俞 弋，叢 青，徐叢劍，姜 偉

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中死亡率最高的一種惡性腫瘤。起病隱匿，缺乏早期有效的診斷方法，病理學(xué)類(lèi)型復(fù)雜，預(yù)后較差［1］。目前卵巢癌的治療方式仍是手術(shù)及術(shù)后輔助鉑類(lèi)藥物為主的化療，但易出現(xiàn)化療耐藥及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)［2］。炎癥微環(huán)境對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性生物活性最強(qiáng)的一種磷脂類(lèi)炎性因子，與PAF受體（PAF receptor，PAFR）結(jié)合后參與體內(nèi)多種生理病理學(xué)過(guò)程［3-5］。

本課題組的前期研究［6］發(fā)現(xiàn)，PAFR在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，PAF能明顯刺激PAFR陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞系增殖及侵襲。此外，在構(gòu)建的裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型中給予順鉑（cisplatin，CDDP）和（或）銀杏內(nèi)酯B（PAFR特異性拮抗劑），結(jié)果顯示，銀杏內(nèi)酯B具有體內(nèi)抑制卵巢癌的作用，并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)于CDDP的敏感性［7］。但相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，探索CDDP作用后的卵巢癌細(xì)胞中PAFR的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞CDDP敏感性的影響，并探討相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

漿液性卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3和乳突狀卵巢腺癌細(xì)胞系CAOV-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，CDDP、PAF和WEB2086（PAFR抑制劑）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，兔抗人PAFR抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗人phospho/total-ERK/AKT/P70S6K抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

收集各組細(xì)胞蛋白，通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離細(xì)胞裂解物并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。溫育一抗，4 ℃過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)的二抗溫育1 h，再次洗膜后加入熒光發(fā)光液檢測(cè)。各組實(shí)驗(yàn)中涉及同一種蛋白的磷酸化及非磷酸化狀態(tài)及內(nèi)參蛋白是采用膜再生液洗膜的方法。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

使用TRIzol試劑從不同實(shí)驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞系中提取總RNA。將提取的RNA在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)，讀取260 nm波長(zhǎng)處的吸光度（D）值及D260nm/D280nm比值，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR程序：94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的表達(dá)量并進(jìn)行比較分析。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)PAFR抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞系CDDP敏感性的影響。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL接種到96孔板中。不同實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞在37 ℃下溫育72 h后，向每孔中加入MTT溶液（5 mg/mL），并將96孔板在37 ℃下再溫育4 h。使用多孔掃描分光光度計(jì)測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的D值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將卵巢癌細(xì)胞系以4×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，加入3 μg/mL DDP。依據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光定位

將圓形細(xì)胞爬片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入5 000個(gè)卵巢癌細(xì)胞系并分為CDDP組和空白組，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以免疫熒光封閉液在常溫下封閉1 h，一抗4 ℃溫育過(guò)夜。復(fù)溫，二抗避光常溫溫育1 h；在載玻片上加1滴防淬滅封片劑，將上述圓形細(xì)胞爬片細(xì)胞面貼附于載玻片之上，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞對(duì)PAFR表達(dá)的影響

用不同濃度的CDDP作用于卵巢癌SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞24 h，RTFQ-PCR及Western blot結(jié)果顯示，隨著CDDP處理濃度的增加，SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞中PAFR的mRNA表達(dá)及蛋白水平升高并呈劑量依賴性（P＜0.01）。處理細(xì)胞的CDDP為最低劑量（2.5 μmol/L）時(shí)，PAFR RNA水平增加1.2倍；處理細(xì)胞的CDDP為最高劑量（60 μmol/L）時(shí)，PAFR RNA水平增加3.2倍。隨著CDDP處理劑量的增加，SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞中PAFR蛋白表達(dá)水平分別升高3.4和4.0倍。此外，用相同濃度（10 μmol/L）的CDDP處理細(xì)胞不同時(shí)間，RTFQ-PCR及Western blot結(jié)果顯示，1 h后PAFR的RNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組升高，并在處理24 h后表達(dá)量達(dá)到高峰（P＜0.01，圖1）。上述結(jié)果說(shuō)明，CDDP能夠引起卵巢癌細(xì)胞中PAFR的表達(dá)升高，并且這種升高呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性。

圖1 CDDP能夠引起卵巢癌SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞中PAFR表達(dá)升高Fig.1 CDDP induces increased PAFR expression in human ovarian cancer SKOV-3 and CAOV-3 cells

2.2 核因子κB（nuclear factor Kappa-B，NFκB）/p65及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在CDDP引起卵巢癌細(xì)胞PAFR表達(dá)升高中的作用

有文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道，CDDP能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB/p65、HIF-1α等）的活性，而在一些腫瘤細(xì)胞中PAFR所發(fā)揮的作用也與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α相關(guān)［10-11］。因此，為研究轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α是否參與卵巢癌細(xì)胞中CDDP調(diào)節(jié)PAFR表達(dá)的過(guò)程，首先觀察CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞后NF-κB/p65及HIF-1α的表達(dá)。用10 μmol/L CDDP處理細(xì)胞不同時(shí)間后，Western blot結(jié)果顯示，在細(xì)胞核蛋白中，隨著CDDP處理時(shí)間的延長(zhǎng)，NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平逐漸升高。在各組細(xì)胞總蛋白中，NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平并無(wú)明顯改變（圖2A、2B）。免疫熒光定位結(jié)果顯示，CDDP組細(xì)胞中NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的核聚集（圖2C）。上述結(jié)果說(shuō)明，CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后能夠增加細(xì)胞核中NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達(dá)。

圖2 CDDP可引起卵巢癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α的核聚集Fig.2 CDDP treatment enhances the nuclear localization of NF-κB/p65 and HIF-1α

此外，本研究采用小RNA干擾技術(shù)沉默NF-κB/p65及HIF-1α后給予10 μmol/L CDDP處理細(xì)胞株24 h。Western blot及RTFQ-PCR結(jié)果顯示，沉默NF-κB/p65及HIF-1α后，CDDP作用的卵巢癌細(xì)胞系中PAFR的RNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低。與HIF-1α-siRNA相比，沉默NF-κB能夠更加有效地抑制CDDP誘導(dǎo)的PAFR表達(dá)（圖3A～3D）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CDDP組細(xì)胞相比，CDDP與NF-κB-siRNA或HIF-1αsiRNA聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3E、3F）。上述結(jié)果說(shuō)明，在卵巢癌細(xì)胞中，CDDP通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α增加PAFR的表達(dá)。

圖3 CDDP通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α增加卵巢癌細(xì)胞株中PAFR的表達(dá)Fig.3 NF-κB/p65 and HIF-1α are involved in CDDP-induced PAFR expression in ovarian cancer cells

2.3 抑制PAFR對(duì)卵巢癌細(xì)胞CDDP敏感性的影響

為探索CDDP 作用于卵巢癌細(xì)胞時(shí)上調(diào)PAFR的作用，用100 μmol/L PAFR特異性小分子拮抗劑WEB2086預(yù)處理SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞1 h后再給予10 μmol/L CDDP作用24 h。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WEB2086+CDDP組細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.01）；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PAF后卵巢癌細(xì)胞系活性增強(qiáng)，而PAF+CDDP+WEB2086組細(xì)胞增殖能力與PAF+CDDP組相比亦明顯降低（P＜0.01，圖4A）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CDDP組相比，WEB2086+CDDP組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01，圖4B）。此外，通過(guò)小RNA干擾技術(shù)沉默PAFR。Western blot結(jié)果顯示，si-PAFR能夠有效地抑制卵巢癌細(xì)胞中PAFR蛋白的表達(dá)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，CDDP+PAFR-siRNA組細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。這一結(jié)果亦在Western blot中進(jìn)行驗(yàn)證，CDDP+si-PAFR組細(xì)胞中的cleaved-PARP/caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高。Cleaved-PARP/caspase-3作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白［12］，cleaved-PARP、cleavedcaspase-3表達(dá)越高，細(xì)胞凋亡率越高（圖4C）。上述結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論是通過(guò)特異性小分子拮抗劑或RNA干擾抑制PAFR表達(dá)均能夠顯著地提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)于CDDP的敏感性。

圖4 抑制PAFR表達(dá)能夠提高卵巢癌細(xì)胞株對(duì)CDDP敏感性Fig.4 PAFR suppression enhances the CDDP sensitivity of ovarian cancer cells

2.4 CDDP作用卵巢癌細(xì)胞后PAFR下游信號(hào)通路的激活

mTOR-PI3K-AKT及MAPK通路是細(xì)胞增殖及凋亡的兩個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［13］。多項(xiàng)研究［14-16］證實(shí)，在多種癌細(xì)胞中PAF/PAFR信號(hào)軸可以激活相關(guān)信號(hào)通路分子。本研究驗(yàn)證了AKT及ERK是否位于受CDDP作用而激活的PAFR下游信號(hào)通路中。用相同濃度（10 μmol/L）的CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞不同時(shí)間，Western blot結(jié)果顯示，在SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞中，隨著CDDP處理時(shí)間的延長(zhǎng)，phospho-P70S6K/AKT/ERK蛋白表達(dá)水平均有所升高。將PAF加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，p-P70S6K、p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均有明顯升高（圖5A、5C）。為驗(yàn)證AKT及ERK信號(hào)蛋白的激活是否為PAFR依賴性，實(shí)驗(yàn)用不同濃度的PAFR特異性拮抗劑WEB2086預(yù)處理SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞1 h后再給予10 μmol/L CDDP和（或）100 nmol/L PAF處理，Western blot結(jié)果顯示，隨著PAFR特異性拮抗劑WEB2086濃度的升高，p-P70S6K、p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)水平逐漸降低（圖5B、5D）。上述結(jié)果說(shuō)明，CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后，受激活的PAF/PAFR能夠激活下游的AKT及ERK信號(hào)通路分子。

圖5 CDDP通過(guò)PAFR激活下游的AKT及ERK信號(hào)通路分子Fig.5 AKT and ERK signaling pathways lies downstream of activated PAFR in CDDP-treated ovarian cancer cells

3 討論

化療是中晚期卵巢癌治療的主要方法。然而，化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者復(fù)發(fā)死亡的主要原因之一?；熕幬镆环矫嫱ㄟ^(guò)各種機(jī)制試圖殺死癌細(xì)胞，而另一方面，化療藥物又激活了癌細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，從而對(duì)抗藥物的作用。因此，腫瘤化療的開(kāi)始也意味著化療耐藥的發(fā)生［17］。闡明化療藥物所激發(fā)的細(xì)胞自我防御機(jī)制，探索有效的靶蛋白是克服化療耐藥的有效途徑。

CDDP是卵巢癌化療的一線藥物。鉑類(lèi)化合物的作用機(jī)制主要是引起DNA鏈交聯(lián)，破壞DNA分子結(jié)構(gòu)，從而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡［18］。本課題組在既往研究［6］中選擇攜帶熒光報(bào)告基因的SKOV-3-luciferase細(xì)胞構(gòu)建裸鼠的腹腔卵巢癌種植模型進(jìn)行體內(nèi)研究，采用腹腔注射的方式給予CDDP和（或）銀杏內(nèi)酯B，使用小動(dòng)物活體成像的方法動(dòng)態(tài)觀察上述藥物對(duì)裸鼠腹腔種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果證實(shí)，銀杏內(nèi)酯B具有體內(nèi)抑制卵巢癌生長(zhǎng)的作用。已有文獻(xiàn)［19］報(bào)道，銀杏內(nèi)酯B能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及NF-κB活性而減輕脂多糖引起的急性肺損傷。NF-κB通常在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)與阻斷NF-κB核轉(zhuǎn)位的抑制蛋白IκB-α/β結(jié)合而處于失活狀態(tài)。在多種腫瘤細(xì)胞中，NF-κB被激活并參與多種損傷及炎癥反應(yīng)［20］。多項(xiàng)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)［21-23］均證實(shí)，NF-κB及HIF-1α等分子途徑與CDDP耐藥相關(guān)，盡管其具體機(jī)制尚不明確。根據(jù)本課題組既往研究［6］結(jié)果，銀杏內(nèi)酯B具有體內(nèi)抑制卵巢癌生長(zhǎng)的作用，并可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性，提示NF-κB及HIF-1α可能參與CDDP在卵巢癌細(xì)胞中的作用過(guò)程并與PAFR的調(diào)節(jié)有關(guān)。

本研究進(jìn)一步證明此結(jié)論并探索相關(guān)機(jī)制。當(dāng)CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3卵巢癌細(xì)胞系后，細(xì)胞核蛋白中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α的表達(dá)量升高，進(jìn)而PAFR的RNA和蛋白表達(dá)水平升高。當(dāng)抑制PAFR表達(dá)時(shí)，卵巢癌細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性明顯增強(qiáng)，即抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并將癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，說(shuō)明當(dāng)CDDP應(yīng)用于卵巢癌細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效果的同時(shí)，也激起了細(xì)胞內(nèi)的自我防御機(jī)制。CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后，PAFR的表達(dá)升高有可能是卵巢癌細(xì)胞化療藥物耐受的一種分子機(jī)制。

本課題組既往研究［6］結(jié)果已證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞中，PAFR與EGFR通過(guò)一系列的細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳輸信號(hào)，并共同激活下游的信號(hào)通路分子，如P70S6K、4EBP1、AKT及ERK蛋白等，發(fā)揮協(xié)同作用共同促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展［24］。P70S6K、4EBP1及AKT是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的蛋白分子，ERK是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的蛋白分子。而PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均是細(xì)胞代謝和抗凋亡的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，不僅與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，并且與多種一線化療藥物關(guān)系密切［25］。

本研究發(fā)現(xiàn)，用CDDP處理卵巢癌細(xì)胞后，PAFR表達(dá)上調(diào)，從而對(duì)抗CDDP的抗腫瘤效應(yīng)。繼而進(jìn)一步探索CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后，上調(diào)的PAFR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)用同一濃度的CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3細(xì)胞不同時(shí)間時(shí)，P70S6K/AKT/ERK蛋白均被激活，即phospho-P70S6K/AKT/ERK表達(dá)水平升高。而當(dāng)向CDDP處理的卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加PAF時(shí)，phospho-P70S6K/AKT/ERK蛋白的表達(dá)水平均較無(wú)PAF添加的細(xì)胞組有所上升，提示CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后，PAFR的表達(dá)上升，從而與PAF相結(jié)合，進(jìn)一步激活下游的信號(hào)通路分子，進(jìn)而在卵巢癌細(xì)胞CDDP耐藥中發(fā)揮作用。

綜上所述，當(dāng)CDDP 作用于卵巢癌細(xì)胞后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及HIF-1α能夠上調(diào)PAFR的表達(dá)，抑制PAFR后可以增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性。此外，當(dāng)CDDP作用于卵巢癌細(xì)胞后，上調(diào)的PAFR與細(xì)胞內(nèi)的特異性配體PAF作用可以進(jìn)一步促進(jìn)下游信號(hào)通路分子P70S6K、AKT、ERK的激活從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此，PAFR可能成為卵巢癌靶向治療的新靶點(diǎn)，這有望為聯(lián)合輔助治療提供一個(gè)新方向。