高通量測(cè)序技術(shù)在肺部感染性疾病中的應(yīng)用

肖宇 綜述 肖衛(wèi) 審校

長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 荊州 434000

肺部感染是臨床上的常見(jiàn)疾病，多發(fā)病，普遍見(jiàn)于各科室，且位于各類(lèi)感染的首位，急性呼吸道感染造成的死亡人數(shù)為總疾病造成死亡數(shù)的第3 位，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。病因中，大部分為病原體感染，也可因理化、免疫及藥物等因素引起。

細(xì)菌和真菌培養(yǎng)的是鑒定致病微生物的金標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，通常需要2～3 d才能獲得結(jié)果，而且這種方法不適用于鑒定病毒。鑒定病毒通常使用聚合酶鏈反應(yīng)或抗原檢測(cè)，但只能檢測(cè)有懷疑方向的病毒。此外，病毒分離也是確定致病病原體的可靠方法，但是耗時(shí)，并且其敏感性可能不夠。雖然進(jìn)行了這些檢測(cè)方法，但仍有13%～62%的成人肺炎患者中未發(fā)現(xiàn)明顯的病原體[1-2]。

高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput sequencing)一次可以對(duì)數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)的DNA 或RNA 分子進(jìn)行測(cè)序，該技術(shù)使得檢測(cè)速度極大加快。同時(shí)相比于第一、二代測(cè)序技術(shù)，核酸測(cè)序的單堿基成本大幅下降，因此又被稱(chēng)為“下一代”測(cè)序技術(shù)(“next-generation”sequencing technology，NGS)。不同于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，其通過(guò)直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行檢測(cè)，然后再與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，最后依據(jù)比對(duì)到的序列信息可判斷樣本包含的病原體種類(lèi)。通過(guò)該技術(shù)，可快速、客觀地檢測(cè)送檢標(biāo)本中所包含的病原微生物(細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等)，而且無(wú)需費(fèi)時(shí)的進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)于急危重癥和疑難感染的診斷尤其適用[3]。

自2014 年NGS 首次被報(bào)道應(yīng)用于聯(lián)合免疫缺陷綜合征合并感染的一位患者，并在尋找病原體中起到關(guān)鍵性作用[4]，到2016年美國(guó)FDA正式的認(rèn)可NGS技術(shù)。近年來(lái)已越來(lái)越多的應(yīng)用于肺部感染性疾病病原菌的診斷[5]，并對(duì)細(xì)菌在疾病發(fā)展中作用的理解得到了更近一步加強(qiáng)。

1 在肺部微生物群落檢測(cè)中的應(yīng)用

在過(guò)去的幾十年中，人們一直認(rèn)為隆凸以下的肺部是無(wú)菌的，但近年來(lái)NGS 的不斷應(yīng)用，已證實(shí)肺部并不是無(wú)菌的，有大量厭氧菌和好氧菌定植。HILTY等[6]使用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)下呼吸道中存在的重要微生物群進(jìn)行了報(bào)告，比較了哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)受試者和健康對(duì)照組中三種不同人類(lèi)棲息地的微生物群。他們比較了通過(guò)表面拭子取樣的鼻腔和口咽微生物群，以及通過(guò)支氣管刷取左肺上葉黏膜表面取樣的下呼吸道微生物群。在8名對(duì)照受試者的氣道刷檢中，鑒定出了幾個(gè)不同的細(xì)菌門(mén)。此外，在健康對(duì)照組、哮喘組和慢性阻塞性肺疾病組的受試者中，微生物群落的豐度相似，但細(xì)菌群落組成有顯著差異。

對(duì)正常成人肺部標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定提示，肺部的常見(jiàn)細(xì)菌種群為變形桿菌、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，而在屬的水平上，鏈球菌、普雷沃氏菌和韋氏菌占優(yōu)勢(shì)，嗜血桿菌和奈瑟氏菌較小[7-8]。然而，與上呼吸道的菌群數(shù)量相比，它相對(duì)稀疏。據(jù)報(bào)道，支氣管的群落組成與上呼吸道相似，但生物量較少。該結(jié)果表明肺微生物組的來(lái)源可能是從上呼吸道吸入的[9]。

而且肺部支氣管黏膜上的細(xì)菌定植并也不是單一的菌群，不同的呼吸系統(tǒng)疾病狀態(tài)下的呼吸道菌群組成也并不相同，肺部感染并不是病原微生物對(duì)無(wú)菌空間的侵襲，而是微生物豐度的發(fā)生了變化。對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)檢測(cè)，如果在呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有口咽部常見(jiàn)細(xì)菌，那么將不能除外為口咽部污染所致。而對(duì)于NGS檢測(cè)可通過(guò)其相對(duì)豐度的變化進(jìn)行進(jìn)一步的判別。

通過(guò)對(duì)確診為支氣管擴(kuò)張患者的測(cè)序分析顯示，該類(lèi)患者的肺部細(xì)菌群落主要為假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和鏈球菌屬，且假單胞菌和嗜血桿菌占優(yōu)勢(shì)的微生物群已被證明與嚴(yán)重疾病和頻繁惡化有關(guān)[10]。該結(jié)果支持了培養(yǎng)報(bào)告中的發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)微生物，但同時(shí)表現(xiàn)出個(gè)體內(nèi)穩(wěn)定性和較大的個(gè)體間變異性。

在穩(wěn)定的慢性阻塞性肺病中，其中微生物密度從上呼吸道到下呼吸道呈梯度下降，其中來(lái)自上氣道的吸入被認(rèn)為是主要來(lái)源[11]。GALIANA等[12]發(fā)現(xiàn)，與輕度或中度氣流阻塞的患者相比，嚴(yán)重氣流阻塞的患者在痰樣本中表現(xiàn)出較低的菌群多樣性和較高的細(xì)菌載量。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在痰和支氣管肺泡灌洗取樣中重現(xiàn)[13]。這些研究還報(bào)道了肺功能下降的微生物菌群向潛在致病細(xì)菌屬的轉(zhuǎn)變，特別是屬于如假單胞菌屬或嗜血桿菌屬的細(xì)菌。

迄今為止，通過(guò)NGS 檢測(cè)，人們已認(rèn)識(shí)到健康人群肺部并非無(wú)菌，且證明了健康人群和肺疾病人群之間肺部微生物群落的差異，并也了解到了肺內(nèi)微生物菌群失調(diào)與肺部疾病之間的關(guān)聯(lián)。

2 在重癥感染患者的應(yīng)用

NGS 有能無(wú)偏性的病原體覆蓋檢測(cè)，靈敏度高；并且可以明確病原體的種類(lèi)和分型，還可提供耐藥基因和毒力因子的分析。在臨床實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)患者的抗菌藥物選擇和治療效果評(píng)價(jià)具有一定的指導(dǎo)意義，是明確感染性疾病病原菌的有效手段[14]，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。有研究表明對(duì)重癥感染病人的血標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行比較，整體診斷敏感性由單純細(xì)菌培養(yǎng)的12.82%顯著提高至單純 NGS 的 30.77%[15]。XIE 等[16]對(duì)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上?？傖t(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科的178例重癥肺炎患者進(jìn)行回顧性分析提示，在重癥肺部感染患者中應(yīng)用NGS 能夠早期明確致病菌，并指導(dǎo)抗菌藥物選擇和治療，最終降低死亡率。相較于常規(guī)微生物學(xué)檢測(cè)，NGS在檢測(cè)致病菌方面顯示出顯著更高的陽(yáng)性率(68.7%vs 45.4%)。

2018年的一項(xiàng)回顧性研究也表明，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)，NGS具有更高的敏感性。同時(shí)在對(duì)結(jié)核、真菌、病毒和厭氧菌感染的診斷方面有更大的優(yōu)勢(shì)[17]。而且在抗菌藥物使用的影響方面NGS也小于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并且可以依據(jù)檢測(cè)報(bào)告來(lái)進(jìn)行抗菌藥物治療方案的調(diào)整。

3 在特殊類(lèi)型感染患者中的應(yīng)用

對(duì)于免疫缺陷患者、傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果陰性且治療效果不佳的感染患者和反復(fù)多次住院治療的患者，其感染灶的致病微生物復(fù)雜，通常不同于正常人群的致病菌。其致病菌可能為機(jī)會(huì)性致病菌或攜帶多重抗生素耐藥基因的病原體[18]。對(duì)比于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，NGS是更好的輔助檢測(cè)手段[19-20]。

PAN等[21]在一項(xiàng)對(duì)免疫功能低下合并社區(qū)獲得性肺部感染的研究中顯示，在病毒和真菌方面的檢測(cè)上NGS有著明顯優(yōu)勢(shì)，而且對(duì)于混合感染方面也優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)手段。2019年有報(bào)道在1例血功能衰竭反復(fù)因肺部感染住院治療患者中利用NGS檢測(cè)肺泡灌洗液，證實(shí)為肺孢子蟲(chóng)感染[22]。GU 等[23]報(bào)道了5 例抗感染治療效果不佳，經(jīng)過(guò)對(duì)支氣管肺泡灌洗液和肺組織進(jìn)行NGS 檢測(cè)，最終確診為鸚鵡熱衣原體，并針對(duì)性調(diào)整抗菌藥物治療后病情好轉(zhuǎn)。LANGELIER 等[24]對(duì)由于呼吸道感染入院的骨髓移植患者，運(yùn)用NGS檢測(cè)患者的肺泡灌洗液樣本，結(jié)果證實(shí)呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及扭矩特諾病毒等多種病毒，以及存在少見(jiàn)的致病性細(xì)菌如輕型鏈球菌及棒狀桿菌。有研究表示，在免疫缺陷合并感染患者的致病菌診斷方面，NGS檢測(cè)有著重要的作用[25]。并且對(duì)于該類(lèi)患者NGS在細(xì)菌和病毒感染的診斷方面，陽(yáng)性率是傳統(tǒng)檢測(cè)方法的3 倍以上。

對(duì)于結(jié)核感染，華山醫(yī)院的周晛等[26]排除活動(dòng)性結(jié)核感染患者，NGS 均未檢出結(jié)核序列，特異度為100%。但對(duì)9 例確診活動(dòng)性結(jié)核患者和10 例臨床診斷為活動(dòng)性結(jié)核病患者進(jìn)行NGS 檢測(cè)，敏感度為57.9%。對(duì)同一患者的標(biāo)本同時(shí)送檢Xpert MTB/RIF與NGS，提示NGS 和Xpert MTB/RIF 兩者的敏感度、特異度并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 結(jié)果判讀

常見(jiàn)的結(jié)果指標(biāo)有檢出序列數(shù)、深度、離散度、基因組覆蓋度和微生物豐度。在結(jié)果中某病原體的檢出序列數(shù)、深度、離散度和基因組覆蓋度越高，表示檢測(cè)到該微生物的可靠性越高[3]。SIMNER等[27]認(rèn)為，對(duì)于檢測(cè)細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)的陽(yáng)性判斷，為每百萬(wàn)映射讀取的序列數(shù)≥陰性對(duì)照的10 倍；病毒的序列數(shù)≥20，同時(shí)要求覆蓋度＞2%。

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)[17]定義的判斷標(biāo)準(zhǔn)為，細(xì)菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲(chóng)其覆蓋率比任何其他微生物高10倍；真菌覆蓋率比任何其他微生物組高5倍。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌如檢測(cè)出唯一比對(duì)序列即作為陽(yáng)性判斷，但非結(jié)核分枝桿菌需排在所有微生物的前10名。

目前對(duì)NGS的報(bào)告解讀未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[14]，需結(jié)合臨床特征綜合判斷。更精確有效的判斷方法需要更深一步的研究證實(shí)。

5 結(jié)語(yǔ)

NGS 相對(duì)于病原學(xué)檢測(cè)方法(如微生物培養(yǎng)技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、血清學(xué)病原菌抗體檢測(cè)技術(shù)及特定病原菌的多重PCR 技術(shù)等)，有檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)種類(lèi)多，無(wú)須培養(yǎng)、不受抗生素影響的優(yōu)點(diǎn)，并能同時(shí)明確樣本中的細(xì)菌、真菌、病毒及原蟲(chóng)，并且能夠精確到種水平，還能夠明確微生物的抗生素耐藥等功能；且了解肺部菌群和呼吸道疾病的關(guān)聯(lián)有一定意義。

對(duì)于胞內(nèi)感染菌檢測(cè)，如軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌等，因其在胞外的含量較低，故而檢測(cè)的敏感性偏低[26]。但隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化，NGS 對(duì)胞內(nèi)感染菌診斷的敏感性會(huì)逐漸增高。而且其結(jié)果判讀目前并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需要臨床醫(yī)生結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、采集樣本類(lèi)型、微生物背景、傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)報(bào)告和輔助檢查等判斷是定植菌、背景菌還是致病菌。

總之，經(jīng)過(guò)近些年來(lái)NGS 的不斷應(yīng)用，醫(yī)學(xué)界進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)了肺部的微環(huán)境，同時(shí)對(duì)肺部菌群和肺部疾病的關(guān)系有了新的見(jiàn)解。同時(shí)NGS 技術(shù)這一種新的檢測(cè)手段，補(bǔ)充了臨床上對(duì)不明原因感染、危重癥及免疫低下患者的病原學(xué)檢測(cè)方案，提高病原體的檢出率，對(duì)幫助臨床醫(yī)生精準(zhǔn)診療、減少?gòu)V譜抗生素的經(jīng)驗(yàn)性使用、降低重癥患者死亡率有一定意義。