特色民族藥土牛膝中齊墩果酸的含量測(cè)定研究

胡亮，李瑞蓮，王湘波，周明

(1.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院<湖南藥用輔料檢驗(yàn)檢測(cè)中心>，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001)

土牛膝作為瑤族常用藥，應(yīng)用十分廣泛，植物基原主要包括莧科植物粗毛牛膝(AchyranthesasperaL.)、野生牛膝(AchyranthesbidentataBlume)及柳葉牛膝(AchyrantheslongifoliaMakino)的干燥根及根莖。具有清熱解毒、消炎、利咽化痰等作用，用于急慢性咽喉炎、扁桃體炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[1-4]。土牛膝中含有以齊墩果酸為母核的三萜皂苷類成分，水解產(chǎn)物齊墩果酸具有抗氧化、消炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物活性[5-9]。粗毛牛膝、野生牛膝及柳葉牛膝中齊墩果酸含量測(cè)定未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究以齊墩果酸作為指標(biāo)，并對(duì)收集的28批次土牛膝樣品進(jìn)行測(cè)定研究；同時(shí)對(duì)常見混偽品廣東土牛膝、川牛膝進(jìn)行比較，結(jié)果均未檢出齊墩果酸[10-11]，具體研究情況如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀，2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器；Mettler AE240型電子天平(梅特勒-托利多，萬分之一)；XSE205DU型電子天平(梅特勒-托利多，十萬分之一)。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：110709-201808，純度：91.1%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純(Fisher Chemical)；鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等其他試劑均為分析純。28批次土牛膝樣品(野生牛膝16批次、粗毛牛膝7批次、柳葉牛膝5批次)收集于湖南、江西、山東等地，另外2批次廣東土牛膝收集于廣東，2批次川牛膝收集于四川和重慶(見表1)，并由湖南省野生動(dòng)植物司法鑒定中心進(jìn)行鑒定。

表1 樣品收集情況表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm；沃特斯儀器公司)，以乙腈-水(90∶10)為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫35 ℃。理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

A．對(duì)照品;B.藥材 1.齊墩果酸圖1 土牛膝藥材高效液相色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液①(1.046 mg·mL-1)。

2.3 供試品溶液制備 取樣品粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，稱定重量，用鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液①(1.046 mg·mL-1)1、2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=475 854.75X-48 359.23，R2=1.00。結(jié)果表明：齊墩果酸對(duì)照品在1.046～20.92 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液①(1.046 mg·ml-1)5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積的平均值為2 415 412，RSD為0.58%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末(S7)，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6份，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液的齊墩果酸的平均值為26.46 mg·g-1，測(cè)定結(jié)果RSD(n=6)為0.12%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下土牛膝同一份供試品溶液，室溫下放置，在0、6、12、18、24 h 分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，分別記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.38%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的樣品(S7，齊墩果酸平均含量為26.46 mg·g-1)0.5 g，共6份，分別精密稱定，置已精密加入對(duì)照品溶液(7.21 mg·mL-1)2 mL蒸干后的具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，稱定重量，用鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照上述液相色譜條件下進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率，6批樣品平均回收率為96.29%，RSD為1.66%。結(jié)果表明該法加樣回收率較好(見表2)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.9 檢測(cè)限和定量限 取“2.2”項(xiàng)下齊墩果酸對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋，以信噪比為3∶1的濃度作為儀器檢測(cè)限，信噪比為10∶1的濃度為儀器定量限，測(cè)定其檢測(cè)限和定量限分別為0.63 ng和2.13 ng。

2.10 樣品測(cè)定 對(duì)收集的樣品分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按干燥品計(jì)算齊墩果酸含量，測(cè)定結(jié)果見表3。同時(shí)對(duì)常見混偽品川牛膝、廣東土牛膝進(jìn)行測(cè)定(見圖2)，結(jié)果均未檢出齊墩果酸。

表3 土牛膝樣品中齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果表(n=2)

A.土牛膝;B.川牛膝;C.廣東土牛膝 2.齊墩果酸峰圖2 土牛膝、川牛膝及廣東土牛膝色譜疊加圖

3 討論

供試品溶液制備方法采取鹽酸甲醇溶液(1∶9)加熱回流提取，同時(shí)對(duì)不同提取溶劑比例(1∶7、1∶11、1∶15、1∶20)、溶劑體積(10、20、25、50 mL)及提取時(shí)間(30、50、60、70 min)進(jìn)行考察，最終確定供試品制備方法為鹽酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，加熱回流1 h。采用DAD檢測(cè)器在190～420 nm范圍內(nèi)掃描齊墩果酸色譜峰的紫外吸收，結(jié)果在210 nm有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為210 nm。

研究結(jié)果表明，不同基原土牛膝中齊墩果酸含量差異較大，其中7批次粗毛牛膝含量范圍為1.0683%～2.7562%，平均值為1.954%；16批次野生牛膝含量范圍為1.3957%～2.7617%，平均值為2.036%；5批次柳葉牛膝含量范圍為0.9694%～1.6921%，平均值為1.372%。整體而言，野生牛膝中齊墩果酸含量高于粗毛牛膝，粗毛牛膝高于柳葉牛膝，常見混偽品川牛膝和廣東土牛膝中均未檢出齊墩果酸，與土牛膝化學(xué)成分差異較大，易于區(qū)分。

對(duì)不同的采收時(shí)間與齊墩果酸含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明，冬季采收樣品(11月份)含量高于夏季(6月份)采收的樣品(見圖3)，本研究也佐證了標(biāo)準(zhǔn)中采收時(shí)節(jié)的合理性；同一時(shí)間不同地域采集的土牛膝樣品中齊墩果酸含量差異較小，表明土牛膝藥材對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件要求不高。本文研究中以齊墩果酸含量作為考核指標(biāo)，對(duì)3種基原土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝)進(jìn)行了研究，為最終確定植物基原的收載標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的研究基礎(chǔ)。

圖3 不同基原土牛膝不同采收時(shí)間含量分布圖