陳珂珂 唐亮 王燕

摘要：結(jié)直腸癌是來源于結(jié)腸或直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。非編碼RNA（miRNA和LncRNA）在結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。本文擬通過對已有的結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)進行分析，篩選出結(jié)直腸癌組織中特異性表達(dá)的基因。本研究獲得四個結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)：GSE54129、GSE28700、GSE99415和GSE99416。功能富集分析提示差異表達(dá)基因主要參與PI3k-Akt信號通路。

關(guān)鍵詞：GEO數(shù)據(jù)庫;結(jié)直腸癌;差異基因;非編碼RNA

結(jié)直腸癌（Colorectal?cancer）是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的三種癌癥之一，因其較高的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，結(jié)直腸癌導(dǎo)致死亡在癌癥相關(guān)的死亡中占據(jù)第二位[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展涉及基因調(diào)控的巨大變化，包括mRNA、miRNA和IncRNA。提供早期診斷和預(yù)后信息的生物標(biāo)志物在結(jié)直腸癌治療中具有重要意義。競爭性內(nèi)源RNA（competing?endogenous?RNA，ceRNA）假說認(rèn)為mRNA、lncRNA等轉(zhuǎn)錄物可以通過miRNA應(yīng)答元件（miRNA?response?element，MRE）競爭性結(jié)合miRNA，相互聯(lián)系以及相互調(diào)控各自的表達(dá)水平，產(chǎn)生大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而影響他們功能的發(fā)揮[2]。這些研究極大拓展了人類基因組遺傳信息的功能，同時也展示了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的全新模式，為理解腫瘤疾病的發(fā)生機制提供了新思路。

在本研究中，我們充分利用GEO在線數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集，通過分析四個微陣列數(shù)據(jù)集來比較結(jié)直腸癌樣本與癌旁組織之間的基因表達(dá)差異。對差異表達(dá)基因進行功能富集分析。研究結(jié)果將對結(jié)直腸癌發(fā)病機制提供深刻認(rèn)識。

一、材料與方法

1.表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)來源

本次研究中應(yīng)用到的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)都是通過在基因芯片數(shù)據(jù)庫即?GEO

（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索并下載得到的。檢索GEO數(shù)據(jù)庫時，檢索條件為，關(guān)鍵詞：colorectal?cancer;研究類型：Expression?profiling?by?array;在檢索結(jié)果中，按標(biāo)準(zhǔn)篩選出所需的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集。

篩選標(biāo)準(zhǔn)：

（1）基因表達(dá)芯片所研究的樣本，為人類總?RNA。

（2）基因表達(dá)數(shù)據(jù)集得研究目標(biāo)必須是配對的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織。

（3）每個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集研究的樣本數(shù)量不少于5對。

（4）基因表達(dá)數(shù)據(jù)集必須能下載到基因表達(dá)芯片的原始數(shù)據(jù)。

2.?數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)控與差異表迖基因篩選

2.1數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

采用R軟件，利用?Bioconductor及affy包的RMA?算法處理芯片數(shù)據(jù)，依次對芯片數(shù)據(jù)進行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及?log2?處理。利用?MetaQC?包對標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)數(shù)據(jù)進行質(zhì)控處理。

2.2?差異表迖基因篩選

應(yīng)用穩(wěn)健的多陣列平均算法對每個序列的原始微陣列數(shù)據(jù)進行背景校正和四分位數(shù)據(jù)歸一化，并分別根據(jù)注釋文件將探針名稱作為標(biāo)記基因符號。在篩選了無相應(yīng)基因符號的探針后，計算了具有多個探針的基因符號的平均值。使用R軟件limma軟件包對選定的胃腫瘤組織及其匹配的正常樣本進行了比較。log2（fold）|>1.585和p值<0.05的?mRNA被認(rèn)為是差異表達(dá)的mRNA（DEMS），?|log2（fold）|>1和p值<0.05?的miRNA和LncRNAs被認(rèn)為是差異表達(dá)的miRNA（DEmis）和LncRNAs（DELs）。

2.3?差異表達(dá)基因的功能富集分析

利用?DAVID?數(shù)據(jù)庫（DAVID，?https：//david.ncifcrf.gov/）?中的在線分析工具對得到的差異基因進行基因功能注釋（GO分析）及KEGG通路富集分析。P值<0.05為統(tǒng)計上有顯著差異。

2.4?CeRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用TargetScanHuman?7.2?（http：//www.targetscan.org/vert_72/）?和LncBase?Predicted?v.2?（http：//carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/）預(yù)測miRNA?與?mRNA，?及miRNA與?lncRNA之間的互作關(guān)系。Target?Scan?Human?參數(shù)設(shè)置為累計加權(quán)分<?-0.4。LncBase?Predicted?v.2參數(shù)設(shè)置為miTG-score?>?0.7。利用Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）對ceRNA網(wǎng)絡(luò)進行可視化做圖。

二、結(jié)果

1.芯片數(shù)據(jù)篩選結(jié)果

本研究獲得了用于結(jié)直腸癌分析的四個芯片數(shù)據(jù)：GSE54129、GSE28700、GSE99415和GSE99416。GSE54129為基于GPL570?2.0芯片的mRNA數(shù)據(jù)，其中包含111個手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織和21個匹配的正常組織。GSE28700為基于GPL9081?1.0?miRNA芯片的數(shù)據(jù)，含有22個結(jié)直腸癌組織和22個匹配的正常組織數(shù)據(jù)。GSE99415為基于GPL18058?microRNA芯片的數(shù)據(jù)，含有6個結(jié)直腸癌和6個匹配的正常組織數(shù)據(jù)。GSE99416為基于GPL16956?Agilent-045997?Arraystar?human?lncRNA?芯片的數(shù)據(jù)，含6個結(jié)直腸癌組織和6個匹配的正常組織數(shù)據(jù)。

1.差異表達(dá)基因的鑒定

以|log2（fold）|>1.585和p值<0.05為閾值，在GSE54129中得到了1867條差異表達(dá)的mRNAs（966下調(diào)，901上調(diào)）。在GSE28700中共篩選了44個差異表達(dá)的miRNA（30下調(diào)，14上調(diào)）。在GSE99416?中，鑒定出4329條差異表達(dá)的LncRNAs（1974上調(diào)，2355下調(diào)）。

2.功能分析

圖1顯示了應(yīng)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫鑒定的差異表達(dá)基因的前20個功能富集分析的結(jié)果。最重要的生物過程是細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管生成、細(xì)胞黏附、表皮細(xì)胞分化和上皮細(xì)胞分化。此結(jié)果結(jié)果在KEGG路徑分析中得到驗證。差異表達(dá)基因主要參與癌癥的途徑，PI3k-Akt途徑，局灶性粘連，環(huán)受體相互作用和CYP450代謝途徑。然后，我們分別用上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因進行了KEGG信號通路分析。值得注意的是，調(diào)控基因主要參與局灶性粘連、環(huán)受體相互作用和PI3k-Akt信號通路（表1）。

3.ceRNA?網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TargetScanHuman和?LncBase?Predicted?v.2預(yù)測的mRNAs?和?lncRNAs?被確定為DEMis目標(biāo)基因。此外，為了篩選可靠的基因，將目標(biāo)基因與DEMS和DELS進行了比較，只選取了重疊基因（圖2）。

討論

本研究通過?GEO?數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)直腸癌基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法深入分析結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的差異表達(dá)ncRNA。功能富集分析提示差異表達(dá)基因主要參與PI3k-Akt信號通路。

研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中存在多種表達(dá)異常的lncRNAs，?其表達(dá)水平呈現(xiàn)不同的升高或者下降，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用，參與胃癌的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移[3]。在胃癌中起促癌基因作用的lncRNAs主要有H19，HOTAIR，LINC00152，CCAT1等[4]。起抑癌基因作用的主要有MEG3，AC138128.1，RP11-119F7.4等[5]。

TCGA數(shù)據(jù)集miRNomes數(shù)據(jù)挖掘顯示，miR-133a、miR-133b以及miR-1在GC中持續(xù)下調(diào)[6]。微陣列法和qPCR法均在結(jié)直腸癌細(xì)胞株和原代結(jié)直腸癌組織中證實了這一結(jié)果[7]。三組結(jié)直腸癌患者及相應(yīng)的非腫瘤組織均獨立檢測miR-133在胃癌中的表達(dá)水平。結(jié)果進一步顯示miR-133的下調(diào)更有可能在腫瘤大小、浸潤深度和周圍器官轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)較差[8]。miR-133功能障礙是影響整體生存的獨立預(yù)后因素。此外，通過熒光素酶檢測，miR-133靶向EGFR和HER-2的3’UTR，可能阻斷細(xì)胞生長信號，抑制細(xì)胞生長，最終促進細(xì)胞凋亡[9]。此外，miR-133a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)低，抑制了細(xì)胞增殖、侵襲和誘導(dǎo)凋亡。它還可以與多種基因結(jié)合，包括結(jié)腸COL1A1，?FSCN1和泛素特異性蛋白酶39（USP?39）[10]。這些miR-133在結(jié)直腸癌中的相關(guān)研究結(jié)果，闡明了miRNA介導(dǎo)途徑抑制癌基因的新機制，為結(jié)直腸癌治療提供了新的途徑。

PI3k-Akt途徑在細(xì)胞入侵和遷移等一系列細(xì)胞反應(yīng)中扮演重要角色，這些反應(yīng)通過促進細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡來促進腫瘤的進展。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-Akt信號通路已被報道在人類癌癥中顯示出頻繁的變化，并被認(rèn)為與EGFR/ERBB家族受體特異性相互作用。據(jù)報道，PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)p27的調(diào)控，與宮頸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡有關(guān)[11]。在骨癌中，癌癥疼痛與MCP-1密切相關(guān)，MCP-1通過PI3K/Akt通路介導(dǎo)刺激脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞[12]。

前期研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/（mTOR）信號通路的靶蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此可能為治療提供靶點。該通路在細(xì)胞的生長、增殖、代謝、存活和血管生成等多種功能中發(fā)揮著重要作用[12]。PI3K介導(dǎo)的生長因子信號通路通過AKT、TSC1和TSC2激活mTOR。TSC1和TSC2形成二聚體（TSC1/TSC2），間接調(diào)控mTOR活性。當(dāng)上游信號被激活時，TSC1/TSC2被AKT抑制，允許mTOR激活。在癌細(xì)胞中，PI3K-AKT活性的增加導(dǎo)致mTORC1磷酸化活化，P70S6K1-mTORC2的反饋活性降低。這些變化導(dǎo)致線粒體活性增加、血管生成、核糖體生物發(fā)生以促進蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖和自噬[13]?？傊?，研究結(jié)果揭示了可能參與胃癌發(fā)生的若干通路。這些結(jié)果有可能為臨床上進一步研究和闡明結(jié)直腸癌的發(fā)生提供一些幫助，并且它們有可能是結(jié)直腸癌治療的新靶點。

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通訊作者：王燕，實驗師，研究方向為多基因疾病發(fā)病機制研究。

本項目受湖南省教育廳科研基金資助（19C0201）