聯(lián)合應(yīng)用線粒體SNP和線粒體DNA高變區(qū)測(cè)序排除同一母系鑒定1例

錢雪松

上海東南鑒定科學(xué)研究所，上海 200051

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

因申報(bào)戶口需要，養(yǎng)父母攜養(yǎng)女來本所，要求對(duì)養(yǎng)父母與養(yǎng)女之間是否存在親生血緣關(guān)系進(jìn)行鑒定。鑒于養(yǎng)父母各有一個(gè)姐姐，還要求對(duì)養(yǎng)父母與養(yǎng)女是否來源于同一母系進(jìn)行鑒定。

1.2 常染色體STR檢驗(yàn)

提取養(yǎng)父母與養(yǎng)女的血樣DNA，應(yīng)用MicroreaderTM21（Direct）ID System（北京閱微基因技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行PCR 復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500xL 基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）電泳分離和激光掃描分析，用GeneMapperTMID-X軟件（美國Applied Biosystems 公司）分析，得到3 份血樣的分型結(jié)果。結(jié)果表明，養(yǎng)女在D19S433、D18S51、D6S1043等多個(gè)基因座的等位基因不能從養(yǎng)父母的基因型中找到來源，父女、母女的累積親權(quán)指數(shù)均小于1/10 000。

1.3 線粒體SNP檢驗(yàn)

取適量上述血樣DNA，應(yīng)用Expressmarker mtDNASNP60熒光檢測(cè)試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR 復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500xL 基因分析儀電泳分離和激光掃描分析，用GeneMapperTMIDX軟件分析，得到上述檢材的分型結(jié)果。結(jié)果（表1）表明，養(yǎng)父與養(yǎng)女在檢測(cè)的60 個(gè)SNP 位點(diǎn)上有14 個(gè)SNP 位點(diǎn)分型結(jié)果不同，可以排除養(yǎng)父的姐姐為養(yǎng)女的生物學(xué)母親。養(yǎng)母與養(yǎng)女在檢測(cè)的60 個(gè)SNP 位點(diǎn)上分型結(jié)果均相同，無法排除養(yǎng)母的姐姐為養(yǎng)女的生物學(xué)母親。

表1 線粒體SNP的檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of mitochondrial SNP

1.4 線粒體DNA高變區(qū)序列檢驗(yàn)

取適量上述血樣DNA，用引物L(fēng)16047/H16464和L29/H408 對(duì)線粒體DNA 高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500xL 基因分析儀電泳分離和激光掃描分析，并與Anderson 標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，得到上述血樣的線粒體DNA 序列特征。結(jié)果（表2）表明，養(yǎng)父與養(yǎng)女、養(yǎng)母與養(yǎng)女在線粒體DNA 高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ的序列特征不一致，在排除養(yǎng)父的姐姐為養(yǎng)女生物學(xué)母親的基礎(chǔ)上進(jìn)一步排除了養(yǎng)母的姐姐為養(yǎng)女的生物學(xué)母親。

表2 線粒體DNA高變區(qū)的測(cè)序結(jié)果Tab.2 Sequencing results of mitochondrial DNA hypervariable region

1.5 鑒定意見

依據(jù)現(xiàn)有資料和常染色體STR 檢驗(yàn)結(jié)果，排除養(yǎng)父是養(yǎng)女的生物學(xué)父親，排除養(yǎng)母是養(yǎng)女的生物學(xué)母親。

依據(jù)現(xiàn)有資料和線粒體DNA 檢驗(yàn)結(jié)果，排除養(yǎng)父、養(yǎng)母與養(yǎng)女來源于同一母系。

2 討論

人類線粒體DNA 被認(rèn)為是嚴(yán)格遵照母系遺傳的。受精過程中只有精子核進(jìn)入卵細(xì)胞，直接與卵細(xì)胞核結(jié)合，精子并不提供其他的細(xì)胞成分。當(dāng)受精卵細(xì)胞分裂、胚囊發(fā)育時(shí)，除細(xì)胞核外，細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞組分與母親的卵細(xì)胞是一致的。因此，母體中線粒體DNA 分子直接傳給所有子代且不受任何男性因素影響。在沒有突變的情況下，母親將其線粒體DNA傳給子女，兄弟姐妹就與母系親屬擁有了相同的線粒體DNA序列，由此可知，每個(gè)個(gè)體的線粒體DNA分型并不是獨(dú)一無二的[1]。線粒體DNA 分析的缺點(diǎn)之一就是在各人群都存在一些很常見的單倍體。例如在美國聯(lián)邦調(diào)查局（Federal Bureau of Investigation，F(xiàn)BI）的線粒體DNA 數(shù)據(jù)庫所包含的1 655 個(gè)高加索人樣本中，有131 名個(gè)體都表現(xiàn)為“263G、315.1C”這種常見型，另外還有264 名個(gè)體與這種常見型僅存在1 個(gè)堿基的差異。也就是說，如果一個(gè)未知樣本表現(xiàn)為這種常見單倍體，那么數(shù)據(jù)庫中1 655 個(gè)高加索人中的395個(gè)（23.9%）都不能被排除[1]。

線粒體DNA 的大小約16 569 bp[1]，不同廠家的試劑盒選擇的檢測(cè)技術(shù)和位點(diǎn)有所不同，由于線粒體的遺傳特性，存在無關(guān)個(gè)體線粒體分型一致的情況，即便是變異率較高的線粒體DNA 控制區(qū)內(nèi)也只有1%～2%的變異（不相同）[1]，因此，線粒體DNA 檢測(cè)結(jié)果不能用于同一個(gè)體或同一母系認(rèn)定，而是通過進(jìn)一步補(bǔ)充檢測(cè)作為能否排除的依據(jù)。

本例中，養(yǎng)母與養(yǎng)女的常染色體STR 分型結(jié)果顯示無親生血緣關(guān)系，但在Expressmarker mtDNASNP60 熒光檢測(cè)試劑盒的60 個(gè)SNP 位點(diǎn)上分型結(jié)果均一致。據(jù)此，在不能排除同一母系的情況下，領(lǐng)養(yǎng)報(bào)戶程序難以進(jìn)行，經(jīng)與委托人反復(fù)核實(shí)其領(lǐng)養(yǎng)情況屬實(shí)后考慮增加位點(diǎn)進(jìn)一步確認(rèn)。因線粒體DNA 控制區(qū)的變異率高，且均散布在高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ，所以使用引物針對(duì)該兩區(qū)進(jìn)行雙向測(cè)序分析，結(jié)果顯示養(yǎng)母及養(yǎng)女存在5個(gè)序列（16183、16193.1、195、204、309.1）特征不一致，排除來源于同一母系。

綜上，在領(lǐng)養(yǎng)案的同一母系認(rèn)定（排除）鑒定中，Expressmarker mtDNA-SNP60 熒光檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用往往因其操作便利而被廣泛使用[2]，但其所涉及位點(diǎn)未在高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ達(dá)到全覆蓋（60 個(gè)SNP位點(diǎn)有8 個(gè)位于高變區(qū)）。一般情況下，使用試劑盒檢出結(jié)果完全一致的無關(guān)個(gè)體并不多見，但本例檢測(cè)結(jié)果提示，使用試劑盒檢測(cè)可能存在位點(diǎn)不足的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在試劑盒檢測(cè)結(jié)果與案情相矛盾時(shí)，應(yīng)該考慮進(jìn)行線粒體測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。