低磷脅迫對柱花草生長及抗氧化系統(tǒng)的影響

王金鵬，廖麗，劉國道，羅麗娟，劉攀道，王志勇

摘? 要：以基因型TF291柱花草為供試材料，分析低磷處理（5 μmol/L）對柱花草生長、抗氧化物質(zhì)及抗氧化保護(hù)酶的影響，探索柱花草抗氧化系統(tǒng)在低磷脅迫下的響應(yīng)機制。結(jié)果表明：（1）與對照磷處理（250 μmol/L）相比，低磷處理抑制了柱花草生長，其葉綠素濃度、最大光化學(xué)效率、地上部和根部生物量均顯著降低（P<0.05）。（2）隨著低磷處理時間的增加，15 d時葉片CAT、POD、SOD、ASP、PAL活性和類黃酮含量顯著提升（P<0.05）;30 d時葉片CAT、SOD、ASP、PPO活性和MDA、H2O2含量顯著提高（P<0.05）。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步探索低磷脅迫下柱花草抗氧化系統(tǒng)的分子響應(yīng)機制提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柱花草;活性氧;低磷脅迫;抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號：S541? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Effects of Low Phosphorus Stress on the Growth and Antioxidant System of Stylosanthes

WANG Jinpeng1， LIAO Li1， LIU Guodao2， LUO Lijuan1， LIU Pandao2*， WAMG Zhiyong3*

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education / College of Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China.

Abstract： Using genotype TF291 as the test material， the effects of low phosphorus treatment （5 μmol/L） on the growth， antioxidant and antioxidant enzymes of Stylosanthes were analyzed to explore the response mechanism of the antioxidant system of Stylosanthes under low phosphorus stress. Compared with the control p treatment （250 μmol/L）， the low p treatment inhibited the growth of stylox， and the chlorophyll concentration， maximum photochemical efficiency， abovementium and root biomass were significantly reduced （P<0.05）. With the increase of the treatment time of low phosphorus， the activity of CAT， POD， SOD， ASP， PAL and the content of flavonoids in leaves were significantly increased at 15 d （P<0.05）. The activity of CAT， SOD， ASP， PPO and content of MDA and H2O2 in leaves were significantly increased at 30 d （P<0.05）. The study would provide an important basis for further exploring the molecular response mechanism of the antioxidant system of Stylosanthes cylindrica under low phosphorus stress.

Keywords： Stylosanthes; reactive oxygen species; low phosphorus stress; antioxidant system

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.017

全球范圍內(nèi)，酸性土壤分布廣泛，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，其中只有12%的土地可用于種植農(nóng)作物[1]。酸性土壤在我國南方分布廣泛，易引起磷、鉀、鎂等元素的缺乏，不利于植物生長[2]。磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，與植物的代謝過程密切相關(guān)[3]。同時它是核酸等生物大分子的組成成分，在參與酶活性調(diào)節(jié)、光合作用等過程中發(fā)揮著重要作用[4]。在酸性土壤中，鐵、鋁等元素活性較高，易與磷素形成難溶性的化合物，使施入土壤中的肥料磷和土壤中的可溶性無機磷固定形成難溶性沉淀物，致使酸性土壤缺乏植物吸收利用的有效磷[5]。植物缺磷影響細(xì)胞分裂，減少植株分蘗，致使植株矮小、葉片暗綠、根系發(fā)育受阻。由于有效磷吸收的減少，植物體內(nèi)光合色素減少、蛋白質(zhì)合成受阻和酶活性發(fā)生改變，誘導(dǎo)光抑制并改變代謝途徑，對植物的生存造成嚴(yán)重威脅，影響植物進(jìn)行正常的生命活動。此外，低磷環(huán)境下增加了植物體內(nèi)活性氧（ROS）的積累，即O2、O2-、H2O2和OH–，這些過量的活性氧影響植物正常的代謝活動[6]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是世界上廣泛種植的豆科牧草，主要分布在我國南方地區(qū)，在我國海南、云南、廣東、廣西、貴州、福建等地區(qū)廣泛種植，具有耐酸瘠土壤、適口性好、抗旱性強、產(chǎn)量高等特點，主要用于飼喂牲畜、水土保持、果草間作，具有較高的經(jīng)濟效益及在生態(tài)工程建設(shè)中起著重要作用[7]。相對苜蓿、綠豆、豌豆等豆科植物，柱花草對酸性低磷土壤具有較強的適應(yīng)性[8-9]，是探索植物響應(yīng)低磷脅迫機理的良好研究材料。目前，已有學(xué)者在柱花草耐低磷基因型篩選、磷利用效率評價、根系構(gòu)型變化、酸性磷酸酶活性及耐低磷差異基因的表達(dá)等方面均有研究。但關(guān)于柱花草在低磷環(huán)境對抗氧化系統(tǒng)變化的影響研究較少，其適應(yīng)低磷脅迫的潛在機制仍不明確。水稻、玉米、大豆、苜蓿等植物在逆境脅迫下抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)及作用機制已較為清楚[10]。過量的活性氧積累是生物分子氧化的原因之一，對植物生長發(fā)育造成不利的影響[11]。因此，本試驗以前期研究所篩選出的耐低磷柱花草品種為受試材料，研究了低磷脅迫下柱花草生長情況、抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化保護(hù)酶的變化，進(jìn)而探究柱花草抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)激變化和作用機制，以期為培育耐低磷新品種提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

材料為較耐低磷品種，編號為TF291號柱花草。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設(shè)計? 參照陳志堅等[12]的方法，挑選籽粒飽滿的柱花草種子置于黑暗處萌發(fā)2～3 d，將長勢一致的幼苗種植于打好孔的黑色泡沫板上，縫隙用海綿填充，然后將泡沫板放在15 L盆上進(jìn)行營養(yǎng)液培養(yǎng)，盆的外部用黑色塑料布包裹。柱花草幼苗正常培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行2個磷濃度處理，磷濃度分別為5 μmol/L（LP）和250 μmol/L（HP）KH2PO4，營養(yǎng)液為1/2 Hoagland溶液，培養(yǎng)期間每5 d換1次營養(yǎng)液，每3 d調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0。在處理的第15、30天分別收取地上部及根部樣品，用于各項生理指標(biāo)的測定。

1.2.2? 葉綠素含量測定? 稱取新鮮葉片0.1 g，用去離子水洗凈擦干，剪碎后加入80%丙酮研磨，將葉片研磨變白并靜置10 min，用干濾紙過濾至25 mL容量瓶中，用80%丙酮定容避光保存，用分光光度計分別測定葉綠素溶液在663、645 nm處吸光度并計算葉綠素含量。

1.2.3? 全磷含量的測定? 在105 ℃下分別將柱花草地上部和根部樣品殺青30 min，85 ℃烘干并稱取樣品干重，分別稱取地上部和根部樣品0.1 g于25 mL消煮管中，加入80%濃硫酸3 mL溶解樣品并靜置2 h，將消煮管置于電爐上加熱2 h，將消煮完全的消煮液定容并靜置。將消煮液用于連續(xù)流動分析儀（法國Alliance）測定全磷濃度，計算全磷含量。

1.2.4? 抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性的測定? 抗氧化物質(zhì)（丙二醛、過氧化氫、總酚、類黃酮）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（ASP）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性均采用試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）并按照試劑盒說明書測定。以上每個指標(biāo)測定設(shè)置4個重復(fù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Origin9.1作圖，用SPSS 24.0（SPSS Institute，美國）軟件進(jìn)行方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 低磷脅迫對柱花草生長的影響

從圖1可見，低磷處理（LP）下柱花草葉片失綠、最大光化學(xué)效率下降、生物量降低，顯著抑制柱花草的生長。與對照磷處理（HP）相比，柱花草在低磷處理下15 d時葉片葉綠素含量和最大光化學(xué)效率分別降低14.7%和22.5%;30 d時分別降低33.4%和48.6%，差異顯著（P<0.05）。隨著處理時間的增加，低磷處理下葉片的葉綠素含量和最大光化學(xué)效率降低，分別降低了18.3%和17.6%，而對照組葉片的葉綠素含量和最大光化學(xué)效率無顯著變化（圖1A，圖1B）。

同樣的，低磷處理顯著降低柱花草地上部干重，根部干重在15 d時無顯著變化，在30 d時顯著降低（P<0.05）。低磷處理下地上部分15～30 d幾乎沒有生長，而高磷處理下30 d時的生物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于15 d時的生物量。與對照（HP）相比，低磷處理15 d時地上部干重下降45.2%;30 d時地上部干重和根部干重分別下降88.4%和42.8%，差異顯著（圖1C，圖1D）。

2.2? 低磷脅迫對柱花草全磷含量的影響

從表1可見，低磷處理顯著降低了柱花草地上部和根部的全磷含量。低磷處理15 d時，柱花草地上部全磷含量和根部全磷含量分別為0.73、0.08 mg/g;處理30 d時分別為0.79、0.39 mg/g。高磷處理15 d時，柱花草地上部全磷含量和根部全磷含量分別為6.24、0.79 mg/g;處理30 d時分別為8.17、1.38 mg/g。與對照（HP）相比，低磷處理的柱花草在15 d時地上部和根部全磷含量分別降低了88.3%和89.9%;30 d時分別降低了90.3%和71.7%。此外，低磷處理下地上部全磷含量在處理15 d和30 d時未發(fā)生明顯變化，而根部全磷含量在處理30 d時比15 d時提高了4.9倍。

2.3? 低磷脅迫對柱花草抗氧化物質(zhì)含量的影響

由表2可知，低磷脅迫提升了柱花草植株內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量。丙二醛、過氧化氫和類黃酮的含量隨著處理時間的增加明顯提高，分別提高了14.3%、35.7%、31.1%，差異顯著（P<0.05）。與對照（HP）相比，15 d時丙二醛和總酚含量分別減少了26.7%、69.7%，類黃酮含量增加了6.5%，過氧化氫含量無明顯變化;30 d時，丙二醛、過氧化氫、總酚和類黃酮含量均顯著提高，分別提高了11.1%、47.9%、12.8%、64.5%，差異顯著（表2）。其中，類黃酮含量與對照相比在15 d和30 d時均提高。

2.4? 低磷脅迫對柱花草抗氧化酶活性的影響

植物在低磷環(huán)境下，自身的抗氧化酶活性會發(fā)生改變。從圖2可以看出，低磷處理下柱花草抗氧化酶活性顯著提高。其中，15 d時CAT、POD、SOD和ASP活性顯著上升，與對照（HP）相比，分別上升了4.8、1.4、1.6和1.2倍（圖2）;30 d時CAT、POD和ASP活性顯著上升，與對照（HP）相比，分別上升了6.4、1.5和1.1倍（圖2A，圖2B，圖2D），而SOD活性無顯著變化（圖2C）。隨著低磷處理時間的增加，CAT和SOD活性分別提高了1.3和1.5倍（圖2A，圖2C），而POD活性無明顯變化（圖2B）。

2.5? 低磷脅迫對柱花草苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的影響

由圖3可知，低磷處理對柱花草葉片PAL和PPO活性的影響不同，在低磷處理15 d時柱花草葉片PAL活性顯著提高，與對照（HP）相比提高了2.3倍，而30 d時PPO活性顯著提高，與對照相比提高了2.2倍。

3? 討論

磷參與植物體內(nèi)各種代謝過程，是植物生長所必需的營養(yǎng)元素之一。研究表明，在較低的磷濃度處理下，其可導(dǎo)致大豆、菜豆、大麥葉片失綠并造成植株矮小[13]。本研究中，低磷處理顯著降低了柱花草葉綠素濃度、Fv/Fm、地上部和根部干重（圖1），這與已有研究結(jié)果類似。在低磷處理15 d時，與對照相比柱花草地上部生長受到抑制，而根部生長并未受到抑制，但隨著處理時間的增加，在30 d時地上部生長繼續(xù)受到抑制，但根部干重與15 d時相比顯著增加（圖1D）。柱花草根部干重在15 d時與對照相比無明顯變化，而30 d時則顯著降低，但和地上部分相比受抑制的程度較低，說明當(dāng)柱花草應(yīng)對低磷脅迫時根系起到主導(dǎo)作用。表明柱花草在低磷脅迫下根部卻進(jìn)一步生長變化，這可能是植物本身為適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境所產(chǎn)生的變化，是植物面對不同環(huán)境壓力通常采取的生態(tài)對策，通過根部的發(fā)育，從而形成有利于自身生存的結(jié)構(gòu)特征[14]。在低磷處理下，雖然柱花草地上部的全磷含量顯著高于根部全磷含量，但在30 d時，低磷處理下根部的全磷含量比15 d時顯著提高（表1）。進(jìn)一步表明柱花草具有較強的耐低磷能力?；钚匝酰≧OS）是從植物正常生理過程中釋放出來的，通過調(diào)節(jié)離子通道的活性在調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要作用，適當(dāng)濃度的ROS是植物生理生化過程所必需的，但在逆境脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生過量的ROS，進(jìn)而影響正常的生命活動[15]。本研究中低磷處理15 d時柱花草地上部與根部生物量受到明顯抑制，在低磷脅迫下活性氧的增加影響了柱花草正常的生命活動，而30 d時根部生物量增加說明柱花草通過根部的發(fā)育來消除過多的ROS所帶來的影響。為了有效消除脅迫誘導(dǎo)的有毒活性氧中間產(chǎn)物的積累，植物通常采用抗氧化防御系統(tǒng)應(yīng)對逆境脅迫，該系統(tǒng)由低分子量抗氧化物質(zhì)和抗氧化保護(hù)酶組成[16]。當(dāng)水稻、大豆等植物受到低磷脅迫時，會利用自身的抗氧化系統(tǒng)來清除過量的活性氧，以保護(hù)植物細(xì)胞不受氧化損傷[17]。另外，黃瓜、菜豆中抗氧化物質(zhì)作為抗氧化系統(tǒng)的一部分，參與調(diào)節(jié)滲透平衡，通過增加根系長度、運輸系統(tǒng)活性、提高礦質(zhì)利用效率和增加多種礦質(zhì)養(yǎng)分，保護(hù)膜脂，刺激基因表達(dá)等途徑對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。玉米幼苗通過調(diào)節(jié)抗氧化酶在各種逆境脅迫條件下的活性并改變抗氧化物質(zhì)的量，以消除過量的ROS所帶來的危害，保護(hù)植物并提高自身的抗逆性[19]。本研究中，柱花草在低磷脅迫下其自身的抗氧化物質(zhì)的含量和相關(guān)保護(hù)酶的活性發(fā)生變化，15 d時CAT、POD、SOD、ASP、PAL活性和類黃酮含量提高，30 d時葉片CAT、SOD、ASP、PPO活性和MDA、H2O2含量提高?？寡趸到y(tǒng)在植物適應(yīng)逆境環(huán)境能力方面起著至關(guān)重要的作用。為了減輕逆境脅迫，植物利用抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)來清除過量的活性氧[20]。研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫會影響植物的抗氧化系統(tǒng)，改變抗氧化物質(zhì)的含量和抗氧化酶的活性。如在低磷脅迫下，大豆葉片丙二醛和類黃酮的含量以及水稻葉片CAT和SOD活性均有所增加，進(jìn)而響應(yīng)低磷脅迫[21]。此外，低磷處理也提高了黃瓜幼苗ASP和POD的活性[22]，這與本研究的結(jié)果一致。有效的抗氧化系統(tǒng)對于高等植物在逆境脅迫下的生存至關(guān)重要[19]。低磷脅迫下，15 d時柱花草抗氧化系統(tǒng)通過提高CAT、POD、SOD、ASP、PAL的活性抵御脅迫，30 d時通過提高CAT、SOD、ASP、PPO的活性應(yīng)對脅迫所帶來的危害，表明柱花草在不同處理時期受不同保護(hù)酶的影響不同，在低磷脅迫下由多種抗氧化保護(hù)酶共同調(diào)節(jié)。綜上所述，低磷脅迫抑制柱花草的生長，并影響其自身的抗氧化系統(tǒng)?？寡趸镔|(zhì)與抗氧化保護(hù)酶共同參與調(diào)節(jié)柱花草生命活動以應(yīng)對低磷脅迫所帶來的傷害，其中以提高抗氧化酶的活性為主導(dǎo)。在處理初期和后期柱花草通過提高不同抗氧化保護(hù)酶的活性應(yīng)對脅迫，以清除逆境所產(chǎn)生的過量ROS，從而抑制ROS過度積累。本研究結(jié)果為探索柱花草響應(yīng)低磷脅迫下抗氧化系統(tǒng)變化的機理提供了重要的理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)