尹燕萍

（山西省林業(yè)生態(tài)實驗基地，山西太原 030031）

在實際林木育種過程中，單倍體育種手段應用廣泛，具有較高的育種效果，符合林木發(fā)展的具體需求。因此，需在明確單倍體植物產(chǎn)生途徑的基礎(chǔ)上，把握單倍體育種的影響因素，解決以往單倍體育種存在的問題，確保該技術(shù)能有效應用至實際林木育種工作中，促進林業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)協(xié)調(diào)發(fā)展。

1 單倍體植物的產(chǎn)生途徑

單倍體植物最早由Dorothy Bergner 于1921 年在曼陀羅自然群體中發(fā)現(xiàn)，起源于植物單性生殖，性狀多表現(xiàn)為母本，且偶發(fā)性較低，并不適用于早期的育種工作。在此基礎(chǔ)上，單倍體育種手段的研究最早開始于20世紀，而在長期研究過程中，已經(jīng)形成花藥離體培養(yǎng)為主的單倍體育種技術(shù)體系，雖然未能解決單倍體獲取的偶然性問題，但誘導頻率顯著提高，具備了應用至林木育種工作中的可行性。

1.1 孤雌生殖

孤雌生殖技術(shù)誕生于20 世紀50 年代末期，是指基于離體培養(yǎng)未受精子房或胚珠誘發(fā)卵細胞單性發(fā)育的一種育種手段，從目前來看，可應用該技術(shù)實現(xiàn)楊樹、橡膠、刺槐等林木的單倍體育種，育種效果較好。但在長期實踐中發(fā)現(xiàn)，孤雌生殖技術(shù)的弊端在于無法解決雌核發(fā)育起源的穩(wěn)定性問題，即胚囊發(fā)育不會跟隨離體條件的變化而變化，導致子房單倍體誘導存在較大限制，因此，多作為補充技術(shù)輔助花藥離體培養(yǎng)手段。

1.2 孤雄生殖

針對花藥或花粉進行離體培養(yǎng)獲取單倍體植物，這是孤雄生殖育種方法的基本原理，其中，以花粉為依托進行細胞再生培養(yǎng)，即所有再生植株均產(chǎn)生于花藥中的花粉，往往具有較大的操作難度，因此，直接借助花藥開展再生植株器官培養(yǎng)，既可將花粉作為再生植株的育種源頭，又可將體細胞組織作為再生植株的育種源頭，整體操作難度顯著降低，成功率較高，是一種應用較為廣泛且符合實際林木育種需求的單倍體誘導手段。

2 影響單倍體育種花藥培養(yǎng)的主要因素

以孤雄生殖手段為主導的花藥離體培養(yǎng)本質(zhì)是依托內(nèi)外因配合作用避免花粉粒由原本的配子體發(fā)展途徑轉(zhuǎn)化為孢子體發(fā)展途徑，而這往往是單倍體植株育種的關(guān)鍵所在。其中，從內(nèi)因角度來看，影響單倍體育種過程花藥離體培養(yǎng)的因素一般包括植株基因、植株生理狀況、小孢子發(fā)育等；從外因角度看，包括預處理手段、培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)環(huán)境提供在內(nèi)的諸多因素均可能影響單倍體育種花藥離體培養(yǎng)的質(zhì)量。

2.1 內(nèi)因

2.1.1 基因型。在花藥離體培養(yǎng)過程中，單倍體育種的整體質(zhì)量往往決定于植株的基因型，即在離體培養(yǎng)過程中，不同基因類型植株表現(xiàn)出的愈傷組織誘導率、分化率、胚狀體誘導率和植株誘導率均存在較大差異。在此基礎(chǔ)上，借助長期試驗，發(fā)現(xiàn)茄科、禾本科、十字花科花藥進行離體培養(yǎng)的成功率相對較高，而豆科植物花藥則在離體培養(yǎng)中反應性較低，這從側(cè)面印證了花藥離體培養(yǎng)技術(shù)的局限性。此外，植株細胞質(zhì)的不同也會在很大程度上影響離體培養(yǎng)的實際質(zhì)量。

2.1.2 供體植株生理狀況?？紤]到花藥離體培養(yǎng)需建立在具備高質(zhì)量供體植株基礎(chǔ)上，因此，供體植物的生理性狀同樣會在一定程度上影響花藥離體培養(yǎng)的結(jié)果，其中，當采用盛花期的花藥時，雄核發(fā)育率相對較高，當采用幼年植株的花藥時，花藥的離體培養(yǎng)反應性較強。此外，花藥離體培養(yǎng)還受供體植株的生長環(huán)境限制，當供體植株所處環(huán)境季節(jié)變化及水分情況不同時，花藥離體培養(yǎng)的成果也會發(fā)生較大變化，究其原因，多與小孢子發(fā)育受營養(yǎng)供給和內(nèi)源激素影響有關(guān)。

2.1.3 小孢子發(fā)育。在植株進入小孢子發(fā)育階段后，采取恰當?shù)念A處理手段往往會導致小孢子呈現(xiàn)不同于自然狀態(tài)的生長性狀，尤其是小孢子配子體發(fā)育途徑優(yōu)化為孢子體發(fā)展途徑，但從實際看，不同植株所適用的預處理時間往往不同，對大多數(shù)林木來說，一般可在單核靠邊期進行處理，達到最佳的育種效果。

2.2 外因

2.2.1 預處理。在花藥預處理過程中，包括饑餓、熱激、高滲透脅迫、化學處理在內(nèi)的處理方法均十分常見，采用何種處理方式往往取決于植株的基因型。在此基礎(chǔ)上，不同的預處理手段給植株花藥帶來的影響效果往往不同，最終使單倍體育種呈現(xiàn)出不同的結(jié)果。

2.2.2 培養(yǎng)基。在花藥離體培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、附加物質(zhì)、碳源共同組成了花藥的培養(yǎng)環(huán)境，以植物生長調(diào)節(jié)劑為例，大部分植物花藥對生長調(diào)節(jié)劑的依賴性均相對較高，而在通常情況下，可采用2，4-D 和IAA 生長素支撐花藥的離體培養(yǎng)。此外，林木植物花藥培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中要含有生長素和細胞分裂素，是保障花藥脫分化和再分化成功率的關(guān)鍵。

2.2.3 培養(yǎng)環(huán)境。在花藥離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)環(huán)境與花藥生長需求的匹配性往往會顯著影響離體培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。培養(yǎng)環(huán)境通?？煞譃槭覂?nèi)溫度和光照強度，不同植株花藥對溫度和光照的需求存在差異。

3 林木育種中花藥培養(yǎng)育種的應用現(xiàn)狀

在單倍體育種領(lǐng)域，最早以花藥為依托獲取單倍體是1964 年印度Guha 的毛曼陀羅試驗，在林木育種領(lǐng)域，最早開始于1974 年的培養(yǎng)楊樹試驗，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)長期發(fā)展，當前花藥培養(yǎng)獲取單倍體的技術(shù)理論已相對成熟，具備了在林木育種中導入的可行性和實效性。但由于林木生殖周期較長，供體植株會處于長期變化的氣溫與降水環(huán)境中，導致花藥的離體培養(yǎng)效果與預期差距較大，影響了相關(guān)試驗的順利開展。目前，已能借助花藥離體培養(yǎng)手段獲取單倍體的林木種類包括遼楊、黑楊、茶樹等。

4 林木育種中花藥培養(yǎng)育種存在的問題

4.1 花藥培養(yǎng)基因型依賴性較高

花藥離體培養(yǎng)的成果很大程度上取決于供體植株的基因型，這意味著培養(yǎng)過程無法打破不良基因的連鎖效應，基因重組的可行性相對較低。試驗發(fā)現(xiàn)，大部分木本植物均屬于頑固型基因型，只有少數(shù)可通過花藥離體培養(yǎng)獲取單倍體。同時，大多數(shù)林木生長周期長、影響因素多，難以保障花藥取材的質(zhì)量，最終影響花藥離體培養(yǎng)的成功率。

4.2 花藥培養(yǎng)再生植株倍性混亂、來源不清

在花藥愈傷組織誘導分化時，由于多倍體植株來源不清，導致誘導分化的難度較大，對試驗人員的能力要求較高。同時，花藥離體培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇，花藥培養(yǎng)過程除了會導致小孢子的發(fā)育，還會伴隨體細胞組織的生長，因此，如何抑制體細胞生長且不影響小孢子雄核發(fā)育速率，以及如何有效確保單倍體植株的成功獲取，是林木花藥離體培養(yǎng)試驗中所面臨的主要問題。

4.3 林木花藥培養(yǎng)機制處于起步研究階段

目前與農(nóng)作物相比，林木花藥離體培養(yǎng)的特殊性較高，且由于林木生長周期較長，導致林木花藥培養(yǎng)的成功率普遍較低，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，林木花藥離體培養(yǎng)的理論研究相對較少，缺乏對林木花藥離體培養(yǎng)機理的深入認識，嚴重影響了實際離體培養(yǎng)試驗的成功率，也限制了花藥離體培養(yǎng)獲取單倍體育種手段的全面推廣。

5 林木育種中花藥培養(yǎng)育種的發(fā)展策略

5.1 借助基因改良手段提高花藥離體培養(yǎng)的成功率

印度植物學家提出選擇高頻率再生基因型植株開展花藥離體培養(yǎng)試驗的理論，應合理選擇植株的基因型，在確保花藥離體培養(yǎng)可行性的基礎(chǔ)上，保障單倍體獲取的成功率。同時，應針對花藥培養(yǎng)反應較差的基因型選擇雜交育種手段，可顯著提高雄核的發(fā)育效率，在此基礎(chǔ)上，可結(jié)合γ-射線照射手段提高花藥的反應性，最終為林業(yè)育種提供可借鑒的手段。

5.2 優(yōu)化培養(yǎng)方式以減少體細胞干擾

針對花藥離體培養(yǎng)過程小孢子發(fā)育容易受體細胞影響的問題，可借助固、液雙層培養(yǎng)基處理花藥，使花藥正常開裂，不產(chǎn)生愈傷組織，最終既避免了體細胞的干擾，又不會因采用機械游離手段破壞小孢子的生理結(jié)構(gòu)。此外，應針對不同植株花藥培養(yǎng)需求設計不同的培養(yǎng)基環(huán)境，在確保營養(yǎng)供給充足的基礎(chǔ)上，保障小孢子雄核的發(fā)育質(zhì)量。

5.3 加強林木花藥培養(yǎng)機理

在現(xiàn)階段花藥離體培養(yǎng)過程中，再生植株倍性混亂十分常見，因此，應加強林木花藥培養(yǎng)機理的理論研究，在創(chuàng)新應用現(xiàn)代分子生物學手段的過程中，拓寬單倍體植株的花藥獲取途徑，清楚把握不同林木植株所適用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)環(huán)境，最終在借鑒農(nóng)作物育種手段的基礎(chǔ)上，促進林木育種工作的創(chuàng)新發(fā)展。

6 結(jié)語

綜上所述，在現(xiàn)代科學技術(shù)不斷發(fā)展過程中，林木育種的手段更加多樣，更加有效，以花藥離體培養(yǎng)為支撐的單倍體育種關(guān)鍵在于針對不同的林木植株選擇恰當?shù)幕ㄋ庪x體培養(yǎng)方式和培養(yǎng)環(huán)境。因此，應深入研究當前國內(nèi)外林木花藥離體培養(yǎng)領(lǐng)域存在的不足，在探索全新花藥離體培養(yǎng)途徑的基礎(chǔ)上促進林木育種水平的顯著提高，最終推動我國林業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)創(chuàng)新發(fā)展。