岳趣，商賀陽，張聘，陳保善，黃有總

摘? 要：甘蔗的葉片是制糖過程中雜質的主要來源，育種過程中傾向于選育易脫葉的品種。為了研究甘蔗脫葉性相關的主效、穩(wěn)定基因，本研究采用BSR-Seq技術，從‘ROC25ב云蔗89-7的F1后代中選取極端難脫葉品系和極端易脫葉品系的+6葉位葉鞘離區(qū)，分別構建混池，并和親本一起進行RNA轉錄組測序分析，共得到60.46 Gb的有效片段，4個樣品的Q30值均在93%以上，GC含量都大于51%，與參考基因組R570比對，比對率都超過41%。4個樣品共檢測出4085個差異基因，候選區(qū)域定位于9號染色體上的4個位置，總長1.40 Mb，注釋到基因86個，親本間注釋到的非同義突變15個，挖掘出2個主效差異基因（Sh09_g020620，Sh09_g020080），Sh09_g020080在親本的表達差異和子代中是同向的，而Sh09_g020620在2個親本和2個子代混池之間的差異是異向的，表明可能僅Sh09_g020080對易脫葉性有所貢獻。選取BSR亞群體中極端易脫葉品系40-159和極端難脫葉品系5-94的+1～+7葉進行熒光定量分析，發(fā)現Sh09_g020080基因在單一品系的表達和子代混池的+6葉的表達是同向的。取另一個‘B35-9בCP08-1553的雜交后代個體中的極端易脫葉品系16-226和極端難脫葉品系16-224的+1～+7葉位的葉鞘離區(qū)進行熒光定量分析，結果顯示Sh09_g020080在2個群體中+4、+5、+6葉位的表達都為易脫葉的品系高于難脫葉品系。注釋顯示Sh09_g020080具有σ因子活性，參與紅光、遠紅光、藍光反應。根據理化性質和蛋白質結構，推測Sh09_g020080編碼蛋白具有4個保守區(qū)域，且具有積累葉綠素的作用。該研究為甘蔗脫葉相關主效候選基因的挖掘提出了新的見解。

關鍵詞：甘蔗;BSR-seq;脫葉;生物信息學分析

中圖分類號：S566.1? ? ? 文獻標識碼：A

Bioinformatic Analysis and Identification of Genes Contributing to Sugarcane Defoliation via BSR-Seq

YUE Qu1， SHANG Heyang1， ZHANG Pin2， CHEN Baoshan1，3*， HUANG Youzong1，3*

1. College of Agriculture， Guangxi University / State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Aro-biores?ou-rces， Nanning， Guangxi 530005， China; 2. College of Agronomy， Hebei Agricultural University， Baoding， Hebei 071001， China; 3. Agri-a?n?imal Industrial Development Institute， Guangxi University / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology， Nanning， Guangxi 530005， China

Abstract： Sugarcane （Saccharam spp.）， a C4 tropical grass mainly for sugar production， is commercially cultivated in over 100 countries. One of the main barriers to mechanical or manual harvesting of whole sugarcane stalk is the high percentage of impurities， mainly the debris of leaves and sheathes that results in increase of harvest time and cost. The most efficient solution for this issue is to develop sugarcane cultivars that are easy to defoliate in sugarcane breeding program. In order to investigate the genes responsible to sugarcane defoliation， BSR-Seq technology was employed in the current study to analyze pools of the leaves at +6 position of extremely hard-to-defoliate and easy-to-defoliate sugarcane plants derived from the cross of ‘ROC25 × ‘Yunzhe 89-7， together with the two parental lines with contrast defoliation phenotypes. A total of 60 Gb of clean reads were obtained and the Q30 values of the four samples were greater than 93% with GC content of 51%. Using R570 genome as reference， the alignment rate was greater than 41%. A total of 4085 differential expressed genes were detected in the 4 samples. The candidate regions were found to locate at 4 loci on chromosome 9， covering a total length of 1.40 Mb in which 86 genes were annotated. There were 15 non-synonymous mutations annotated between the parental lines， and two significant differentially expressed genes （Sh09_g020620， Sh09_g020080） were identified. The expression level of Sh09 g020080 in the easy-to-defoliate genotype was higher than that of the hard-to-defoliate genotype and consistent with the parents but that of Sh09_g020620 was opposite between the offspring pools and the parental lines， suggesting that only Sh09 g020080 may contributing to the phenotype of easy defoliation. Quantitation of Sh09 g020080 gene expression in leaves from position +1 to +7 from the extremely easy-to-defoliate representative accession 40-159 and the extremely hard-to-defoliate accession 5-94 confirmed the BSR-seq results of the two pools. In analysis of another genetic population derived from the cross of ‘B35-9 × ‘CP08-1553， Sh09 g020080 was also found to express in a higher level in the extremely easy-to-defoliate accession 16-226 than in the extremely hard-to-defoliate accession 16-224 in +4 to +6 leaves. Analysis of the deduced Sh09_g020080 protein revealed that this protein has four domains conserved in σ factor-like proteins that may function in in red， far red and blue light reactions and accumulation of chlorophyll. Overall， this study shed a new light into the endeavor of exploring essential genes for defoliation in sugarcane.

Keywords： sugarcane; BSR-Seq; defoliation;

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.013

甘蔗主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]，在我國主要分布于廣西、云南、廣東、海南等省（區(qū)），是我國主要的糖料作物。脫葉是甘蔗本身所具有的不同于一般落葉現象的性狀，難脫葉的甘蔗在制糖過程中會含有大量雜質，對蔗糖的加工造成極大的干擾，影響制糖[2-3]，我國糖廠規(guī)定甘蔗人工收獲的含雜率不能超過1%，而對于機械收獲則通?？垭s較高，可見，難脫葉的甘蔗極大影響甘蔗機械收獲的質量和人工收獲的效率。國外有在成熟期焚燒甘蔗老葉以助脫葉的處理方法，但會產生有毒氣體，污染環(huán)境[4]，同時會影響土壤微生物的活動，對土壤肥力產生不良影響[5-6];另一方面，甘蔗在成熟期葉片的脫落不但不影響產量，適當剝葉還可以提高產量和品質[7]。因此，在甘蔗新品種選育過程中把成熟葉片易脫落的性狀作為選育的重要指標具有重要的生產意義。

甘蔗脫葉性狀是數量性狀，受多基因控制，植物脫落發(fā)生于離區(qū)[8]，對于甘蔗而言，就是葉鞘和莖稈連接的部位。一般認為脫落的過程分成4個階段：（1）離區(qū)的形成;（2）感受到脫落信號;（3）脫落信號的傳導;（4）脫落后組織愈合。這4個過程都需要特定基因的表達，其中第2、3階段在其他植物的葉、花、果等部位的脫落上有不少的研究[9-10]。集群分離分析（bulk segregant analysis， BSA）是QTL技術的一個分支，可以快速地對數量性狀的主效基因進行定位，轉錄組學是研究基因的轉錄水平以及調控機制規(guī)律的技術，Bulked segrant RNA-Seq（BSR-Seq）將BSA技術和轉錄組學結合在一起，已經應用于小麥抗條銹病基因[11]，玉米黃花突變基因的定位[12]，大白菜黃化突變基因Brpem2的定位[13]，獼猴桃抗寒機制的研究[14]，小麥抗白粉病基因PmSESY的定位[15]等。

Li等[16]利用RNA-Seq技術發(fā)現了甘蔗脫葉相關基因在植物-病原菌相互作用、應激反應及與脫落酸相關通路中富集，關于甘蔗脫葉方面的研究報道還很少。有報道將甘蔗的脫葉性狀分為三級，研究了不同組合選配方式的脫葉遺傳情況，發(fā)現三級脫葉更易遺傳給后代，其次是一級脫葉，最后是二級脫葉，也就是說中間類型的脫葉性狀不容易穩(wěn)定遺傳[17]。本研究基于BSR-Seq技術對甘蔗脫葉相關的主效、穩(wěn)定遺傳的候選基因進行了篩選，并利用熒光定量分析對極端材料的+ 1～+7葉葉鞘離區(qū)部位進行了不同群體的分析，驗證基因是否在不同群體中都具有穩(wěn)定遺傳的效應。通過對穩(wěn)定遺傳基因的生物信息學分析了解該基因的特點，為甘蔗脫葉的分子研究提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

甘蔗親本（‘ROC25ב云蔗89-7）及其雜交后代F1（17 000多個品系）種植于廣西大學扶綏基地，‘ROC25表現出相對難脫葉的特點，‘云蔗89-7則表現出相對易脫葉的特點，從F1中挑選極端難脫葉個體（葉鞘與莖稈包裹緊密，只有基部3～4片葉脫落，其他成熟葉鞘難以從莖稈上剝離）113個，易脫葉個體（+7～+10葉位以下全部脫落）116個，取其+6葉葉鞘離區(qū)暫時保存于液氮，帶回實驗室-80 ℃保存，同時將取樣品系擴繁，觀察1 a，最后篩選出難脫葉品系43個，易脫葉品系48個，選取其中的極端難脫葉品系5-94和極端易脫葉品系40-159的+1～+7葉位的葉鞘保存。取另一雜交群體（‘35-9בCP08-1553）的雜交后代個體中的極端難脫葉品系16-224和極端易脫葉品系16-226的+1～+7葉位的葉鞘用于驗證。

主要試劑：RNA-easyTM Isolation Reagent Vazyme Cat（南京諾維贊生物科技股份有限公司），反轉錄試劑盒TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金生物技術有限公司），熒光定量試劑盒ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾維贊生物科技股份有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? BSR-Seq建池? RNA提取采用TriZol法，提取后的RNA用Thermo的微量核酸純度濃度測定儀檢測濃度和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，各項指標合格后，將易脫葉的43個樣品等量混合構建混池T03，難脫葉的48個樣品等量混合構建混池T04，母本‘ROC25單個樣品存在記為T01，父本‘云蔗89-7單獨存在記做T02，最后送北京百邁客生物科技有限公司進行上機分析。

1.2.2? 文庫構建、組裝和質控? 利用DNA酶去除RNA樣品中的DNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，再將其打斷成小片段，以小片段為模板合成單鏈cDNA，將單鏈擴增為雙鏈，然后對合成的雙鏈進行純化和修復，對其加A尾，并在兩端連接測序接頭序列，經過片段大小選擇和PCR擴增程序后構建文庫[18-19]。用Illunima HiSeq測序平臺對原始數據進行分析，去掉接頭，過濾低質量的reads，剔除核糖體RNA[20]。

1.2.3? 與參考基因組比對和候選區(qū)域定位? 以甘蔗栽培品種‘R570基因組為參考，利用STAR將過濾后的片段比對到‘R570基因組上，將樣品基因組組裝到染色體水平。使用GATK[20]軟件工具包對樣品與參考基因組間及樣品之間的單核苷酸多態(tài)性（SNP）進行檢測，只有比對到參考基因組的唯一unigene才用于SNP挖掘。依靠歐式距離（Euclidean distance， ED）和SNP-index關聯分析的方法分別篩選脫葉性狀關聯的區(qū)域，取2種關聯方法的交集定位脫葉候選區(qū)域。

1.2.4? 基因表達量和差異表達? 基于負二項分布的基因模型，使用Cufflinks軟件的Cuffquant和Cuffnorm組件，對基因和轉錄本的表達水平進行定量，由于抽取的轉錄本片段數目與測序數據量，轉錄本長度，轉錄表達水平有關，因此需要采用FPKM進行歸一化[21]，FPKM的計算公式為：

公式中，cDNA Framents表示雙端reads數目;Mapped Fragments表示mapped reads總數;Transcript Length表示轉錄本長度。

借助軟件DEGseq檢測差異表達基因，以q-value < 0.005且log2 Fold Change > 1作為篩選標準，篩選各個樣品中的差異表達基因[22]，通過聚類熱圖進行差異表達基因的可視化分析。利用COG、GO、KEGG、KOG、NR、Pfam等注釋數據庫，對樣本得到的各類基因進行注釋。

1.2.5? 引物設計和qPCR? 熒光定量引物的設計利用Primer Premier 5完成，使用TriZol法提取甘蔗葉鞘RNA。通過qRT-PCR技術檢測不同甘蔗葉位的葉鞘中基因的相對表達水平，qRT-PCR反應溶液的配置參照定量試劑盒的說明書操作[23]。以25s基因作為內參，采用兩步法在LightCycler?96儀器上運行，為了提高擴增效率，程序設為：95 ℃，30 s;95 ℃，10 s;60 ℃，60 s。記錄CT值，以2?ΔΔCT表示樣品中基因的表達量。

1.2.6? 候選基因的生物信息學分析? 使用ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對甘蔗脫葉相關的候選序列進行編碼區(qū)查找，通過NCBI找到與該基因親緣關系相近的其他物種的同類基因，利用MEGA-X構建進化樹，并利用在線工具ITOL（https：//itol.embl.de/）對構建的進化樹進行處理;運用在線工具ExPASy（https：//web. expasy.org/protparam/）分析其理化性質比如相對分子質量、等電點、脂肪族化、不穩(wěn)定系數等指標;使用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析其二級結構、SWISS-MODELR（https：// swissmodel.expasy.org/interactive）分析三級結構、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）分析蛋白的信號肽、Server（http：//www. cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構、Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/）預測編碼蛋白的亞細胞定位情況。

2? 結果與分析

2.1? 組裝和比對

通過Illumina Hiseq 2000測序平臺對4個樣本進行測序，共產生60.46 Gb clean data，T01、T02、T03、T04的clean data分別為8.64、8.74、21.66、21.40 Gb，Q30值分別為93.67%、93.80%、93.97%、94.10%。GC含量分別為52.19%、53.15%、52.24%、51.71%，共產生的片段數為403 279 392。與參考基因組R570比對，比對上的片段比率分別為41.52%、40.28%、43.64%和43.34%（表1）。

2.2? 差異基因表達和候選區(qū)域關聯分析

對于所檢測到的差異基因，樣品T01 vs T02中，共有3223個差異基因，其中1621個基因上調，1602個基因下調。樣品T03 vs T04中，共有842個差異基因，其中574個基因上調，268個基因下調。歐式距離關聯分析得到的候選區(qū)域為14個，總長度為4.94 Mb，共包含328個基因，非同義突變SNP位點的基因42個。SNP-index關聯分析共得到14個候選區(qū)域，總長度2.71 Mb，包含183個基因，非同義突變的基因20個。2種方法取交集得到4個與性狀相關的侯選區(qū)域，總長度為1.40 Mb，候選區(qū)域內親本之間非同義突變SNP共22個，混池間存在的非同義SNP共57個。候選區(qū)域共注釋到基因86個，親本間注釋到的非同義突變15個。圖1顯示，在T01 vs T02差異基因、T03 vs T04差異基因，候選區(qū)間的交集中，有2個候選基因在親本之間和子代混池中都表現出了差異，4個候選基因只在親本間顯示出了差異。

2.3? 候選基因定量分析

在親本之間和子代之間都存在差異的候選基因說明存在遺傳效應，很可能與甘蔗脫葉有極其重要的關系。維恩圖顯示出了Sh09_g020080和Sh09_g020620這2個候選基因滿足了各種篩選條件（圖2），特別是Sh09_g020080，無論是親本之間還是子代混池之間都表現出易脫葉的表達量高于難脫葉，很可能存在穩(wěn)定的遺傳差異。Sh09_g020080的注釋結果顯示，具有σ因子活性，參與紅光、藍光、遠紅光反應，Sh09_g020620具有半胱氨酸內肽酶的活性，參與蛋白質水解的過程。Sh09_g020080和Sh09_g020620熒光定量引物設計如表2。BSR亞群體中選取難易脫葉品系的+1～+7葉進行熒光定量分析，結果如圖3A顯示，在+3、+4葉位，易脫葉品系中Sh09_g020620的表達量高于難脫葉品系，而在+1、+2、+5、+6、+7葉位，難脫葉品系的Sh09_g020620表達量高于易脫葉品系，在+7葉位中達到最大值。而對于Sh09_g020080來說，如圖3B顯示，在+2、+7葉位中，易脫葉品系的表達量相對較高，而在+1、+3、+4、+5、+6葉位中，則易脫葉品系的表達量較高，考慮到Sh09_g020080可能存在穩(wěn)定的遺傳效應，因此選擇遺傳基礎一致的其他亞群體進行定量驗證，其結果如圖3C，在+1、+2、+3葉位中，難脫葉品系的Sh09_g020080表達量高于易脫葉品系。在+4、+5、+6、+7葉位中，易脫葉品系的Sh09_g020080表達量高于難脫葉品系。綜合考慮，Sh09_g020080在難、易脫葉品系中存在穩(wěn)定的遺傳差異，推測很可能在甘蔗脫葉過程中是起著重要的作用。

2.4? 甘蔗脫葉相關候選基因的理化性質分析

進化樹分析發(fā)現Sh09_g020080與編碼高粱的σ因子的親緣關系最近（圖4），NCBI中顯示，與XP_002440351.1、XP_021302430.1的一致性分別為85.53%和84.43%，可以通過與高粱的σ因子的特性相比較，了解甘蔗中該基因的特性和作用。利用軟件分析發(fā)現Sh09_g020080 Unigene全長1866 bp，編碼621個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質量為69 533.31 Da。該基因編碼蛋白的理論等電點為10.01，據此可以判斷為堿性蛋白質，不穩(wěn)定指數顯示為60.05，歸為不穩(wěn)定蛋白[24]，平均疏水性為-0.665，為親水蛋白。信號肽的分析發(fā)現有信號肽的可能性僅為0.0009，可以推斷出蛋白不具備信號肽的功能，跨膜結構分析顯示無跨膜結構，σ因子的作用是與RNA的轉錄有關，起到和核心酶啟動子結合的作用[25]，在甘蔗中可能會借助其他物質輔助。亞細胞定位顯示該蛋白存在于葉綠體，這和注釋結果的情況是一致的，該蛋白的作用是參與紅光、遠紅光、藍光反應，所在的位置決定了它的功能。二級結構分析發(fā)現，該蛋白具有α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲，比例分別為47.18%、12.24%、4.83%和35.75%。圖5顯示，三級結構顯示有大量的α-螺旋結構組成一些單獨的區(qū)域，中心部分也是以α-螺旋為主，這些部位很可能就是Sh09_g020080的保守區(qū)域。

3? 討論

無論是機械收獲還是人工收獲，成熟期甘蔗葉片的自然脫落都可以很大程度地減少成本，降低含雜率。BSA技術廣泛使用于各種作物研究，如白菜頭型[26]、向日葵耐鹽性[27]等。BSR技術已經在小麥[11]、玉米[12]、白菜薹[28]、大白菜[29]等作物上得以應用。本研究利用BSR技術篩選出2個主效候選基因（Sh09_g020620，Sh09_g020080），其中Sh09_g020620在親本之間的差異狀況和子代混池中的差異是異向的，具體表現為：親本中為易脫葉品種的表達量高于難脫葉，子代混池中則相反。選取BSR亞群體進行單一品系的熒光定量分析，結果顯示+6葉位葉鞘的表達和子代混池一致，推測該基因的表達可能受環(huán)境或基因互作影響，在遺傳過程中其表達量發(fā)生了變化。Sh09_g020080在子代混池之間和親本內卻表現出了同向的差異（易脫葉品系的表達量比難脫葉的高），選取BSR亞群體單一品系進行分析，與子代混池的差異狀況是一致的。為了進一步驗證Sh09_g020080是否具有不同群體的穩(wěn)定差異遺傳效應，選取‘B35-9בCP08-1553的雜交后代個體中的極端易脫葉品系16-226和極端難脫葉品系16-224進行熒光定量分析，整體的表達趨勢為易脫葉品系的表達量高于難脫葉，和BSR群體中單一品系的不同葉位整體表達趨勢一致。據此，可以初步判斷出Sh09_g020080在難易脫葉品系中的差異是穩(wěn)定存在的。

目前為止，所有研究的陸地植物和藻類的質體都編碼了一個類似細菌RNA聚合酶核心亞基的同源物[30]。在真細菌中，必須存在σ因子識別RNA聚合酶核心酶的啟動子[25]。候選基因Sh09_g020080的注釋顯示具有σ因子活性，進化樹構建發(fā)現Sh09_g020080和高粱中編碼σ因子的親緣關系最近，報道稱高粱σ因子的片段大小為2000 bp[30]，與甘蔗中該基因（1866 bp）相差不大，高粱σ因子含有4個保守結構域，推測甘蔗σ因子三級結構預測的4個螺旋區(qū)域（3個尾部和中心區(qū)域）也可能是保守區(qū)域的位置。

Sh09_g020080參與紅光、藍光、遠紅光反應，σ因子是和光合作用相關的，σ因子具有介導葉綠素積累的作用[31]，推測Sh09_g020080可能也具有積累葉綠素的作用。根據Sh09_g020080的定量結果，該基因在難易脫葉品系中的表達是有差異的，在易脫葉品系中的整體表達趨勢要高于難脫葉，可以推測易脫葉品系有更強的光合作用，相對少量的葉片足夠滿足光合所需，因此，在成熟期易脫葉品系下部有較多的葉片自動脫落。由于關于甘蔗脫葉的研究較少，而且σ因子的研究大多針對菌類，所以只能推測Sh09_g020080和甘蔗脫葉相關。甘蔗脫葉性狀復雜，受較多基因控制，通過本研究可以為甘蔗脫葉研究提供新的見解。

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責任編輯：謝龍蓮