陳咨余, 姜冬梅, 康 波, 管 成, 龍?jiān)婍? 易治鑫, 徐麒麟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 611130)

腹腔注射亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織多胺含量及代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

陳咨余, 姜冬梅, 康 波, 管 成, 龍?jiān)婍? 易治鑫, 徐麒麟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 611130)

【目的】研究腹腔注射亞精胺對(duì)鼠卵巢組織多胺代謝的影響。【方法】給鼠腹腔注射不同劑量亞精胺[0(對(duì)照組、0.05、0.10和0.15 mg·g-1]，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)多胺代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量, 應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)鼠卵巢組織中多胺含量?！窘Y(jié)果】注射0.15 mg·g-1亞精胺時(shí)，卵巢組織ODC、OAZ1、SPMS、SSAT、PAOX和SMOX基因表達(dá)量顯著高于其他3組；注射亞精胺組鼠卵巢組織SPDS表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組；注射0.10 mg·g-1亞精胺組鼠卵巢組織中腐胺和亞精胺含量均顯著高于對(duì)照組，而注射亞精胺對(duì)卵巢中精胺含量無顯著影響?！窘Y(jié)論】外源性亞精胺的腹腔注射可導(dǎo)致鼠卵巢組織中多胺含量以及多胺代謝相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化，且具有劑量依賴性，提示外源性亞精胺可通過介導(dǎo)卵巢組織的多胺代謝來參與調(diào)控卵巢功能。

亞精胺； 鼠； 卵巢； 多胺代謝； 繁殖; 基因表達(dá)； 腹腔注射

多胺(天然多胺主要包括腐胺、亞精胺和精胺)在動(dòng)物繁殖過程中具有重要調(diào)控作用[1]。多胺通過影響雄性動(dòng)物精子發(fā)生和精子活性來參與調(diào)控雄性動(dòng)物繁殖功能[2]；在雌性動(dòng)物中，生殖相關(guān)激素變化可影響多胺合成限速酶鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)的活性，進(jìn)而導(dǎo)致多胺含量發(fā)生變化[2-3]。老齡鼠卵泡組織ODC活性顯著低于青年鼠，且其胚胎染色體的非整倍性顯著高于青年鼠，當(dāng)補(bǔ)充外源性腐胺后，鼠胚胎染色體非整倍性顯著降低，表明多胺對(duì)維持雌鼠繁殖功能具有重要作用[4-5]。

亞精胺可為真核翻譯起始因子eIF5A提供氨基丁基，替換1個(gè)賴氨酸殘基，使eIF5A成為具有活性的成熟蛋白分子，是eIF5A翻譯后羥腐胺賴氨酸修飾過程的重要底物。eIF5A的hypusine修飾過程對(duì)于其功能和細(xì)胞增殖具有重要作用[1,6]。研究表明，外源性亞精胺對(duì)細(xì)胞免疫、生物抗逆性以及細(xì)胞增殖分化均具有顯著作用，且該作用表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性[7]。然而，外源性亞精胺對(duì)雌性動(dòng)物繁殖功能的影響尚不清楚。本研究通過給小鼠腹腔注射不同濃度亞精胺，檢測(cè)鼠卵巢組織中多胺含量及多胺代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量，揭示外源性亞精胺對(duì)鼠卵巢組織多胺代謝的影響，以期為多胺調(diào)控雌性動(dòng)物繁殖功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與處理

8周齡的SPF級(jí)昆明鼠(購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)32只，體質(zhì)量(30±5) g隨機(jī)分成4組，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～22 ℃，光照充足，給予充足的標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。按照鼠體質(zhì)量計(jì)算每組鼠所需亞精胺劑量，設(shè)置對(duì)照組(生理鹽水)、低劑量組(0.05 mg·g-1)、中劑量組(0.10 mg·g-1)、高劑量組(0.15 mg·g-1)，每只鼠注射總劑量為300 μL，給藥后自由飲水、采食，24 h后采用，采用頸椎脫臼法將鼠處死，采集卵巢組織樣品，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射用亞精胺購自Sigma公司。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照RNAiso Plus試劑盒(購自TaKaRa公司)說明書分別提取對(duì)照組和亞精胺處理組小鼠的卵巢組織中總RNA，并按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(購自TaKaRa公司)說明書制備cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ODC、鳥氨酸脫羧酶抗酶(Ornithine decarboxylase antizyme1，OAZ1)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)、亞精胺合成酶(Spermidine synthase，SPDS)、精胺合成酶(Spermine synthase，SPMS)、亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(Spermine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT)、多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAOX)和精胺氧化酶(Spermineoxidase，SMOX)基因表達(dá)量, 引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：iQTMSYBR Green Supermix(購自BioRad公司) 25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板2.5 μL，用RNaseFree水補(bǔ)充至50 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s (采集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。并繪制熔解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，用GAPDH作為內(nèi)參基因。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

Tab.1 Sequences of primer pairs used in real-time fluorescent quantitative PCR

基因引物序列(5'?3')產(chǎn)物/bpODCGACCTTGTGAGGAGCTGCT-GATTGGCAGTCAAACTCGTCCT-TAG190SAMDCTCATGAAGCCTTCTCAC-CAAGGGTTCGGCTCTCTGGGAAATC-CAAAGT155OAZ1GAGTTCGCAGAGGAGCAATCCCAAGAAAGCTGAAGGTTCG101SPDSACCAGCTCATGAAGACAGCACTCATGCTACACAGCATGAAGCCGATCT189SPMSTTCGGGTGACTCAGTTCCTGCTAAAACGGAGACCCTCCTTCAGCAAAT199PAOXAGTCTTCACATGTGCTCTGT-GGGTTGGCAATTGTGGGTTTCCT-GTCAC131SSATTGCCGGTGTAGACAATGACAACCTTAAAGCTTTGGAATGGGT-GCTCGC114SMOXTCTGCACAGAGATGCTTCGA-CAGTTTGAGCCCACCTGTGTGTAG-GAAT129GAPDHAACGACCCCTTCATTGACTCCACGACATACTCAGCAC191

1.3 高效液相色譜檢測(cè)多胺含量

稱取凍存卵巢組織，加入1.0 mLφ為 5%的HClO4，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，加入500 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液，超聲波破碎10 min，冷凍離心機(jī)(4 ℃，12 000 r·min-1)離心10 min，取上清，加入2 mL 2.5 mol·L-1的NaOH和4 μL的苯甲酰氯，漩渦震蕩后置于40 ℃的水浴鍋中衍生60 min。衍生液經(jīng)C18固相萃取柱過柱后，用0.5 mL色譜甲醇洗脫樣品，用0.22 μm針頭濾器過濾洗脫液，4 ℃避光保存待檢測(cè)。高效液相色譜檢測(cè)條件為：流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=66∶34；流速為0.9 mL·min-1；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長為229 nm；柱溫為25 ℃。制作多胺標(biāo)準(zhǔn)曲線所用腐胺、亞精胺和精胺均購自Sigma公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法處理熒光定量數(shù)據(jù)，計(jì)算各處理組卵巢組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。利用SAS9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件MEANS過程進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，ANOVA過程進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠卵巢組織多胺合成代謝相關(guān)基因表達(dá)

由圖1可知，腹腔注射不同濃度亞精胺對(duì)鼠卵巢組織中SAMDC基因表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。注射高劑量亞精胺組鼠卵巢組織中OAZ1、ODC和SPMS基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。注射不同劑量亞精胺組鼠卵巢組織中SPDS基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且不同劑量處理組之間SPDS表達(dá)量無顯著差異。

相同基因不同柱子上凡具有一個(gè)相同小寫字母者，表示不同處理間差異不顯著(Duncan’s法，P>0.05，n=6)。

圖1 亞精胺對(duì)小鼠卵巢多胺合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig.1 Effect of spermidine on polyamine biosynthesis-related gene expression in mouse ovary

2.2 鼠卵巢組織多胺分解代謝相關(guān)基因表達(dá)

由圖2可知，腹腔注射低劑量亞精胺后，卵巢組織中SSAT、PAOX和SMOX表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異；隨著亞精胺劑量的逐漸升高，SSAT和SMOX表達(dá)量也逐漸升高，中劑量組表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和低劑量組，PAOX中劑量組表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；3個(gè)基因高劑量組表達(dá)量均顯著高于其他3組。

相同基因不同柱子上凡具有一個(gè)相同小寫字母者，表示不同處理間差異不顯著(Duncan’s法，P>0.05，n=6)。

圖2 亞精胺對(duì)鼠卵巢多胺分解代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of spermidine on polyamine catabolism-related genes expression in mouse ovary

2.3 鼠卵巢組織多胺水平

由圖3可知，隨著腹腔注射亞精胺劑量的增加，卵巢組織中腐胺的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，中劑量亞精胺處理組腐胺的含量顯著高于對(duì)照組，低、高劑量亞精胺處理時(shí)，腐胺的含量和對(duì)照相比變化不顯著。中劑量亞精胺處理組中，卵巢的亞精胺含量顯著高于其他3組，高劑量組的亞精胺含量顯著低于其他3組。各處理組間，卵巢中精胺含量無顯著差異。

相同基因不同柱子上凡具有一個(gè)相同小寫字母者，表示不同處理間差異不顯著(Duncan’s法，P>0.05，n=3)。

圖3 亞精胺對(duì)鼠卵巢多胺的含量的影響

Fig.3 Effect of spermidine on polyamine concentration in mouse ovary

3 討論與結(jié)論

3.1 外源性亞精胺對(duì)鼠卵巢組織中多胺合成基因表達(dá)的影響

生物體通過調(diào)節(jié)多胺代謝過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性來實(shí)現(xiàn)對(duì)多胺水平的精密調(diào)控[8]。多胺濃度升高可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)OAZ1+1移碼機(jī)制，即在多胺的刺激下，OAZ1 mRNA翻譯全長功能蛋白質(zhì)，降低ODC活性，進(jìn)而反饋抑制多胺生物合成途徑，以維持機(jī)體內(nèi)多胺穩(wěn)態(tài)[9]。此外，OAZ1還能影響細(xì)胞膜上的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多胺的外排，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)的多胺水平[10]。腹腔注射高劑量亞精胺組鼠卵巢組織中OAZ1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，提示外源性亞精胺可通過介導(dǎo)卵巢OAZ1+1移碼機(jī)制來維持卵巢內(nèi)多胺水平的穩(wěn)定。高劑量的亞精胺注射小鼠后，卵巢中ODC基因的表達(dá)量顯著升高，推測(cè)由于OAZ1基因的升高過度抑制了ODC的活性，機(jī)體通過上調(diào)ODC基因的表達(dá)來代償OAZ1對(duì)ODC活性的抑制。在試驗(yàn)過程中，我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)注射高劑量亞精胺時(shí)，鼠卵巢中SPDS基因表達(dá)量顯著降低，而SPMS基因表達(dá)量顯著升高，說明機(jī)體通過抑制亞精胺合成、促進(jìn)亞精胺分解這2條途徑共同來維持卵巢組織亞精胺水平的穩(wěn)定。亞精胺注射后，處理組卵巢中SPDS基因的表達(dá)量均顯著降低，推測(cè)小鼠卵巢中由于對(duì)亞精胺的吸收引起自身亞精胺含量的上升，機(jī)體一方面通過合成精胺來降低亞精胺水平，同時(shí)抑制亞精胺的合成以維持卵巢中亞精胺的正常水平。Shi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，心臟過表達(dá)SAMDC基因的小鼠，心臟中亞精胺含量低于對(duì)照組，而心臟同時(shí)過表達(dá)SPDS和SAMDC基因的小鼠與僅心臟過表達(dá)SAMDC基因的小鼠相比，心臟亞精胺含量變化不顯著，表明小鼠心臟中多胺的積累并非受到SPDS和SAMDC活性的調(diào)控。然而，本研究發(fā)現(xiàn)外源注射亞精胺對(duì)鼠卵巢SAMDC基因表達(dá)無顯著影響，推測(cè)外源性亞精胺不會(huì)導(dǎo)致SAMDC在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，可能通過翻譯水平或酶的活性的變化來調(diào)控多胺水平。綜上所述，外源性亞精胺主要通過上調(diào)ODC、OAZ1和SPMS基因，下調(diào)SPDS基因表達(dá)來維持機(jī)體多胺池的穩(wěn)態(tài)。

3.2 外源性亞精胺對(duì)鼠卵巢組織中多胺分解代謝基因表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，多胺濃度升高可誘導(dǎo)核仁素亞型降解，解除其對(duì)SSAT翻譯的抑制，提高SSAT活性，促進(jìn)多胺代謝，從而校正多胺濃度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著亞精胺劑量的升高，卵巢中SSAT基因表達(dá)量逐漸升高，表明組織中多胺的分解代謝活動(dòng)隨著亞精胺劑量的上升而逐漸加強(qiáng)。注射高劑量亞精胺組鼠卵巢PAOX基因表達(dá)量顯著高于其他組，提示多胺分解代謝程度可能對(duì)多胺濃度具有依賴性。精胺能夠通過SMOX的作用直接轉(zhuǎn)變?yōu)閬喚?，并且生成H2O2和3-氨基丙醇[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著亞精胺注射劑量的升高，SMOX基因表達(dá)量也逐漸上升，推測(cè)由于機(jī)體內(nèi)亞精胺過多導(dǎo)致精胺含量增加，機(jī)體為維持亞精胺/精胺比例，從而高表達(dá)SMOX基因以促進(jìn)精胺分解。高表達(dá)SMOX基因可導(dǎo)致活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)升高進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA損傷[14]。Kwak等[15]研究表明，亞精胺和精胺氧化時(shí)產(chǎn)生的丙烯醛能激活細(xì)胞中抗氧化途徑相關(guān)基因的表達(dá)，吳婉玲[16]研究發(fā)現(xiàn)，外源性精胺處理導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞內(nèi)精胺氧化酶活性高，增加H2O2的產(chǎn)生，從而造成細(xì)胞凋亡。因此，注射高劑量亞精胺鼠卵巢組織中多胺分解活動(dòng)加強(qiáng)，多胺分解代謝產(chǎn)物累積，導(dǎo)致卵巢組織中ROS濃度升高，從而造成組織損傷。

3.3 外源性亞精胺對(duì)鼠卵巢組織中多胺水平的影響

隨著亞精胺劑量的增加，鼠卵巢組織腐胺含量先升高后下降，注射0.10 mg·g-1亞精胺組鼠卵巢組織中腐胺含量最高，而0.15 mg·g-1組腐胺含量又下降至正常水平。這些結(jié)果表明，隨著亞精胺劑量的增加，亞精胺向腐胺轉(zhuǎn)化的效率相應(yīng)增加，亞精胺優(yōu)先轉(zhuǎn)化成腐胺；隨著亞精胺劑量進(jìn)一步增加，多胺代謝基因表達(dá)量顯著升高，亞精胺代謝活動(dòng)增強(qiáng)，過多的亞精胺又在SSAT和PAOX的作用下轉(zhuǎn)化為乙?；鶃喚?。注射0.10 mg·g-1亞精胺時(shí)，卵巢組織中亞精胺含量最高，推測(cè)卵巢對(duì)外源亞精胺具有一定的耐受能力。當(dāng)亞精胺劑量繼續(xù)增加到0.15 mg·g-1時(shí)，機(jī)體加速對(duì)亞精胺的分解，從而降低亞精胺的含量。另外，根據(jù)基因定量的檢測(cè)結(jié)果，高劑量亞精胺組中SSAT、PAOX基因表達(dá)量均顯著高于其余各組，提示SSAT和PAOX基因高表達(dá)促進(jìn)了亞精胺的快速分解。研究表明，亞精胺和精胺分解過程中會(huì)伴隨著生成ROS，后者將導(dǎo)致細(xì)胞功能受損[17-18]。天然存在的3種多胺中，精胺毒性最大，腐胺最小，亞精胺毒性居中[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量亞精胺注射對(duì)鼠卵巢組織中精胺含量均無顯著影響，其原因可能是卵巢組織對(duì)精胺變化更加敏感，外源性亞精胺可能促使精胺合成和分解代謝活動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致精胺合成與分解代謝活動(dòng)加快，從而維持卵巢組織精胺池的穩(wěn)態(tài)，然而其詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，機(jī)體內(nèi)多胺含量受到多種因素影響，多胺穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)也是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程。本研究結(jié)果表明，外源性亞精胺注射可導(dǎo)致鼠卵巢組織中腐胺和亞精胺含量升高；多胺合成酶OAZ1、ODC、SPDS基因表達(dá)量上升，亞精胺合成酶表達(dá)量下降；多胺分解代謝酶SSAT、PAOX和SMOX基因表達(dá)量升高，且具有劑量依賴性，提示外源性亞精胺可通過介導(dǎo)卵巢組織的多胺代謝來參與調(diào)控卵巢功能。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Effects of intraperitoneal spermidine injection on polyamine content and metabolism-related gene expression in mouse ovary

CHEN Ziyu, JIANG Dongmei, KANG Bo, GUAN Cheng, LONG Shiyun, YI Zhixin, XU Qilin

(College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University /Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 611130, China)

【Objective】 To observe the effects of intraperitoneal injection of spermidine on polyamine metabolism in mouse ovary.【Method】 Mice were injected with different doses of spermidine[0(control), 0.05, 0.10 and 0.15 mg·g-1]. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to determine the ovarian expression levels of key genes in polyamine metabolism. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the polyamine levels in mouse ovarian tissues.【Result】 After administration of 0.15 mg·g-1spermidine, the expression ofODC,OAZ1,SPMS,SSAT,PAOXandSMOXgenes in ovarian tissues were significantly higher compared to other three groups.SPDSgene expressions of all three spermidine administration groups were significantly lower compared to control. After administration of 0.10 mg·g-1spermidine, the putrescine and spermidine contents in mouse ovary were significantly higher compared to control, while spermidine administration had no significant effect on spermine content in ovary. 【Conclusion】 Exogenous spermidine injected intraperitoneally can change polyamine content and polyamine metabolism-related gene expression in mouse ovary. Such effects are dose-dependent. Exogenous spermidine can potentially participate in the regulation of ovarian function through adjusting polyamine metabolism.

spermidine; mouse; ovary; polyamine metabolism; reproduction；gene expression; intraperitoneal injection

2016- 09- 01 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

陳咨余(1993—)，女，碩士研究生，E-mail: oleander0809@163.com; 通信作者：姜冬梅(1978—)，女，講師，E-mail: jiangdm9277@163.com；康 波(1978—)，男，副教授，博士，E-mail: bokang@sicau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31201798)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(20105103120003)

S814.1

A

1001- 411X(2017)04- 0052- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.018.html

陳咨余, 姜冬梅, 康 波， 等.腹腔注射亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織多胺含量及代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):52- 56.