辛靈恩 李龍

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不可逆的持續(xù)進行性和破壞性的間質(zhì)性肺疾病，病因復雜且至今不明，發(fā)病機制尚未完全明確，其特征是肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞向肌成纖維細胞分化、膠原沉積和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終將導致不可逆轉(zhuǎn)的漸進性呼吸功能不全[1，2]。目前認為IPF是最常見和最嚴重的肺纖維化形式，纖維化特征是細胞外基質(zhì)蛋白過度沉積在受損上皮細胞的基底膜和肺間質(zhì)組織及肺泡腔內(nèi)[3，4]。IPF在世界范圍均可見發(fā)病，男性發(fā)病較女性更為常見，吸煙是IPF明確的危險因素，高齡是IPF發(fā)病最重要的危險因素之一，其發(fā)病率和患病率隨著年齡的增長而顯著增加，2/3的IPF患者發(fā)病時年齡>60歲，確診時的平均年齡為66歲，在>65歲的人群中，估計患病率可能高達每10萬人中400例[1-4]。目前仍缺乏徹底治愈此病的治療措施，治療上以控制病情進展、改善患者生活質(zhì)量為主要目標。雖然迄今為止人們對IPF發(fā)病機制的尚未完全了解，但越來越多的觀點認為包括細胞衰老在內(nèi)的衰老加速機制在IPF的發(fā)病中起重要作用。本文主要綜述近年來與細胞衰老相關(guān)的研究進展在IPF發(fā)病中的作用，以期在細胞分子層面為IPF今后的治療提供新的線索。

1 細胞衰老

細胞衰老通常被定義為不可逆的細胞周期停滯，是由促衰老應激源誘導的穩(wěn)定復制停滯的進化保守狀態(tài)，損傷蓄積刺激細胞周期素依賴性激酶抑制劑p16 Ink4a和或p53-p21Cip1/Waf1的活性，從而拮抗細胞周期依賴性激酶，激活進入衰老狀態(tài)的兩條途徑，即p16Ink4a/pRb和p53/p21途徑以阻斷細胞周期進展[5]。迄今為止描述的3個原發(fā)性細胞衰老程序：復制衰老、應激誘發(fā)過早衰老、發(fā)育程序性衰老[5-7]。50多年前，Hayflick首先描述了細胞衰老，通過試驗他觀察到人類胎兒成纖維細胞最終會停止分裂，但仍然具有活力和代謝活性，這種現(xiàn)象被稱為“復制衰老”或Hayflick極限，即端?？s短所觸發(fā)的細胞衰老，這發(fā)生在長時間的細胞分裂之后，最終將導致細胞增殖停滯不前[5，6]。“應激誘發(fā)過早衰老”發(fā)生在“復制衰老”之前，由大量的應激源誘導，越來越多的衰老誘導劑不斷被發(fā)現(xiàn)，包括癌基因、活性氧物種和細胞毒性化合物等[6]。發(fā)育程序性衰老是在胚胎發(fā)育早期檢測到的一種最新衰老途徑，研究發(fā)現(xiàn)，該衰老途徑依賴于p21CIP1的表達，這與致癌基因誘導衰老具有相同的特征[7]。衰老細胞的特征包括不可逆性生長停滯、形態(tài)增大、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達、衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶形成和衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)的高表達[8]。

越來越多的證據(jù)支持細胞衰老與IPF的發(fā)病機制有關(guān)[5-10]。有研究通過早期干預自殺基因去除衰老細胞，發(fā)現(xiàn)可消除IPF動物模型的纖維化發(fā)展，在一定程度上恢復衰老小鼠的肺順應性、結(jié)構(gòu)和彈性，這表明衰老細胞可能導致纖維化肺疾病[5]。有研究提出，隨著年齡的增長衰老細胞不斷積累，持續(xù)存在的衰老細胞是包括IPF在內(nèi)的慢性年齡相關(guān)疾病發(fā)展的主要驅(qū)動因素[6，7]。在IPF肺的肺上皮細胞、成纖維細胞和祖細胞中與衰老相關(guān)的多條通路被激活[9，10]，通過促進肺上皮細胞的異常分泌模式，增強肌成纖維細胞對凋亡的抵抗力，從而加重IPF的發(fā)病。

2 細胞衰老在IPF中的作用

2.1 衰老相關(guān)的SASP上調(diào)與IPF的關(guān)系 衰老細胞在代謝上是活躍的，其重要特征是分泌多種被稱為衰老相關(guān)分泌表型的促炎介質(zhì)，包括促炎細胞因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等[11]。SASP表型是DNA損傷、端粒功能障礙、表觀基因組或有絲分裂信號、氧化應激和其他一些衰老誘導刺激的結(jié)果，其刺激因素呈現(xiàn)多樣性[12]。SASP以旁分泌和自分泌的方式進行釋放，作用于鄰近的細胞和周圍組織加速其衰老進程，同時反作用于產(chǎn)生它的細胞并產(chǎn)生強大影響，導致與衰老相關(guān)的細胞功能障礙、修復失敗、免疫功能受損和慢性低度肺部炎癥[13，14]。

與衰老相關(guān)的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVS)是細胞間通訊的重要介質(zhì)，包括外泌體、微泡和凋亡小體[15]。有研究通過研究發(fā)現(xiàn)正常人成纖維細胞在細胞衰老過程中EVS的分泌顯著增加，EVS可能作為一種新型的SASP在細胞衰老過程中發(fā)揮作用[16]。但筆者發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于EVS的報道并不多見。在IPF中，衰老的肺上皮細胞可分泌大量的白細胞介素(interleukin，IL)包括IL-1β、IL-6和IL-8，誘導肺成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，從而加重IPF的發(fā)病[17]。纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor 1， PAI-1)是另一種特征性SASP蛋白，在部分IPF患者的痰、痰巨噬細胞和肺泡中均可見升高[18]。PAI-1長期以來一直被用作細胞衰老的標志物。有證據(jù)表明，PAI-1不僅是細胞衰老的標志物，也是誘導細胞衰老的介質(zhì)，PAI-1在IPF和博萊霉素誘導的肺纖維化模型中的Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells type 2，AEC2)中表達增加，敲除PAI-1基因的小鼠幾乎完全消除了博萊霉素誘導的AEC2衰老和肺纖維化，這提示PAI-1的增加可能是AEC2細胞衰老的基礎(chǔ)并在肺纖維化形成中起重要作用[6，18]。已知轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是一種強烈的促纖維化細胞因子能夠誘導AEC2衰老，衰老的AEC2分泌一系列促纖維化和促炎介質(zhì)，激活肺泡巨噬細胞從而促進肺纖維化，而最新研究發(fā)現(xiàn)這一過程也受到PAI-1的調(diào)節(jié)[19]。SASP在IPF發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，它不僅是細胞衰老的重要特征，也可作為分子介質(zhì)間接誘發(fā)細胞衰老的級聯(lián)反應，提高細胞衰老的分子生物學標志的檢測水平有助于評估病情進展，為IPF的預防和治療提供新的契機。

2.2 肺上皮細胞衰老 近年來，越來越多的觀點支持IFP是一種上皮驅(qū)動性疾病，IPF肺組織中尤其是肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells，AEC)的衰老相關(guān)標記物，包括p16、p21和p53蛋白表達明顯增加，AEC的衰老可視為IPF中促纖維化的始動因素[20-23]，但AEC在IPF中衰老的機制并不十分明確。最近發(fā)現(xiàn)，IPF的活動性纖維化損傷病灶中也存在上皮細胞加速衰老的現(xiàn)象，衰老的上皮細胞可能通過分泌大量的SASP使異常的上皮-間充質(zhì)相互轉(zhuǎn)化作用持續(xù)存在，這在IPF的發(fā)病機制中起重要作用[21，22]。最新研究表明，肺上皮細胞暴露于純碳納米顆粒會導致氧化應激和細胞衰老，碳納米顆粒作為空氣污染的主要成分，可在肺上皮細胞中通過接觸直接觸發(fā)這種效應[22]。IPF中衰老的AEC通過增加SASP的表達而促進成纖維細胞的遷移、增殖和活化，靜息的成纖維細胞活化后獲得肌成纖維細胞表型，促進細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量釋放和沉積，過量的ECM最終將導致肺組織重構(gòu)[1，10]，但迄今為止AEC的衰老與成纖維細胞活化之間的內(nèi)在機制尚不完全清楚。此外，有實驗證實衰老的人支氣管上皮細胞分泌的IL-1足以誘導成纖維細胞分化成肌成纖維細胞，這可能在IPF纖維化發(fā)展中起一定作用[23]。

也就是說，肺上皮細胞衰老在IPF的纖維化調(diào)節(jié)中是一個關(guān)鍵的觸發(fā)點，衰老的AEC并不直接參與纖維化的形成，而是通過活化成纖維細胞間接發(fā)揮作用，因而深入研究AEC衰老的機制對延緩纖維化控制病情進展顯得十分重要。

2.3 肺成纖維細胞衰老 有報道稱成纖維細胞的衰老可能介導了IPF的發(fā)生，然而影響成纖維細胞異?；罨乃ダ蠙C制尚不完全清楚[24-27]。有關(guān)實驗指出，衰老的肺成纖維細胞是IPF纖維化過程中促纖維化白三烯分泌的關(guān)鍵來源，早期衰老的成纖維細胞合成白三烯通過旁分泌機制刺激膠原合成和纖維化[24]。IL-18是最近發(fā)現(xiàn)的一種促炎細胞因子，在結(jié)構(gòu)和功能上與IL-1家族相關(guān)，可誘導肺成纖維細胞衰老，Zhang等[25]首次報道了IL-18結(jié)合蛋白中和IL-18可能通過抑制細胞衰老而起到抗纖維化作用。已知衰老細胞能夠產(chǎn)生較高水平的活性氧，研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4 ，NOX4)是一種產(chǎn)生活性氧的酶且與細胞衰老緊密相關(guān)，IPF患者肺成纖維細胞中NOX4的表達呈結(jié)構(gòu)性上調(diào)，過度表達NOX4可誘導肺成纖維細胞衰老從而導致肺纖維化[26]。有研究發(fā)現(xiàn)IPF患者肺成纖維細胞p21、p16、p53及與衰老相關(guān)分泌表型細胞因子表達增加，這表明IPF肺成纖維細胞具有衰老表型，線粒體功能障礙可能是成纖維細胞衰老的原因[27]。SASP在IPF纖維化發(fā)展進程中起著重要作用，除了衰老的肺上皮以外，已證實衰老的肺成纖維細胞亦可分泌大量的SASP，促進向肌成纖維細胞表型分化參與纖維化形成，與此同時肌成纖維細胞衰老伴隨氧化還原失衡，這將導致衰老相關(guān)的持續(xù)性纖維化[25，27,28]。成纖維細胞作為修復損傷的細胞類型之一，在完成了對IPF肺上皮的損傷修復后迅速被免疫清除，如果清除失敗，持續(xù)存在的衰老成纖維細胞可通過改變分泌型來驅(qū)動疾病發(fā)展過程[27，29]。成纖維細胞衰老與IPF發(fā)病機制的關(guān)系較為復雜，有效抑制IPF中衰老肺成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化有望改善IPF患者肺重構(gòu)和肺功能，這仍需進一步探索研究。

2.4 線粒體異常 線粒體是細胞內(nèi)重要的能量供應來源，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了為細胞供能以外，線粒體還參與了調(diào)控細胞生長和細胞周期、細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，線粒體的穩(wěn)態(tài)和正常功能對于不同組織器官的正常生理狀態(tài)至關(guān)重要。新的證據(jù)表明，線粒體功能障礙在包括慢性肺部疾病在內(nèi)的許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[30]。

線粒體功能障礙是公認的衰老標志，其特征是活性氧的產(chǎn)生增加和生物能量學的改變，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙可能與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機制有關(guān)，IPF中低氧或高碳酸血癥導致的線粒體功能障礙，通過介導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肌成纖維細胞的激活造成肺上皮細胞持續(xù)損傷[31]。在IPF肺肌成纖維細胞中，PARK2基因的表達水平降低，PARK2基因缺乏引起的絲裂原吞噬不足誘導線粒體活性氧的產(chǎn)生增加，這也提示IPF中存在線粒體功能障礙[32]。IPF患者肺內(nèi)的AEC2有明顯的畸形和功能障礙的線粒體積聚，線粒體穩(wěn)態(tài)失調(diào)與PTEN誘導的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)低表達、自噬不足、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物上調(diào)有關(guān)[32，33]。IPF肺泡上皮細胞中可以檢測到受損線粒體的形態(tài)變化及線粒體活性氧增加，而線粒體活性氧可導致細胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷加速細胞衰老[33]。線粒體DNA本身對氧化損傷高度敏感，其損傷和隨后的突變可導致線粒體功能障礙，形成惡性循環(huán)，伴隨著線粒體功能障礙的衰老所誘導的生長停滯被稱為“線粒體功能障礙相關(guān)性衰老”[34]。線粒體不僅通過能量生成調(diào)節(jié)細胞功能，還通過衰老相關(guān)的細胞表型調(diào)節(jié)細胞功能。有研究表明，線粒體功能障礙引起衰老的機制包括活性氧水平升高、NAD/NADH比值改變等，促進細胞衰老的其他線粒體改變是線粒體動力學異常、氧化磷酸化缺陷和鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[9]。眾所周知，端粒隨著年齡的增長而縮短，端粒的縮短會增加IPF的風險，而線粒體功能障礙也會導致端粒磨損，有報道稱，端粒磨損導致染色體縮短最終會減少線粒體的生物合成，二者互為因果，最終將增加活性氧的產(chǎn)生并激活細胞的衰老途徑[35]。

線粒體穩(wěn)態(tài)的維持受多種因素的調(diào)節(jié)，而線粒體異常造成的細胞內(nèi)活性氧的增加對衰老機制的形成起著至關(guān)重要的作用，因此針對細胞內(nèi)線粒體的抗氧化劑可能在與IPF相關(guān)的細胞衰老過程中起到一定拮抗作用。

2.5 PTEN表達缺失 PTEN是一種抑癌基因，也是一種重要的細胞增殖和細胞周期調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)已證實PTEN可通過負性調(diào)控參與特發(fā)性肺纖維化衰老相關(guān)的分子機制[20]。目前已在IPF患者的肺泡上皮細胞和成纖維細胞中檢測到PTEN表達降低和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)高激活狀態(tài)，雖然IPF中PTEN表達缺失的機制尚未完全明確，但已有研究表明PTEN的缺失可能與Caveolin-1蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)[4，36]。Qiu等[20]在早期的研究中利用敲除PTEN基因的小鼠建立博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，證實PTEN的缺失可通過激活Akt通路加速AEC衰老，但目前為止PTEN/Akt通路在AEC衰老中的確切作用仍不清楚。近兩年來，Tian等[37]通過免疫組化和免疫熒光檢測到IPF肺泡上皮細胞中PTEN呈低水平表達，發(fā)現(xiàn)PTEN的缺失可介導一條新的通路，即激活NF-κB(nuclear factor κB)，通過PTEN/NF-κB通路的負性調(diào)控也能促進IPF中AEC的衰老和SASP的分泌，隨即觸發(fā)成纖維細胞膠原沉積導致肺纖維化。PTEN表達缺失與衰老相關(guān)的IPF發(fā)病機制中有密切聯(lián)系，通過PTEN介導的多種信號通路共同促進AEC衰老進而參與IPF中細胞外基質(zhì)的形成與累積，因此針對切斷信號通路的治療可能為IPF提供新的治療方案。

2.6 自噬不足 自噬是一種幫助維持細胞器和蛋白質(zhì)合成、降解和循環(huán)之間的動態(tài)平衡以滿足代謝需求的過程，是一種依賴溶酶體的以降解受損細胞器和蛋白質(zhì)為主的細胞途徑，隨著年齡的增長而減弱[38]。已證明自噬不足會導致細胞衰老，并且在各種衰老狀態(tài)的組織中已觀察到自噬減少的現(xiàn)象，自噬功能缺陷造成細胞內(nèi)有害成分大量積累進而參與細胞衰老的調(diào)節(jié)過程[16]。最近的研究證實，IPF患者暴露于香煙煙霧環(huán)境中可導致氣道上皮細胞自噬不足，進而誘發(fā)細胞衰老和SASP的分泌增加[8]。現(xiàn)在普遍認為p62和泛素化蛋白的表達是自噬不足的特征，Araya等[21]利用免疫組織化學檢測顯示體外模型中的IPF上皮細胞表達的細胞衰老標志p21增加，纖維母細胞灶覆蓋的上皮細胞和成纖維細胞均表達較高水平的p62和泛素化蛋白，由此可見自噬不足與IPF中細胞衰老存在密切關(guān)聯(lián)。另外自噬功能缺陷可通過促進氧化應激、功能障礙的線粒體和脂褐素沉積等進一步加重肺損傷[39]。有研究提出IPF中自噬不足是肺泡上皮細胞加速衰老和肌成纖維細胞分化的潛在機制，IPF中自噬減少聯(lián)合TGF-β可誘導肺泡上皮細胞程序性衰老，而成纖維細胞則通過衰老上皮細胞分泌的SASP誘導肌成纖維細胞分化[40]。另有研究發(fā)現(xiàn)，自噬減少與衰老過程中肺纖維化的易感性有關(guān)，TGF-β1很可能是自噬減少的原因，由TGF-β1觸發(fā)的自噬亦可誘導上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，但TGF-β1與自噬不足的內(nèi)在聯(lián)系尚未研究透徹[39，41]。有學者提出，自噬激活不足可能是細胞周期依賴性激酶抑制劑-1調(diào)節(jié)IPF患者氣道上皮細胞衰老的基礎(chǔ)[42]。

由此可見，細胞衰老的自噬調(diào)節(jié)主要針對IPF中肺泡上皮細胞，成纖維細胞主要受到自噬不足的促纖維化調(diào)節(jié)，自噬失調(diào)可以視為IPF中聯(lián)系肺泡上皮細胞衰老與肌成纖維細胞分化的橋梁。無論是作為發(fā)病機制的調(diào)節(jié)因子還是作為潛在的治療靶點，自噬在人類肺部疾病中尤其是IPF中的作用日益增加。

細胞衰老與IPF密切相關(guān)，隨著對細胞衰老在IPF發(fā)病中作用的深入了解，以參與細胞衰老過程的分子生物學水平作為研究切入點可能為包括IPF在內(nèi)的年齡相關(guān)的慢性肺部疾病提供新的治療方案，也為今后的治愈提供可能，反映衰老生物標志物的檢測有望在IPF患者疾病進展過程中準確地評估衰細胞老狀態(tài)協(xié)助進行早期臨床干預，延緩患者疾病進展改善預后。