朱昊，賈劍超，俞蘭

0 引言

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性實體瘤之一，GLOBOCAN 2018年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球胃癌發(fā)病率居第五位，死亡率排名第三；當年我國新確診胃癌病例數(shù)逾45萬例，約占全部癌癥發(fā)病數(shù)的10.6%，發(fā)病率為30.00/10萬，且呈上升趨勢[1-2]。近年來，隨著內(nèi)鏡技術的迅猛發(fā)展和普及，顯著提高了胃癌的早診率，但其五年生存率仍徘徊在20%左右，仍有多數(shù)患者確診時已處于晚期[3-4]。惡性程度較高的胃癌，其進展至晚期的過程也很迅速，手術治療后仍有可能復發(fā)或轉移[5-6]。此外，胃癌發(fā)生發(fā)展各階段缺乏可靠的早診、療效判定、轉移監(jiān)測及預后評估的生物標志物，胃癌患者預后差的現(xiàn)狀未得到有效扭轉[7-8]。

尋找生物標志物一直是此領域的研究熱點，基因檢測為胃癌組織分型和靶向治療提供了依據(jù)，但由于檢測手段和成本的限制，在短期內(nèi)普及還很難[9]。液體活檢無創(chuàng)且便易，目前臨床液體活檢的輔助診斷腫瘤標志物，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）敏感度和特異性相對較低，體液中有多種標志物在胃癌的早診、療效和預后評估等方面具有較高的敏感度和特異性；隨著研究的深入，液體活檢有望成為胃癌早診和監(jiān)測的常規(guī)檢測方法[10-14]。

環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一類含量豐富的內(nèi)源性非編碼RNA，具有共價閉合環(huán)狀結構，且生物學特性穩(wěn)定便于檢測；circRNA不僅成為腫瘤靶向治療領域研究的熱點，而且作為液體活檢的新主角備受關注[15]。本文就circRNA的腫瘤生物學特性、存在形式、在胃癌早診、療效監(jiān)測及預后評估等方面作一綜述。

1 circRNA液體活檢的生物學基礎

1.1 circRNA的特性、分類與功能

circRNA主要由前體mRNA通過反向剪接形成，其下游的5′剪接位點與上游的3′剪接位點共價連接，使其缺少3′端poly A尾和5′端帽結構，不易被核酸外切酶RNaseR降解[16]；同時，研究發(fā)現(xiàn)血漿中circRNA的平均半衰期超過48 h，而mRNA僅為10 h[17]，表明circRNA比線性mRNA具有更高的穩(wěn)定性。此外，circRNA豐富且特異，尤其外泌體中的circRNA含量是其分泌細胞中的兩倍；且差異表達的circRNA能夠用來區(qū)分癌癥患者與健康人群[18]。這些特性使circRNA的液體活檢具有可靠性和可行性。

circRNA含量豐富可能與其形成方式有關，基因組的任何區(qū)域均可合成，同一基因也可產(chǎn)生多種類的circRNA[18]。circRNA按不同的編碼環(huán)化方式主要分為三類：（1）外顯子circRNA（exonic circular RNA,ecircRNA），主要通過套索驅動環(huán)化形成，也可通過RNA結合蛋白介導的環(huán)化形成，在胞質(zhì)含量豐富，是最常見的circRNA；（2）內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNA,ciRNA），主要由內(nèi)含子配對驅動的環(huán)化形成；（3）外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-intron circular RNA,EIciRNA），是由外顯子和內(nèi)含子共同構成，主要位于細胞核，參與親本基因調(diào)控[19-20]。

circRNA多元化的結構賦予其不同的功能，不僅可作為microRNA（miRNA）海綿，通過競爭性結合miRNA間接調(diào)控其下游靶基因的表達；而且，circRNA也是蛋白結合RNA，與RNA結合蛋白的結合可調(diào)控基因轉錄，進而調(diào)控蛋白功能；同時還被證實circRNA可行使編碼功能，有部分circRNA可以編碼多肽，通過該多肽行使下游調(diào)控功能[10,18,21]。目前，多項報道已揭示circRNA的異常表達與各類癌癥密切相關，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡，在癌癥基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10,21]。

1.2 circRNA在體液中的特性

circRNA存在于人體多種體液中，因其不易被RNaseR降解，故能在人類細胞、血漿或胃液中穩(wěn)定表達[22-23]，也為血漿circRNA分析研究提供了先決條件。與尿液、唾液及腦脊液相比，外周血是circRNA液體活檢最常用的體液樣本[24]；根據(jù)circRNA在循環(huán)血中不同的存在形式可將其分為兩類：游離于細胞外的circRNA（cell-free circRNA,cf-circRNA）和血細胞中的circRNA。血液中的circRNA由不同的組織細胞產(chǎn)生并釋放進入血液，包括血漿、血清和細胞外囊泡中的circRNA。cf-circRNA作為生物標志物具有追蹤其組織來源的臨床意義[25-26]；單核細胞、紅細胞、中性粒細胞和血小板等血液細胞均含有circRNA，不同血液成分中circRNA的異常表達可以反映疾病的狀態(tài)和水平[26]。circRNA作為生物標志物在全血中代表了個體對不同病理或生理變化的特異性反應[27-29]，在液體活檢中具有潛在的應用價值。近年來對外泌體深入研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可借助外泌體進入血液循環(huán)。

1.3 外泌體

外泌體是直徑為30～100 nm的微囊泡；在細胞內(nèi)經(jīng)多囊泡體外膜和細胞膜融合后釋放到細胞外基質(zhì)，外泌體存在于多種體液中，包括血液、尿液、唾液和母乳等，其內(nèi)容物種類類似于母源細胞，含有組織特異性的生物標志物，除了蛋白質(zhì)和脂類外，外泌體內(nèi)還含有大量核酸，如DNA、mRNA、miRNA、lncRNA以及circRNA等，外層的脂質(zhì)雙分子層可保護核酸不被降解[30]。這些核酸經(jīng)外泌體與靶細胞膜融合被遞送到受體細胞，調(diào)控受體細胞的蛋白表達、信號通路和表觀遺傳[31]。

腫瘤circRNA主要通過包裝成外泌體的形式分布于循環(huán)系統(tǒng)中，腫瘤細胞產(chǎn)生和釋放大量的外泌體，即腫瘤來源的外泌體（tumor-derived exosome,TEX），TEX釋放量明顯高于正常細胞，可介導腫瘤細胞間通訊，將特定的蛋白或核酸轉運到腫瘤的鄰近組織或遠處即將發(fā)生轉移部位的受體細胞[32-33]。TEX在癌癥患者的體液中廣泛存在，含有的生物標志物可區(qū)別來源于正常細胞的外泌體，二者在血漿中的比例雖因人而異，但更多證據(jù)表明TEX占比較大，特別是惡性腫瘤晚期患者[33]。不同類型的腫瘤細胞釋放的TEX具有不同的分子特征[32]。因此外泌體可用于臨床無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷；基于外泌體的診斷可以更高效地監(jiān)測癌癥的分子特征，且血液標本比病理活檢更易重復采集[34]。

2 circRNA液體活檢在胃癌早期診斷中的作用

circRNA的穩(wěn)定性使其特異性診斷胃癌成為可能，利用circRNA液體活檢技術早期診斷胃癌已成為當前的研究熱點。有學者分別分離純化了80例胃癌患者與健康者血漿外泌體中的circRNA，發(fā)現(xiàn)circNRIP1在胃癌患者血漿中表達水平顯著升高[35]。Zhang的科研團隊使用100對胃癌組織及其相應癌旁組織進行生物標志物研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001811在胃癌組織和患者血漿中均低表達：ROC曲線下面積分別為0.658和0.747，兩者結合后曲線下面積上升至0.824[36]。另有研究證明血清外泌體circCD2AP診斷胃癌敏感度和特異性分別為75.56%和88.89%[37]。提示不論是hsa_circ_0001811，還是circCD2AP，隨著研究的深入，均有可能成為胃癌液體活檢診斷的生物標志物。

一些特殊類型的胃炎與胃癌的發(fā)生關系密切，這些類型的胃炎可在特定階段演進發(fā)展成胃癌，因此，從重度胃炎中鑒別出早期胃癌尤為重要。例如慢性萎縮性胃炎被認為是胃癌的獨立危險因素，盡早診斷該類型胃炎對于早期防控胃癌具有實際作用。為尋找胃癌、胃炎的circRNA差別，有研究收集了120例胃癌患者、104例健康者以及70例胃炎患者的血漿，分析三組的circPTPN22表達水平，發(fā)現(xiàn)三組的circPTPN22表達水平胃癌＞胃炎＞健康，呈梯度關系，差異有統(tǒng)計學意義，該研究同時觀察了腫瘤標志物情況，對胃癌、胃炎患者和健康者血漿中的circPTPN22、CEA、CA19-9進行單獨和聯(lián)合ROC曲線分析，在胃癌的診斷效率方面，circPTPN22的AUC值為0.857，敏感度為78%，特異性為84%，總準確度80%，陽性預測值84%，陰性預測值76%，均高于單獨分析CEA和CA19-9的上述對應指標。若將circPTPN22與CEA聯(lián)合分析，其AUC值為0.878，與CA19-9聯(lián)合后的AUC值為0.866。在胃炎的診斷效率方面，circPTPN22聯(lián)合CEA后AUC值為0.817，聯(lián)合CA19-9后AUC值為0.833，三者聯(lián)合AUC值為0.856，診斷效率雖略低于胃癌，但可以看出，不論是診斷胃癌還是高患癌風險胃炎，將circRNA與腫瘤標志物聯(lián)合分析，診斷敏感度明顯升高，可以彌補單一標志物的局限性，而且circPTPN22作為胃癌早診生物標志物應用于液體活檢具有潛在價值[38]。

胃液是胃內(nèi)分泌物的總稱，可無創(chuàng)收集，所以與大多數(shù)體液相比，胃液在疾病診斷、反映胃癌病情方面具有明顯的優(yōu)勢[39-40]。有研究發(fā)現(xiàn)：hsa-circ-0014717在胃癌組織中的表達水平與腫瘤分期、遠處轉移、組織CEA和CA19-9的表達顯著相關；而且，hsa-circ-0014717能穩(wěn)定存在于人胃液中，存在形式和濃度均符合臨床檢測要求。在慢性萎縮性胃炎患者胃液中發(fā)現(xiàn)hsa-circ-0014717水平明顯降低；基于此研究結果，胃液中的hsacirc-0014717有可能作為先于胃鏡檢查的廣泛篩查慢性萎縮性胃炎液體活檢生物標志物[22,41]。但是該研究僅在健康者與胃炎患者的胃液中檢測了circRNA的表達差異，卻未比較諸如血液等其他體液中的表達差異。Shao等的一項研究在41例健康志愿者以及39例早期胃癌患者血漿外泌體中檢測發(fā)現(xiàn)，早期胃癌患者外泌體hsa_circ_0065149的水平明顯低于健康對照組（P＜0.001），并認為血漿外泌體hsa_circ_0065149可作為早期篩選胃癌的生物標志物，比傳統(tǒng)的臨床生物標志物具有更高的敏感度和特異性；該團隊進一步在健康志愿者、胃潰瘍患者、慢性萎縮性胃炎患者以及胃癌患者四組人群的胃液中檢測hsa_circ_0065149的表達差異，遺憾的是，hsa_circ_0065149在四組人群的胃液中并無顯著表達差異[42]。血漿外泌體與胃液中的檢測結果不一致究竟是由于樣本量的不足，還是不同疾病之間胃液circRNA表達差異與血漿外泌體circRNA差異不相一致？對于某些circRNA作為胃癌早期生物標志物時，用胃液作為血漿的替代液體活檢有待進一步論證。

綜上，circRNA作為胃癌液體活檢的生物標志物比常規(guī)腫瘤標志物具有更高的敏感度與特異性，若與CEA等蛋白生物標志物聯(lián)合檢測可能提高診斷的準確性；利用circRNA液體活檢技術可對胃癌進行早期篩查和診斷，值得臨床推廣。

3 circRNA液體活檢在胃癌療效評價中的作用

胃癌耐藥是導致治療低效、癌癥擴散和轉移的重要原因之一。Huang的研究團隊發(fā)現(xiàn)：與順鉑治療敏感的患者樣本及細胞系相比，circAKT3在順鉑耐藥者的胃癌組織和耐藥細胞模型中表達均明顯升高，并證明circAKT3是通過抑制miR-198的表達、上調(diào)PIK3R1、促使胃癌對順鉑產(chǎn)生耐藥[43]；血清外泌體circAKT3已被證實在肝癌患者中的表達明顯高于正常對照組，其在胃癌患者體液中的表達變化值得進一步研究[44]。另有研究報道，circ_0032821在奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）耐藥的胃癌細胞內(nèi)和細胞釋放的外泌體中表達顯著升高，增強胃癌細胞對OXA的抵抗能力，并促進胃癌增殖、遷移和侵襲[45]。針對circAKT3與circ_0032821的研究均闡述了circRNA參與胃癌產(chǎn)生耐藥的機制；表明circAKT3和circ_0032821不僅可以作為耐藥型胃癌患者的潛在治療靶點，還可通過液體活檢持續(xù)監(jiān)測接受相應藥物治療患者的耐藥狀態(tài)、評估病情發(fā)展、指導臨床用藥[43-45]。

在治療胃癌原發(fā)灶的同時，嚴密監(jiān)測胃癌的轉移狀態(tài)至關重要。肝臟是胃癌轉移的主要器官之一，胃癌肝轉移患者的5年生存率僅為10%左右。血清外泌體circCD2AP不僅可以用于診斷胃癌，而且其與臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結和肝轉移顯著相關，circCD2AP在監(jiān)測胃癌轉移能力方面具有潛在的應用價值[37]。

Chen研究團隊分別選取104例胃癌患者和健康者血漿樣本，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中hsa_circ_0000190表達與健康對照組相比明顯下調(diào)，且其表達水平與CEA水平正相關[46]。也有研究表明，在36例胃癌患者血漿樣本中發(fā)現(xiàn)hsa_circ_002059表達水平與TNM分期（P=0.042）、遠處轉移（P=0.036）、性別（P=0.002）、年齡（P=0.022）等多種胃癌患者臨床及病理特征相關[47]。上述兩項研究都表明了circRNA液體活檢在胃癌治療過程中監(jiān)測轉移及病情發(fā)展中的應用價值，但circRNA液體活檢在精準治療領域的研究仍有待進一步探索。

前文提及的circNRIP1不僅在胃癌患者血漿中表達水平顯著升高，而且參與胃癌細胞間信號轉導，并誘導上皮細胞間充質(zhì)轉化進而促進癌細胞轉移，提示對胃癌靶向治療circNRIP1的可能性[35]。值得關注的是，Liu的團隊在體外成功合成了一種circRNA，命名為scRNA21，并包裝成外泌體，使其在胃癌細胞中表達，再通過競爭性吸附miR-21促進胃癌細胞凋亡[48]。即利用circRNA的生物學特性，模仿外泌體的作用原理，將可能成為胃癌治療的又一利器。

簡言之，circRNA的液體活檢技術可全程監(jiān)測胃癌耐藥，指導臨床用藥，并為胃癌靶向治療的精準施策提供了新的可能性，潛在的臨床價值將會受到密切關注。

4 circRNA液體活檢在胃癌預后評價中的作用

circRNA與腫瘤負荷程度密切相關，大量研究表明在胃癌患者術前與術后的血液中circRNA表達水平差異顯著，通過檢測circRNA可以篩選有高復發(fā)風險的患者，也可以了解疾病進展和預后情況，利用circRNA液體活檢技術評估胃癌預后具有重要的臨床意義[26]。良好胃癌診篩能力的circRNA極有可能同時具有預測胃癌預后能力。Zhang團隊研究hsa_circ_0001811用于胃癌早診的同時，分析42例胃癌患者術前和術后血漿樣本與42例健康志愿者血漿樣本，證明hsa_circ_0001811在術前術后表達差異存在顯著統(tǒng)計學意義[36]。另有研究也發(fā)現(xiàn)hsa_circ_002059在36例胃癌患者術前與術后的血漿表達水平具有顯著差異，ROC下面積為0.73，敏感度為0.721，特異性為0.683[47]。且hsa_circ_002059與腫瘤分級及遠端轉移相關，可作為胃癌預測預后標志物[47]。同樣，Ma的研究團隊通過分析20例初診接受手術治療的胃癌患者血漿circPTPN22表達水平，發(fā)現(xiàn)同一例患者術后血漿中circPTPN22表達水平顯著降低，且生存曲線提示低表達組生存率優(yōu)于高表達組；意味著circPTPN22用于液體活檢可以有效跟蹤胃癌術后預后情況[38]。

Xie等研究發(fā)現(xiàn)circSHKBP1在胃癌組織和血清中表達均升高，circSHKBP1通過海綿性吸附miR-582-3p促使HUR表達，增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，促進癌癥的惡性表型；此外，circSHKBP1直接與HSP90結合，阻礙STUB1與HSP90的相互作用，抑制HSP90的泛素化，導致胃癌快速進展，其高表達預示著胃癌患者TNM分期較晚以及血管侵犯嚴重，提示患者的預后不良[49]。所以，胃癌中某些circRNA表達異常導致高度惡性表型，能預測患者預后不良。Li等研究證明hsa_circ_0061276與hsa_circ_0001017在手術前后血漿中的表達水平可作為胃癌復發(fā)的獨立監(jiān)測指標；該團隊將術前患者血漿中hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276的表達水平按中位數(shù)的大小分為低、高表達組，結果顯示，hsa_circ_0001017低表達組患者的總生存時間（OS=60月）與高表達組（OS=84月）相比明顯縮短，hsa_circ_0061276的水平與患者預后不良有關；進一步單因素和多因素Cox比例風險模型分析表明，血漿hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276可能作為胃癌患者OS的獨立預后指標，且hsa_circ_0001017在胃癌不同分期的表達水平也可作為患者無病生存時間（diseasefree survival,DFS）的獨立預后指標[50]。Peng等研究揭示hsa_circ_0010882在胃癌患者血漿中高表達且與預后不良相關；該研究通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010882高表達與OS縮短密切相關，Cox回歸模型顯示hsa_circ_0010882可能是胃癌患者OS的獨立不良預后因素，提示血漿hsa_circ_0010882高表達可作為胃癌患者的潛在預后預測因子[51]。

5 circRNA液體活檢在胃癌診療中的應用

circRNA液體活檢是一種革命性的胃癌檢測方法，能夠支持人類胃癌的診斷、預后和治療指導。circRNA液體活檢在胃癌診療中的應用，見表1。

表1 circRNA液體活檢在胃癌診療中的應用Table 1 Application of circRNA liquid biopsy in diagnosis and treatment of gastric cancer

6 小結與展望

以血液外泌體circRNA為指標的液體活檢有助于胃癌的診斷、耐藥監(jiān)測、治療評價以及預測預后[52]；利用液體活檢技術監(jiān)測相關circRNA可以比影像學更早地預測胃癌復發(fā)，具有巨大的潛在臨床價值[53]。

但其臨床常規(guī)化仍面臨著很多困難與挑戰(zhàn)。首先，circRNA種類繁多，胃癌相關的circRNA在人類體液中的表達水平不盡相同，可能在其他癌癥中也有表達，作為液體活檢的生物標志物需要更龐大、更精細化的研究；其次，檢測流程有待規(guī)范化，包括體液樣本的取材、運送、存儲以及檢測方法；最后，還需要大數(shù)據(jù)和多中心的臨床前瞻性研究來驗證。相信在不久的將來，circRNA液體活檢將會在胃癌的精準醫(yī)療中發(fā)揮重要作用。