 %~55 %；28~37 min，55 %~95 %；37~40 min，95 %~5 %），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀采用ESI源正負(fù)離子模式檢測，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集時(shí)間為40 min，掃描時(shí)間900 ms,采集范圍m/z100~1 500 Da，霧化氣壓力50 psi，脫溶劑氣壓力50 psi,氣簾氣流（CUR）40 mL/min，脫溶劑氣溫度500 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，去簇電壓（DP）100 V，質(zhì)譜漂移范圍50 mDa，碰撞能（CE）10 V。

2.4.3 樣品前處理取1 mL尿液樣本，3 000 rpm離心10 min，取300 μL上清液加入900 μL乙腈，2 000 rpm渦旋2 min，4 ℃下13 000 rpm離心15 min，吸取1 mL上清液氮?dú)獯蹈?，?00 μL 75 %乙腈復(fù)溶，4 ℃下13 000 rpm離心后，取適量上清液于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行檢測。

2.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，用自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋。使用SIMCA軟件（V16.0.2）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等方法進(jìn)行分析。通過OPLS-DA模型篩選出VIP>1且P<0.05 的差異性代謝物。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)(Student's t-test)比較組間差異，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用斯皮爾曼相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠生長狀態(tài)YC組大鼠皮毛濃密、光滑有光澤，行動靈敏。C組大鼠毛色粗糙、稀松暗淡，少動。較C組大鼠相比，F(xiàn)H和FL組大鼠反應(yīng)較為靈敏。

3.2 代謝組學(xué)方法學(xué)驗(yàn)證QC樣本在PCA-X一維分布圖（圖1A-B），QC樣品全部位于±2 STD之內(nèi)，說明本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

3.3 多元統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)采用正、負(fù)離子模式對4組大鼠尿液樣品的代謝輪廓進(jìn)行比較分析，大鼠尿液QC樣本正、負(fù)離子模式總離子流圖見圖2，QC樣品的聚集性好，檢測系統(tǒng)相對穩(wěn)定，總離子流圖輪廓總體相似。

圖1 大鼠尿液QC樣本在PCA-X一維分布圖

圖2 大鼠尿液的QC樣本總離子流圖

經(jīng)PCA處理得到的得分圖能直觀地顯示出不同干預(yù)條件下各組研究對象代謝輪廓的變化，樣本的聚集代表具有相似的代謝組分，處于相似的生理狀態(tài)。圖3A-B分別是正、負(fù)離子模式下各組大鼠尿液PCA得分圖，由圖可見實(shí)驗(yàn)處理90 d后，根據(jù)大鼠年齡和干預(yù)條件的不同各組樣本間呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，表明各組大鼠體內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化。為進(jìn)一步建立各組間的特異性差異模型，采用OPLS-DA分析方法對各組大鼠尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)展開模式識別，OPLS-DA分析方法能夠更大程度的體現(xiàn)兩組樣本的聚集性和分離性。見圖3C-D，證明衰老組、青年組和法薏苡仁高劑量組大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的變化。

為避免過度擬合，本研究進(jìn)行7倍交互驗(yàn)證和置換檢驗(yàn)（n=200），結(jié)果顯示模型具有較好的穩(wěn)定性且不存在過擬合現(xiàn)象。見圖3E-F。以上結(jié)果表明，本研究建立的模型有效且可用于模型差異標(biāo)志物的篩選。

圖3 大鼠尿液正離子模式PCA圖（A）、負(fù)離子模式PCA圖（B）；YC組與C組，OPLS-DA圖（C），OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖（R2Y：0.993，Q2：0.797）（E）；C組與FH組，OPLS-DA圖（D），OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖（R2Y：1，Q2：0.971）（F）

3.4 衰老模型組與青年對照組大鼠尿液生物標(biāo)志物篩選與YC組相比，C組大鼠尿液正、負(fù)離子模式共鑒定出5個(gè)生物標(biāo)志物，L-犬尿氨酸、硫酸脫氫表雄酮、N8-乙酰亞精胺、花生四烯酸和對甲酚。見表1。

表1 大鼠尿液衰老生物標(biāo)志物

3.5 衰老模型組與法薏苡仁給藥組大鼠尿液生物標(biāo)志物篩選與衰老模型組相比，F(xiàn)H組大鼠尿液正、負(fù)離子模式下共鑒定出5個(gè)生物標(biāo)記物，N8-乙酰亞精胺、熊去氧膽酸、吲哚乙酸、皮質(zhì)酮、和對甲酚。見表2。

表2 大鼠尿液法薏苡仁生物標(biāo)志物

3.6 年齡與衰老相關(guān)生物標(biāo)志物相關(guān)性分析運(yùn)用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)分析年齡與L-犬尿氨酸和對甲酚呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與硫酸脫氫表雄酮、N8-乙酰亞精胺和花生四烯酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見表3。對甲酚、熊去氧膽酸和對甲酚之間呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。見表4。

表3 年齡與衰老生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析

表4 對甲酚、吲哚乙酸和熊去氧膽酸間相關(guān)性分析

4 討論

本實(shí)驗(yàn)基于代謝組學(xué)技術(shù)共篩選出5種衰老相關(guān)生物標(biāo)志物，通過生物學(xué)功能分析，均能較好地反應(yīng)衰老人群機(jī)體的代謝特征。吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）是催化色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶，其在免疫抑制和自身免疫中的具有重要作用。IDO活性的增強(qiáng)可使L-色氨酸的分解代謝增強(qiáng)進(jìn)而使血清L-犬尿氨酸水平的升高，（本實(shí)驗(yàn)結(jié)果衰老組尿L-犬尿氨酸水平升高）。Ladomersky E等［9］發(fā)現(xiàn)與青年人相比老年人腦中IDO mRNA表達(dá)顯著增加，并與外周血中循環(huán)免疫抑制樹突狀細(xì)胞比率正相關(guān)，提出了IDO抑制老年人機(jī)體免疫功能的假說。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，C組較YC組大鼠尿液中L-犬尿氨酸相對含量顯著升高，相關(guān)性分析顯示年齡與L-犬尿氨酸呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），驗(yàn)證了這一假說。

前列腺素等二十碳衍生物對人體心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有十分重要的作用。作為這類生物活性物質(zhì)的直接前體，花生四烯酸具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液粘度，調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能等一系列生理活性，對預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效［10-11］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠尿液中花生四烯酸相對含量顯著降低，相關(guān)性分析顯示年齡與花生四烯酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），推測衰老大鼠機(jī)體可能因花生四烯酸代謝異常導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損。

硫酸脫氫表雄酮（DHEA-S）是類固醇激素生物合成中重要的中間產(chǎn)物，是脫氫表雄酮（DHEA）在體內(nèi)的游離形式，其隨循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)相應(yīng)靶組織，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成雄激素和雌激素發(fā)揮其生物學(xué)作用。Chehab Olfa等［12］通過觀察突尼斯老年人群DHEA-S與年齡的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，C-19類固醇激素的分泌（DHEA和DHEA-S）下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHEA-S隨年齡的增長而降低（P<0.05），相關(guān)性分析顯示年齡與DHEA-S呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合老年人群代謝變化。

N8乙酰亞精胺（N8-AcSpd）是亞精胺乙?；苌铮诩?xì)胞生長和分化發(fā)揮重要作用。Stefania等定量分析了長壽、老年和青年/成年健康獻(xiàn)血者全血中亞精胺含量，長壽和青年/成年組亞精胺水平顯著高于老年組，且長壽和青年/成年組亞精胺的水平相當(dāng)。健康人體尿液中的多胺水平與年齡有關(guān)，隨著年齡的增長逐漸減少［13-15］。本次實(shí)驗(yàn)中，C組較YC組大鼠尿液N8-AcSpd水平顯著降低，相關(guān)性分析顯示年齡與N8-AcSpd呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。有學(xué)者認(rèn)為，通過攝入富含亞精胺的食物、增加體內(nèi)亞精胺的生物合成，或者增加腸道中合成亞精胺的益生菌活性等方式，將老年人體內(nèi)下降的亞精胺水平恢復(fù)到年輕個(gè)體的生理水平可能是更可行的延緩衰老的有效途徑［16-17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FH、FL組較C組大鼠尿液中N8-AcSpd水平顯著提高（P<0.01），推測法薏苡仁可通過某種途徑提高體內(nèi)N8-AcSpd的水平逆轉(zhuǎn)衰老機(jī)體的代謝變化。

對甲酚是腸道菌群代謝色氨酸的代謝產(chǎn)物，其在體內(nèi)的含量主要受飲食影響，健康人群高蛋白飲食可使對甲酚血清含量升高。有研究發(fā)現(xiàn)［18］，健康人群隨著年齡的的增長對甲酚體內(nèi)含量升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與YC組比較，C組大鼠尿液中對甲酚含量顯著升高（P<0.01），相關(guān)性分析顯示年齡與對甲酚呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與衰老人群機(jī)體代謝變化一致。與C組相比，F(xiàn)H和FL組大鼠尿液中對甲酚含量顯著下降（P<0.01），具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，其變化趨勢向YC組變化。吲哚乙酸是色氨酸在腸道分解的代謝產(chǎn)物，主要由腸道益生菌：生孢梭菌和消化鏈球菌代謝產(chǎn)生，其可促進(jìn)腸上皮屏障保護(hù)功能，并能顯著降低免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組比較，F(xiàn)H和FL組大鼠尿液中吲哚乙酸的含量顯著下降（P<0.01）。由此推測法薏苡仁可能主要通過改變腸道菌群分布，影響色氨酸的代謝，進(jìn)而改變對甲酚在體內(nèi)的含量，同時(shí)增加體內(nèi)吲哚乙酸的生物利用度，降低由機(jī)體衰老導(dǎo)致的腸道炎癥反應(yīng)，改善衰老機(jī)體的代謝環(huán)境。

隨著年齡的增長或在各種條件刺激下，機(jī)體內(nèi)將會大量產(chǎn)生活性氧（ROS）和/或活性氮（RNS），發(fā)生氧化應(yīng)激，如不能被及時(shí)清除，將有助于腸道疾病的發(fā)生。熊去氧膽酸（UDCA）具有抗氧化，抗凋亡和抗自噬的作用，可阻斷促谷胱甘肽耗竭藥物對機(jī)體造成的損傷［20-21］。本實(shí)驗(yàn)中FH組較C組大鼠尿液中，熊去氧膽酸含量顯著下降（P<0.01），推測法薏苡仁可能通過增加UDCA的利用率，加強(qiáng)衰老大鼠腸道抗氧化作用。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，對甲酚、吲哚乙酸和熊去氧膽酸具有極顯著的正相關(guān)（r>0.6，P<0.01），三者之間變化具有協(xié)同性，可能在代謝過程中處于較為接近的反應(yīng)步驟。由此推斷，法薏苡仁可能通過降低腸道炎癥反應(yīng)和抗氧化作用發(fā)揮抗衰老的作用。

5 結(jié)論

通過非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)退役雌性大鼠機(jī)體5種衰老的生物標(biāo)志物，生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)該衰老動物模型能較好地反應(yīng)衰老人群機(jī)體的代謝特征。法薏苡仁可通過逆轉(zhuǎn)衰老相關(guān)標(biāo)志物N8-AcSpd和對甲酚在體內(nèi)的變化改善衰老機(jī)體的代謝環(huán)境。