劉 麗，陳紹通，張 騰，李 琳，劉旭宇，韓邦興,4*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；2皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安 237012；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510000；4安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，六安 237012

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)來源于蘭科石斛屬，為多年生草本植物，具有增強(qiáng)人體免疫力、抗氧化、修復(fù)肝損傷、制止心血管疾病發(fā)生等功效[1-3]?；羯绞粌H有著極大的保健醫(yī)療價(jià)值，而且食用歷史悠久；近幾年，隨著越來越多的人開始關(guān)注保健產(chǎn)品，其市場需求量不斷增加[4]?；羯绞Ｒ匀晟胨?，不同生長年限的霍山石斛，其藥材質(zhì)量也有所差異。石斛屬植物的生長形式是合軸式生長，主軸生長到一定階段就會(huì)停止生長，開始發(fā)出側(cè)芽形成新軸，同樣到一定階段后，新軸上繼續(xù)發(fā)出側(cè)芽又形成新軸，依此往復(fù)，植物得以不斷生長。按照發(fā)芽時(shí)間的前后將霍山石斛分為三年莖(ⅢY3)、二年莖(ⅢY2)、一年莖(ⅢY1)，分別對(duì)應(yīng)根ⅢR3、ⅢR2和ⅢR1；同理，二年生的霍山石斛可分為一年莖(ⅡY1)，二年莖(ⅡY2)，各自對(duì)應(yīng)根ⅡR1和ⅡR2，一年生的霍山石斛為ⅠY1，對(duì)應(yīng)根ⅠR1[5]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物對(duì)蘭科植物的影響不僅關(guān)乎種子萌發(fā)[6]，還能促進(jìn)生長發(fā)育[7]及成分積累等[8]。

迄今為止對(duì)石斛菌根真菌的研究一般采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法，已報(bào)道的有半知菌門(Deuteromycotina)的絲核菌屬(Rhizoctonia)、鏈格孢屬(Alternaria)[9,10]，子囊菌門(Ascomycota)的毛殼菌屬(Chaetomium)、炭角菌屬(Xylaria)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、鐮刀菌屬(Fusarium)[9,11]，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的膠膜菌屬(Tulasnella)[9,12]、小菇屬(Mycena)、蠟殼菌屬(Sebacina)和角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium)[9,13]等。向石斛屬植物接種菌根真菌不僅能夠促進(jìn)植株生長，還具有不同程度的抗旱、抗病以及促進(jìn)石斛堿和多糖的積累等作用[14-16]。雖然近幾年利用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法對(duì)石斛屬植物內(nèi)生菌的研究較多，但因?yàn)槲⑸锱囵B(yǎng)具有很大的隨機(jī)性和盲目性，99%的微生物無法分離得到[17]，目前關(guān)于一年生霍山石斛菌根真菌的研究尚未見報(bào)道。本文運(yùn)用高通量測序技術(shù)以三種類型一年生霍山石斛菌根真菌為研究對(duì)象，目的是能夠系統(tǒng)了解其群落多樣性、差異性及結(jié)構(gòu)組成，為指導(dǎo)霍山石斛合理采收及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

每隔兩個(gè)月于皖西學(xué)院藥用植物園設(shè)施栽培基地采集三種一年生類型(ⅠR1、ⅡR1和ⅢR1)霍山石斛樣品，方法為五點(diǎn)隨機(jī)取樣法，樣品經(jīng)皖西學(xué)院韓邦興教授鑒定。本實(shí)驗(yàn)以1年生霍山石斛的根為研究對(duì)象(從不同生長年限的植物叢中分得)，ⅢR1取自ⅢY1莖下對(duì)應(yīng)的根，ⅡR1取自ⅡY1莖下對(duì)應(yīng)的根，ⅠR1取自ⅠY1莖下對(duì)應(yīng)的根。具體測序樣品信息見表1。

表1 三種類型一年生霍山石斛樣品Table 1 Three types of annual D.huoshanense samples

1.2 方法

1.2.1 樣品消毒處理

將采集的霍山石斛植株用無菌剪刀剪取根，用自來水沖洗干凈，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干，樣品消毒：置于0.1%升汞中浸泡2～3 min，無菌水漂洗3～4次，再置于75%的乙醇中浸泡3 min，無菌水漂洗5～6次，最后用干燥無菌濾紙擦去表面附著的水分，并將須根兩端用無菌剪刀除去，保留中間段。將最后一次沖洗的無菌水均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)3～7天，觀察是否有菌長出，以此驗(yàn)證表面消毒的有效性。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序分析

將上述消毒完全的樣品，按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit說明書的步驟進(jìn)行DNA提取，并用瓊脂糖凝膠檢查DNA的提取效果。真菌ITS1-2擴(kuò)增區(qū)域采用通用引物ITS1F和ITS2R進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系見表2，擴(kuò)增程序見表3?；羯绞鷺悠稤NA檢測合格之后，由上海生工生物工程股份有限公司利用Illumina MiSeqTM平臺(tái)進(jìn)行測序。

表2 反應(yīng)體系Table 2 Reaction system

表3 擴(kuò)增程序Table 3 Amplification procedure

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用QIIME1.8.1對(duì)所得到的基因序列進(jìn)行拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列，得到各樣本高質(zhì)量序列[18]。將高質(zhì)量的序列與數(shù)據(jù)庫中代表性序列進(jìn)行比對(duì)。通過Usearch將所有樣本序列根據(jù)序列間的距離進(jìn)行聚類，然后按照97%的相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)，在此基礎(chǔ)上，選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，而后進(jìn)行各類分析[19]。使用R的Venn Diagram包做出Venn圖，以此統(tǒng)計(jì)樣本中共有及特有OTU的數(shù)量；通過Mothur計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，如Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)及覆蓋率(coverage)[20]；采用Mothur對(duì)相似水平是97%的OTU進(jìn)行稀釋性分析，檢測樣品的取樣深度。采用R對(duì)物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果作圖，計(jì)算樣品中所含何種微生物以及各微生物的相對(duì)豐度。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行差異特征發(fā)現(xiàn)和顯著性檢驗(yàn)，LEfSe(linear discriminant analysis effect size，線性判別分析及影響因子)通過將統(tǒng)計(jì)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與編碼生物一致性和效應(yīng)相關(guān)性的附加檢驗(yàn)相結(jié)合，確定最能解釋組間差異的基因[21]。

2 結(jié)果

2.1 物種組成(OTU)分析

對(duì)真菌ITS1-2區(qū)域進(jìn)行高通量測序，共得到898 663條高質(zhì)量序列，基于≥97%的相似度水平，通過聚類分析共獲得1 928個(gè)有效OTUs(見圖1)，其中ⅠR1中有787個(gè)OTUs，ⅡR1中有1 018個(gè)OTUs，ⅢR1中有903個(gè)OTUs，200個(gè)OTUs共同存在于三組。ⅠR1中特有389個(gè)OTUs，ⅡR1特有516個(gè)OTUs，ⅢR1中特有443個(gè)OTUs。隨著15個(gè)霍山石斛根部樣品的序列數(shù)不斷增加，其稀釋性曲線越來越趨于平緩，說明即使繼續(xù)增加取樣量也只能產(chǎn)生極少量新的OTU(見圖2)，說明取樣量合理，能夠比較準(zhǔn)確地反映霍山石斛菌根真菌群落。

圖1 霍山石斛菌根真菌物種(OTUs)組成Venn圖Fig.1 Venn diagram of species composition of mycorrhizal fungi (OTUs) of D.huoshanense

圖2 樣品真菌測序的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of fungal sequencing

2.2 多樣性指數(shù)分析

三組樣品的Alpha多樣性指數(shù)如表4所示。用Shannon指數(shù)量化微生物群落多樣性。ⅡR1、ⅢR1、ⅠR1組的平均Shannon指數(shù)分別為2.79、2.74、2.42，IIR1>ⅡIR1>IR1。用Chao1算法評(píng)估物種豐富度大小。ⅠR1、ⅡR1、ⅢR1三組群落分布豐度的Chao1指數(shù)分別為320.7、394.27、365.81；同樣，ⅡR1的菌根真菌豐富度最大，ⅠR1最小?；羯绞鳂悠返腸overage值達(dá)到1.00，表明該測序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)情況。Alpha多樣性評(píng)價(jià)箱式圖評(píng)估了三組樣本的離散及分布情況(見圖3)，Shannon指數(shù)的箱式圖表明三組樣品的菌落的均勻度基本一致(P>0.05)，Chao1指數(shù)的箱式圖表明三組樣品的物種豐富度基本一致(P>0.05)。

圖3 Alpha多樣性評(píng)價(jià)菌根真菌菌群Fig.3 Alpha diversity evaluation of mycorrhizal fungi flora注：a：Shannon指數(shù)多樣性；b：Chao1指數(shù)多樣性。Note:a:Shannon index diversity;b:Chao1 index diversity

表4 菌根真菌的Alpha多樣性指數(shù)表Table 4 Alpha diversity index of mycorrhizal fungi

2.3 群落組成分析

基于OTUs聚類分析得到9個(gè)門，30個(gè)綱，71個(gè)目，149個(gè)科，244個(gè)屬。在門水平，霍山石斛根真菌主要集中在子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和毛霉門(Mucoromycota)三個(gè)門，占霍山石斛菌根真菌總量的90%左右(見表5)；同時(shí)5月份的三個(gè)樣品A6、B6、C6中子囊菌門的豐度最大，擔(dān)子菌門的豐度最??；9月份的兩個(gè)樣品A2、C2中擔(dān)子菌門的豐度最大，子囊菌門的豐度最小。在屬水平，unclassified Serendipitaceae、unclassified Auriculariales、Zymoseptoria、unclassified Pleosporales、Fusarium、unclassified Agaricomycetes在三種類型一年生霍山石斛菌根真菌中占優(yōu)勢(見表6)。unclassified Serendipitaceae在ⅠR1中豐度最大(>45%)，在ⅢR1中豐度最小(<5%)，相反Fusarium在ⅠR1中豐度最小(<5%)，在ⅢR1中豐度最大(>20%)；Zymoseptoria在ⅡR1中豐度最大(>10%)，而在ⅠR1、ⅢR1上均小于5%。

表5 門水平各樣品菌群豐度Table 5 Abundance of fungus in each sample at phylum level (%)

表6 屬水平各組樣品菌群豐度Table 6 Abundance of fungus in each group of the genus level (%)

2.4 菌群差異分析

應(yīng)用LEfSe對(duì)三種類型一年生的霍山石斛樣品的菌根真菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)44個(gè)差異豐富的分類學(xué)分支(a = 0.01，LDA score≥2.0)(見圖4)。在屬水平(見圖4a)，ⅠR1組的擬棘殼孢屬(Pyrenochaetopsis)、青霉菌屬(Penicillium)與其他兩組存在顯著差異，且在該組豐度最高；ⅡR1組刺球菌屬(Chaetosphaeria)、柱霉屬(Scytalidium)、鞘孢屬(Chalara)、Zymoseptoria、紅酵母屬(Rhodotorula)、Kockovaella與其他兩組存在明顯豐度差異；ⅢR1組Zasmidium、unclassified Stachybotryaceae、阿太菌屬(Athelia)、糙孢菌屬(Trechispora)與其他兩組存在明顯豐度差異。

圖4 三種類型一年生霍山石斛菌根真菌的LEfSe結(jié)果Fig.4 LEfSe results of three types of mycorrhizal fungi of D.huoshanensis

3 討論與結(jié)論

植物根系微生物不僅能夠通過調(diào)控基因表達(dá)來促進(jìn)化學(xué)成分合成[22]，還可以增加次生代謝產(chǎn)物的積累[23]。近年來對(duì)石斛屬植物根系微生物研究普遍，如石斛屬植物菌根真菌的特異性與寄主植物系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系[24]，研究發(fā)現(xiàn)石斛屬植物鐵皮石斛的根中廣泛分布子囊菌門、擔(dān)子菌門真菌[25,26]等。由于微生物培養(yǎng)的方法研究內(nèi)生菌存在局限性，本文采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)霍山石斛根部內(nèi)生真菌豐富多樣，子囊菌門、擔(dān)子菌門為霍山石斛根部內(nèi)生真菌的主要真菌門，ⅠR1、ⅡR1、ⅢR1有各自的優(yōu)勢菌，與子囊菌門、擔(dān)子菌門在丹參、石斛屬等藥用植物內(nèi)生真菌中也占主導(dǎo)地位報(bào)道基本一致[27,28]。通過Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)三組樣品不管是在物種豐富度還是群落多樣性比較上均無顯著差異。而LEfSe進(jìn)行組間內(nèi)生真菌菌群差異分析發(fā)現(xiàn)，ⅠR1組有3個(gè)科與其他兩組存在顯著差異，且在該組豐度最高；ⅡR1組有5個(gè)科與其他兩組存在明顯豐度差異；ⅢR1組有4個(gè)科與其他兩組存在明顯豐度差異。

已有研究表明，中藥茅蒼術(shù)夏季的菌根內(nèi)生真菌多樣性高于春季和秋季[29]。本研究也對(duì)不同季節(jié)的霍山石斛根部內(nèi)生真菌進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)5月份霍山石斛根中子囊菌門的豐度最大，擔(dān)子菌門的豐度最小，9月份擔(dān)子菌門的豐度最大，子囊菌門的豐度最小，說明季節(jié)可能是影響霍山石斛菌根真菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素。在后續(xù)研究中，擬將石斛根際微生物結(jié)合化學(xué)成分，重點(diǎn)研究根系微生物對(duì)霍山石斛有效成分的影響，為提高霍山石斛品質(zhì)、開發(fā)菌肥提供科學(xué)依據(jù)等。

綜上所述，本研究應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序方法對(duì)霍山石斛菌根真菌ITS1-2區(qū)進(jìn)行測序，得到898 663條ITS rRNA序列，1 928個(gè)OTUs，基于OTU聚類分析得到9個(gè)門，30個(gè)綱，71個(gè)目，149個(gè)科，244個(gè)屬，其中子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉門為霍山石斛根部內(nèi)生真菌的主要真菌門，在5月份子囊菌門的豐度最大，擔(dān)子菌門的豐度最?。籐EfSe分析發(fā)現(xiàn)三種類型一年生霍山石斛菌根真菌有44個(gè)差異豐富的分類學(xué)分支(a = 0.01，LDA score≥2.0)；通過Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)無論是物種組成還是多樣性方面，均是ⅡR1>ⅢR1>ⅠR1，但是Alpha多樣性評(píng)價(jià)箱式圖反映了三組并無顯著差異。