沙棘粉和沙棘原漿對(duì)小鼠免疫增強(qiáng)作用的研究

■李帥奇 陳相如 楊明凡，2* 劉振華 寧長(zhǎng)申 張紅英 常 娟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450045；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453521；3.河南華瑞同升生物科技股份有限公司，河南鄭州 450000)

沙棘為胡頹子科沙棘屬，是一種灌木或小喬木[1]，主要于分布我國(guó)華北、西北、西南等省份，常生長(zhǎng)于海拔較高的向陽(yáng)溫帶地區(qū)，在中國(guó)黃土高原極為普遍，可通過其強(qiáng)大的繁殖能力和復(fù)雜的固氮根系，廣泛應(yīng)用于水土保持、防風(fēng)固沙等生態(tài)領(lǐng)域[2-3]。沙棘性溫、味酸、澀，是一種具有生物活性的植物中藥。黃酮類物質(zhì)是沙棘中最主要的活性成分，具有較強(qiáng)的藥理活性[4]。沙棘葉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有大量的粗蛋白、糖類、脂類以及維生素，甚至還有植物中罕見的5-羥色胺等。沙棘具有很好的飼用價(jià)值，利用沙棘葉來飼喂家畜，可以提高日增重、飼料轉(zhuǎn)化率以及畜產(chǎn)品的產(chǎn)量[5]。將沙棘果渣作為動(dòng)物飼料可以改善動(dòng)物機(jī)體的免疫力和抗氧化機(jī)能[6]。以沙棘粕為原料，采用蛋白酶酶解法可制備植物生物活性肽[7]。沙棘是被國(guó)家認(rèn)可的藥食兩用的資源，其藥用功能在中國(guó)藥典中有如下記載：“止咳祛痰，消食化滯，活血散瘀，用于咳嗽痰多，消化不良，食積腹痛，瘀血經(jīng)閉，跌打瘀腫[8]?！苯陙恚臣艿搅藢W(xué)者的廣泛關(guān)注與重視，沙棘的醫(yī)用、保健價(jià)值逐漸被人們所認(rèn)識(shí)、開發(fā)。文章旨在進(jìn)一步探究沙棘產(chǎn)品在小鼠機(jī)體免疫增強(qiáng)方面的作用，為沙棘在飼料添加劑領(lǐng)域的開發(fā)與研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

252只昆明系雄性小鼠，日齡30 d，每只小鼠體重（20±2）g。小鼠基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

試驗(yàn)品：沙棘產(chǎn)品（自制）包括固態(tài)粉散劑和液態(tài)原漿。固態(tài)粉散劑采用沙棘果烘干后粉碎成60目的粉散劑；液體原漿選用沙棘鮮果，用榨汁機(jī)加工成果漿。沙棘產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分含量見表2、表3。

表2 沙棘粉劑營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表3 沙棘原漿營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將252只體重相近的健康小白鼠隨機(jī)分為7組：粉劑低劑量1組（日糧150 mg/g）、粉劑中劑量2組（日糧300 mg/g）、粉劑高劑量3組（日糧600 mg/g），原漿低劑量1組（日糧50 μL/只）、原漿中劑量2組（日糧100 μL/只）、原漿高劑量3組（日糧150 μL/只）、空白對(duì)照組。其中空白對(duì)照組小鼠正常飼喂，原漿組小鼠采用飲水方式飼喂（每天飲水1次），粉劑組小鼠采用拌料方式飼喂。各組在7、14、21日齡隨機(jī)處死7只小鼠并收集樣品；各組在1、7日齡和14日齡抽取5只小白鼠（已標(biāo)記），進(jìn)行小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，分別在7、14日齡和21日齡觀察結(jié)果。試驗(yàn)期內(nèi)，252只小鼠分21籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)12只，空白對(duì)照組小鼠和粉劑組小鼠自由飲水。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 腸道各段乳酸桿菌計(jì)數(shù)

分別取小鼠的盲腸、直腸、空腸內(nèi)容物1 g，將其各自溶解于99 mL PBS中，充分振蕩后靜置，取1 mL上清液進(jìn)行倍比稀釋，將稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.2 免疫器官指數(shù)測(cè)定

在7、14、21日齡對(duì)預(yù)處死的小鼠進(jìn)行稱重，然后頸椎脫臼處死，稱取脾臟、胸腺重量計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（%）=免疫器官（脾臟、胸腺）/體重×100

1.3.3 腸道黏膜sIgA及呼吸道黏膜sIgA含量的測(cè)定

收集小鼠盲腸、直腸、空腸以及呼吸道氣管黏膜表面物質(zhì)，按照南京建成科技有限公司的試劑盒說明書測(cè)定sIgA含量。

1.3.4 小鼠吞噬指數(shù)的測(cè)定

小鼠處死前稱重，處死后取肝臟稱重。從小鼠尾靜脈按10 μL/g印度墨水注射后立即計(jì)時(shí)，注入墨水后2 min和10 min，分別從眼眶采血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液作空白對(duì)照，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算吞噬指數(shù)（a）。

式中：t1——墨水注射后2 min的時(shí)間；

t2——墨水注射后10 min的時(shí)間；

OD1——墨水注射后2 min樣品的OD值；

OD2——墨水注射后10 min樣品的OD值。

1.3.5 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測(cè)定

用2%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）注射小鼠腹腔，每只200 μL（約1×108個(gè)SRBC），免疫后6 d測(cè)量小鼠左后足足趾部厚度，再在測(cè)量部位皮下注射20% SRBC，注射后24 h再次測(cè)量，同一部位測(cè)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件的one-way ANOVA,LSD法進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘對(duì)小鼠腸道各段乳酸桿菌數(shù)量的影響（見表4）

由表4可知，7日齡時(shí)，粉劑2組、粉劑3組、原漿2組、原漿3組乳酸桿菌數(shù)量與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；14、21日齡時(shí)，各組乳酸桿菌數(shù)量與空白對(duì)照組相比差異均顯著（P＜0.05），其中分別以原漿2組、粉劑2組效果最好。

表4 沙棘對(duì)小鼠腸道各段乳酸桿菌數(shù)量的影響（×106CFU）

2.2 沙棘對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響（見表5）

由表5可知，7日齡時(shí)，各組之間免疫器官指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）；14、21日齡時(shí)，各組免疫器官指數(shù)較空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）。

表5 沙棘對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響（%）

2.3 沙棘對(duì)小鼠腸道、氣管內(nèi)sIgA含量的影響（見表6）

由表6可知，7日齡時(shí)腸道內(nèi)各組sIgA含量無顯著差異（P＞0.05），各組氣管sIgA含量與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；14、21日齡時(shí)，腸道、氣管內(nèi)各組sIgA含量較空白對(duì)照組均有顯著性提高（P＜0.05）。

表6 沙棘對(duì)小鼠sIgA的影響（μg/mL）

2.4 沙棘對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響（見表7）

由表7可知，7日齡時(shí)，各組吞噬指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）；14、21日齡時(shí)，各組吞噬指數(shù)較空白對(duì)照組顯著提高（P＜0.05）。

表7 沙棘對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響

表7（續(xù)） 沙棘對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響

2.5 沙棘對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響（見表8）

由表8可知，7日齡時(shí)，各組遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果均無顯著差異（P＞0.05），14、21日齡時(shí)，各組的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

表8 沙棘對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響（cm）

3 討論

3.1 沙棘對(duì)小鼠腸道各段乳酸桿菌數(shù)量的影響

乳酸桿菌作為一種常見益生菌，是腸道正常菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)宿主有益生作用，具有抑制腐敗菌繁殖、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、通過多種形式對(duì)機(jī)體起到一定降血脂血壓的作用[9]。部分乳酸桿菌可以影響腸道神經(jīng)元的興奮性和結(jié)腸運(yùn)動(dòng)性，且降低血漿中炎癥因子水平。相關(guān)研究表明，乳酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生的乳酸不僅能改變腸道的pH環(huán)境，發(fā)揮益菌作用，同時(shí)能促使胃蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槲傅鞍酌福岣呶傅鞍酌傅幕钚?，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，提高飼料報(bào)酬，改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，給小鼠補(bǔ)飼一定量沙棘產(chǎn)品7 d后，中、高劑量粉劑組、原漿組小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量增加效果顯著，14、21 d后，低、中、高劑量各組小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量增加效果均顯著。說明沙棘可以促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量增加，通過乳酸桿菌調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促消化吸收等功能提高小鼠免疫水平。

3.2 沙棘對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟是動(dòng)物機(jī)體的主要免疫器官，是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所。胸腺是重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育的場(chǎng)所，參與細(xì)胞免疫[12]。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，可以清除衰老細(xì)胞和微生物等物質(zhì)，其中的大量T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在機(jī)體防御和清除功能中具有重要作用[13]。研究表明，免疫器官重量的增加能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，免疫器官重量降低會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制發(fā)生。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的高低是評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。王鳳霞等[14]研究報(bào)道，在飼料中添加3%黃芪莖葉粉可明顯提高雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)（P＜0.05）；楊建平等[15]報(bào)道，在飼料中添加不同濃度刺梨粗提取物能夠顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.05）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠補(bǔ)飼一定量沙棘產(chǎn)品7 d后，低、中、高劑量各組小鼠免疫器官指數(shù)均無明顯變化，14、21 d后，低、中、高劑量各組小鼠免疫器官指數(shù)均得到顯著提高。說明沙棘可以通過促進(jìn)小鼠免疫器官的增長(zhǎng)來增強(qiáng)其機(jī)體免疫反應(yīng)。

3.3 沙棘對(duì)小鼠腸道、氣管內(nèi)sIgA含量的影響

sIgA是由J鏈連接成的多聚體IgA與分泌片段結(jié)合后形成的復(fù)合物,是腸黏膜表面主要的免疫球蛋白，它能有效地阻斷病原體對(duì)深層組織的感染和入侵，以sIgA為主的體液免疫是防御病原菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線[16-17]。相關(guān)研究表明，sIgA在腸黏膜中具有組織細(xì)菌吸附、中和毒素和封閉外入抗原的作用。趙姍姍等[18]指出，板藍(lán)根多糖能夠促進(jìn)小腸sIgA表達(dá)量增加，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。王雪等[19]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)根菇多糖能夠促進(jìn)小鼠腸黏膜sIgA的分泌量增加。王希春等[20]試驗(yàn)結(jié)果得出，黨參多糖能夠通過體液免疫顯著提高仔豬十二指腸、空腸和回腸黏膜sIgA含量，增強(qiáng)腸道黏膜免疫，進(jìn)一步改善了仔豬的黏膜屏障作用。本試驗(yàn)中數(shù)據(jù)顯示，給小鼠補(bǔ)飼一定量沙棘產(chǎn)品7 d后，低、中、高劑量各組小鼠腸道內(nèi)sIgA含量無明顯變化；氣管內(nèi)sIgA含量顯著提高，14、21 d后，低、中、高劑量各組小鼠腸道、氣管內(nèi)sIgA含量均得到顯著提高。說明沙棘可以增加小鼠腸道、氣管內(nèi)sIgA含量，提升黏膜免疫中抗體水平、抵抗外來病原體入侵、增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫力。

3.4 沙棘對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響

單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是動(dòng)物體內(nèi)具有強(qiáng)吞噬能力及防御機(jī)能的細(xì)胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在機(jī)體的自身穩(wěn)態(tài)、免疫監(jiān)視和抗感染等方面發(fā)揮重要作用[21]。巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，具有強(qiáng)大的吞噬能力，吞噬能力是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的通路之一，同時(shí)能夠分泌生物活性效應(yīng)分子來促進(jìn)巨噬細(xì)胞識(shí)別抗原性異物的能力，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[22]。吞噬指數(shù)升高，表明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)。任立煥等[23]利用靈芝沙棘雪蓮片對(duì)小鼠進(jìn)行免疫增強(qiáng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示：靈芝沙棘雪蓮片可顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)（P＜0.05）；劉榮珍等[24]在沙棘對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的試驗(yàn)研究中指出，沙棘能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化作用，提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)、提高小鼠單核巨噬細(xì)胞的碳廓清指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠補(bǔ)飼一定量沙棘產(chǎn)品7 d后，低、中、高劑量各組小鼠吞噬指數(shù)無明顯變化，14、21 d后，低、中、高劑量各組小鼠吞噬指數(shù)均得到顯著提高。說明沙棘可以提高機(jī)體吞噬能力和防御能力來增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

3.5 沙棘對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

SRBC誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）是一種主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。當(dāng)半抗原SRBC第二次與皮膚接觸時(shí)，它與皮膚中表達(dá)的抗原遞呈細(xì)胞結(jié)合，激活組織中的T淋巴細(xì)胞，后者釋放的趨化因子和細(xì)胞因子等可導(dǎo)致局部巨噬細(xì)胞的聚集和血管通透性的升高，從而引起炎癥區(qū)域的明顯腫脹[25-26]。劉小龍等[27]通過小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，反映豬小腸抗菌肽的藥理活性，以期了解豬小腸抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)作用；馬玉玲等[28]在復(fù)方黨參口服液的免疫增強(qiáng)試驗(yàn)中指出，復(fù)方黨參口服液可顯著增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的DTH程度；李杰等[29]在紫蘇籽油對(duì)小鼠免疫增強(qiáng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽油能增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和碳廓清能力，提高ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫力；鄭薇等[30]在研究小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用中發(fā)現(xiàn)，沙棘全果油可以顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠補(bǔ)飼一定量沙棘產(chǎn)品7 d后，低、中、高劑量各組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果無明顯變化，14、21 d后，低、中、高劑量各組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)均得到顯著增強(qiáng)。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的增強(qiáng)說明沙棘可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，對(duì)小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)起到一定調(diào)節(jié)作用。

3.6 沙棘對(duì)機(jī)體免疫功能的影響

徐斌等[31]研究表明，沙棘粉具有調(diào)節(jié)血脂、減輕肝臟氧化損傷、預(yù)防血脂代謝紊亂的作用，這可能與沙棘中含量較多的黃酮類化合物有關(guān)[32]。辛?xí)员蟮萚33]在育肥羔羊飼糧中添加10%～20%沙棘果渣后，羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育和生長(zhǎng)性能得到顯著提高。劉艷豐等[34]在綿羊日糧中添加沙棘葉黃酮（SLF），結(jié)果顯示，SLF可以提高綿羊蛋白質(zhì)的合成；調(diào)節(jié)脂類代謝；增加細(xì)胞因子的含量，顯著提升了綿羊免疫力。王蓉等[35]研究表明，在體外，沙棘多糖能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的釋放；在體內(nèi)，沙棘多糖能夠增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫器官指數(shù)、提升小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能、提高脾臟組織中細(xì)胞因子的水平。本試驗(yàn)結(jié)果說明了沙棘粉和沙棘原漿對(duì)小鼠具有顯著免疫增強(qiáng)作用。

4 結(jié)論

沙棘通過促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)來調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)小鼠消化吸收、促進(jìn)免疫器官增長(zhǎng)、增強(qiáng)黏膜反應(yīng)、提高機(jī)體吞噬能力和防御能力、促進(jìn)小鼠相關(guān)細(xì)胞因子的釋放等多種方式增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)。表明沙棘可以有效刺激小鼠中樞免疫器官（胸腺）的發(fā)育、增強(qiáng)外周黏膜器官（消化道黏膜和呼吸道黏膜）的免疫效果，且使用中劑量時(shí)免疫增強(qiáng)效果最好。有關(guān)沙棘的免疫增強(qiáng)作用機(jī)制，有待后續(xù)研究。