霍蘇曼，劉刈釗，丁 成，羊雪芹

(1. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院浙江省器官發(fā)育與再生技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311121； 2. 杭州師范大學附屬醫(yī)院，浙江 杭州 310015)

哺乳動物顱面部器官如牙齒、腭板、舌頭等是機體重要的功能單位，其器官發(fā)生和發(fā)育過程由顱面神經嵴來源的間充質細胞和相鄰組織的相互作用所調節(jié)[1-3].這些組織之間的相互作用是通過成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、刺猬蛋白(sonic hedgehog，SHH)、WNT等信號通路以及轉錄因子包括Homeo-box、Paired-box、T-box等組成的復雜網絡來實現(xiàn)的[4-9].其中轉錄因子Msx1和Pax9對哺乳動物顱面部器官的發(fā)育非常關鍵，人類MSX1基因缺陷會表現(xiàn)出唇腭裂、牙齒發(fā)育不全等先天性缺陷，敲除小鼠也有同樣的表型[7,10-13].唇腭裂是人類最常見的新生兒顱面部缺陷，也是顱面部器官發(fā)育缺陷中的典型表型，其發(fā)生主要涉及腭板和牙齒等器官的發(fā)育.本文擬通過綜述哺乳動物中轉錄因子Msx1和Pax9的基因表達和功能，分析并探索兩者在哺乳動物顱面部器官發(fā)育中的協(xié)同作用，以期為進一步研究顱面部器官發(fā)育的分子網絡奠定基礎.

1 Msx1與Pax9的基因表達

脊椎動物Msx基因最初是從小鼠中克隆出來的，被鑒定為果蠅肌節(jié)同源盒基因(muscle segment homeobox，Msh)的同源基因.Msh家族成員中的Msx1和Msx2在小鼠胚胎發(fā)生過程中有共同的DNA結合位點，作為抑制因子在上皮-間充質相互作用的部位表達，在腮弓、四肢和神經系統(tǒng)表現(xiàn)出部分重疊的功能[14-17]，另一家族成員Msx3僅局限表達于背側神經管中[18].

Pax家族中的Pax9與Pax1高度同源，同屬于Pax1/9亞家族.Pax1/9在腮弓、胸腺、骨骼形成等發(fā)育方面有重要作用.Pax9是上皮和間質細胞的一個重要轉錄因子，最早出現(xiàn)在小鼠胚胎期第8.5天(E8.5)的前腸上皮細胞，隨后在腭板發(fā)育過程中表現(xiàn)出口—鼻和頰—舌的梯度表達[19-20].

生物體中基因的功能與表達位置密切相關.哺乳動物腭板和牙齒的早期發(fā)育都是通過外胚上皮與神經嵴來源的間充質之間相互作用而完成.哺乳動物腭板的形成時期集中于E12.5—E15.5，包括腭板的垂直生長、抬升、水平生長和融合過程.腭板向舌的方向進行垂直生長的過程(E12.5—E13.5)中，Pax9在腭板前端口—鼻軸方向的間充質呈現(xiàn)由高到低的梯度表達，腭板后部中口—鼻均有強烈表達，而Msx1高表達于上頜磨牙附近的腭板間充質，且具有嚴格的時空特異性[7,19,21-23].E13.5—E15.5期，腭板處于從抬升到融合過程，Pax9在其中的表達由高峰逐漸減弱至最終消失，Msx1則沒有明顯的表達[22-23].

胚胎發(fā)育早期Msx1和Pax9的活躍表達是牙齒發(fā)育的一個啟動信號，對牙齒的形成有重要的作用[22].以小鼠的第一磨牙為例，其早期發(fā)育過程依次經歷牙板期、蕾狀期、帽狀期以及鐘狀期4個時期.E11.5牙板期時，Msx1開始集中表達于下頜骨增厚的上皮周圍的間質細胞，激活BMP和FGF信號通路.E12.5—E15.5期牙上皮細胞增殖并向下生長侵入下層間充質，牙源性上皮向下緩慢生長，其間Msx1表達量最大，鐘狀期后表達量快速下降[19].E10.5牙齒發(fā)生之前，Pax9就開始在牙胚間充質表達啟動牙齒發(fā)育信號，之后持續(xù)在間充質表達以調節(jié)周圍細胞增生和組織形成[7].

2 Msx1的功能

脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，Msx1在臨近上皮的間充質中表達，參與信號傳導過程，激活或者抑制下游基因的轉錄，影響腭板和牙齒等器官的發(fā)生和發(fā)育.例如，Msx1能夠通過作用于下游基因MyoD，抑制骨骼肌分化[24-25].Msx1的缺失，會導致腭板間充質神經嵴來源的細胞增殖活性降低，同時牙間充質會出現(xiàn)錯誤的分化現(xiàn)象[26]，敲除小鼠的Msx1基因會破壞正常細胞周期進程，導致腭板間充質的細胞增殖失調進而引起腭裂[27].Msx1缺失的小鼠還表現(xiàn)出無牙以及顱面部骨骼發(fā)育異常等表型[22,26,28].人類疾病研究發(fā)現(xiàn)，Msx1的基因突變患者往往表現(xiàn)出牙齒發(fā)育不全、少牙癥、牙齒畸形、唇腭裂等部分或全部缺陷，影響人類的面部形態(tài)和正常的生理生活[4,11,28-29].

Msx1對腫瘤生長、胚胎著床等生物活動也有重要的調節(jié)作用[4,29].人類的多種惡性腫瘤(如乳腺癌、子宮內膜癌等)確定與Msx1的下調相關.研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過程中，Msx1可以通過誘導G1/S細胞周期阻滯和細胞凋亡抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，控制腫瘤細胞的進展[30-32].另外，哺乳動物Msx1基因能通過控制子宮間質和上皮細胞之間的旁分泌信號來調控胚胎著床.在胚胎著床前，Msx1等轉錄因子重疊表達于子宮上皮和基質中，在小鼠中敲除Msx1會使得子宮上皮細胞表現(xiàn)出持續(xù)的增殖活性，無法附著在胚胎上，導致胚胎植入失敗[33].

3 Pax9的功能

哺乳動物胚胎發(fā)育中Pax9非常關鍵.研究發(fā)現(xiàn)，在表皮-間充質互作的腭板發(fā)育過程中，Pax9沿腭板從后向前呈現(xiàn)梯度表達并對腭板的生長、抬升和融合起關鍵作用，突變體胚胎中的Bmp4、Fgf10、Msx1和Osr2基因表達顯著下調，突變小鼠表現(xiàn)出腭裂和牙齒發(fā)育停滯[7,23,34].在腭板間充質中特異性敲除Pax9，使得上皮細胞中腭板生長的正反饋因子SHH的表達下調，細胞分裂受到影響從而導致腭板發(fā)育受阻[7,34-35].Pax9敲除會導致WNT信號通路的抑制因子Dkk1表達下調，在Pax9敲除小鼠中同時過表達Dkk1，能夠部分挽救Pax9缺失后導致的腭裂現(xiàn)象[36-37].小鼠胚胎發(fā)育的E10.5—E12.5期，Pax9作為一種優(yōu)先啟動表達的因子，在牙齒間充質區(qū)域的標志性表達，提示Pax9對牙齒發(fā)育的整個過程都具有調控作用[7].小鼠胚胎發(fā)育中Pax9的缺失，會導致牙齒發(fā)育在蕾狀期就停滯[7,21,23]，人類PAX9突變則與非綜合征型牙齒發(fā)育不全、綜合征型發(fā)育不全以及少牙癥密切相關[11].

在胸腺、肢芽、味蕾和骨骼的形成與發(fā)育等方面，Pax9也非常重要.小鼠胚胎發(fā)育的E8.5開始，血管和咽部內胚層的發(fā)育需要Pax9的參與，突變體中血管發(fā)育受影響會導致先天性心臟缺陷，在咽部內胚層Pax9的表達過程中，胸腺上皮細胞中Pax9基因的缺失干擾內胚層向周圍間充質組織內陷，影響早期胸腺的生成[38-39].研究發(fā)現(xiàn)Pax9缺陷小鼠舌中部的周緣乳頭和葉狀乳頭發(fā)育停滯，且Pax9對于發(fā)育和分化階段的舌真菌狀乳頭必不可少，表明Pax9對味蕾祖細胞的發(fā)育和命運決定非常必要[7,40].Pax9還影響哺乳動物肢芽的發(fā)育，突變小鼠表現(xiàn)為前肢多趾、后肢缺陷[7].此外，Pax9還能影響骨骼的形態(tài)發(fā)生過程，在發(fā)育中的椎骨和四肢中都有表達[20].

圖1 Msx1與Pax9信號網絡及功能示意圖Fig.1 The diagram of the signaling regulation network and functions of Msx1 and Pax9

4 Msx1與Pax9的協(xié)同作用

總體而言，在哺乳動物顱面部器官的發(fā)生和發(fā)育過程中，Msx1和Pax9對于腭板和牙齒的發(fā)育都非常重要.敲除Msx1基因會破壞正常細胞周期進程，導致腭板間充質的細胞增殖失調進而影響腭板融合[22]，Pax9在腭板前后軸的表皮-間充質互作中調控基因表達，兩者都影響著腭板的生長、抬升和融合[7,37].Msx1作為牙間質的重要調節(jié)因子，不僅受到牙上皮信號的調控而表達，而且還調節(jié)下游靶基因并反饋信號至上皮[22,41]，具有嚴格的時空特異性，缺失會導致牙齒停止發(fā)育表現(xiàn)出無牙.同樣局限表達于牙間充質的Pax9，是牙源性間充質的標志物，突變小鼠牙齒發(fā)育在萌芽階段就停滯了，與多數牙先天缺失密切相關[7].因此筆者推測，在依賴于上皮-間充質互作模式的器官發(fā)育過程中，Msx1與Pax9存在于一定的信號網絡中(圖1)，Pax9可能是Msx1的上游基因，或者兩者在某些生化過程中存在協(xié)同作用.

腭板發(fā)育方面的研究發(fā)現(xiàn)，Pax9敲除的小鼠與Msx1敲除的小鼠類似，突變鼠均具有腭裂并結合無牙表型[10-11]，并且人PAX9的基因突變也會導致腭裂[42-44].此外，在懷孕的Pax9缺陷小鼠的胚胎中，WNT信號抑制劑Dkk1的介導能夠挽救腭板的發(fā)育，而同樣情況下Dkk1不能挽救Msx突變小鼠的牙齒形態(tài)[37,45].Pax9在腭板中對Msx1基因的表達有調控作用[34]，提示Pax9很可能是通過Msx1來調控腭板發(fā)育的.我們預測Msx1、Pax9、Osr2和Bmp4之間形成一定的信號網絡，且Pax9對Msx1具有直接的正向調控作用(圖1).

在對牙齒的研究中發(fā)現(xiàn)，Pax9在牙齒間充質中具有信號啟動的作用[7].研究發(fā)現(xiàn)早期牙齒發(fā)育過程中Pax9具有獨立于Msx1的關鍵功能，且在Msx1和Osr2的上游遺傳起作用，Pax9 能夠直接調控Msx1，并且在蛋白水平與MSX1相互作用，反向激活牙齒發(fā)育中Msx1和Bmp4的表達[23].Pax9對于Bmp4的表達調控早于Msx1，并且在涉及Bmp4的信號通路中，Pax9和Msx1具有協(xié)同作用[23].在轉錄水平上，Pax9與Msx1相互作用并通過形成蛋白復合物調控Bmp4的表達，決定牙齒從芽期到帽期過渡的發(fā)育過程[23,40]，影響門牙大小和對稱性的多個信號傳導通路[27].Msx1與Pax9在基因組水平特定位點的單核苷酸多態(tài)性，與牙齒發(fā)育不全及關聯(lián)腭板發(fā)育問題密切相關[46].生化分析表明，Osr2通過Msx1和Pax9蛋白質的物理相互作用在牙源性間充質發(fā)揮調控作用[23].臨床研究發(fā)現(xiàn)，人類牙齒發(fā)育中MSX1和PAX9具有協(xié)同作用，免疫沉淀和GST相互作用試驗也發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質之間存在物理聯(lián)系.進一步的生化數據和人類遺傳學及小鼠模型的表達分析，也顯示Msx1與Pax9在牙齒發(fā)育過程中有功能性關聯(lián)[11,43].

綜上所述,Msx1和Pax9基因在哺乳動物顱面部中表達，與腭板和牙齒的發(fā)生發(fā)育密切相關，并且存在于一定的信號網絡中，在器官發(fā)育和功能調節(jié)中具有協(xié)同作用.然而作為轉錄因子，Msx1和Pax9基因如何調節(jié)細胞內信號，如何介導組織間相互作用，如何影響下游靶基因在器官發(fā)生中的細胞過程和生物學活動等都需要更多的科學實驗來研究.