伊麗米熱·吾甫爾，庫熱西·玉努斯，王志濱，國魯源，吳桂霞*

1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院；3新疆醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011

肺癌是全球最常見的癌癥之一。大約85%的肺癌是非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)[1]。臨床對于肺癌的主要治療手段有手術(shù)、化療、放療和生物治療等。完全手術(shù)切除雖有效但前提是該疾病在醫(yī)學(xué)上可操作且可適當(dāng)分期[2]。放、化療藥物具有非特異性，往往產(chǎn)生嚴重的毒副作用。中藥因具有多靶點、多途徑、多效應(yīng)的作用特點在腫瘤的預(yù)防及治療領(lǐng)域發(fā)揮了獨特的作用。已有多種中藥成分及其提取物被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗腫瘤作用，如苦參堿、三羥異黃酮、紫杉醇等，其中一些已廣泛地應(yīng)用于臨床[3-5]。昆侖雪菊又被稱作兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究表明新疆昆侖雪菊富含多酚類、黃酮類、多糖等多種化學(xué)成分[6]，其中黃酮類具有降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等重要的藥理作用[7,8]。但由于黃酮類成分多、靶點多、作用途徑多，使其治療疾病的分子機制研究存在一定困難。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的研究方法，通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”的多層次相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體水平上分析藥物作用靶點及作用機制[9]。本文通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外細胞實驗，分析昆侖雪菊總黃酮(Kunlun chrysanthemum total flavonoids，KCTF)對NSCLC的抗瘤成分及作用機制，為其后續(xù)的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

人非小細胞肺癌細胞(A549)由新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新細胞庫提供。

1.2 藥品與試劑

DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清(賽默飛世爾科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；TRIzol Reagent(賽默飛世爾科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；QuantiNova SYBR Green染料法PCR試劑盒(凱基生物公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；兔單抗Bax、兔單抗Bcl-2(Abcam公司，ab32503、ab32124)；小鼠單抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)；昆侖雪菊(新疆雪菊生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：QS650114020007)。

1.3 儀器

NovoCyte D2060R流式細胞儀(ACEA公司)；MF53倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；ABI 7500 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 KCTF的提取及純化分離

60 ℃烘干箱內(nèi)烘干雪菊，研磨后過篩備用，按照1∶60投料比，加入80%的乙醇，超聲萃取儀超聲1.5 h后過濾，共三次。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得其浸膏。將粗黃酮浸膏裝入大孔樹脂的玻璃層析柱中，經(jīng)12 h浸泡后，60%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸后得KCTF純化物，經(jīng)紫外分光光度計法測其總黃酮含量。

2.2 雪菊-類黃酮廣靶代謝組分析

用600 μL提取液(50%甲醇含0.1%甲酸)復(fù)溶總黃酮純化物，渦旋30 s后冰水浴超聲15 min，4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取上清于2 mL進樣，UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)上機檢測。柱溫箱溫度設(shè)為40 ℃，自動進樣器溫度設(shè)為8 ℃，進樣體積為2 μL。

2.3 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行靶點預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3.1 KCTF靶點預(yù)測

通過HPLC法得到KCTF的化合物組分，從TCMPS(https：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中對KCTF的主要化合物分子進行吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADME/T)預(yù)測和評價。對符合藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性值(drug-like，DL)≥0.18的成分進行篩選,得出總黃酮的有效活性成分。再通過TCMSP平臺預(yù)測上述有效活性成分的靶點。將所有靶點通過STRING(https：//www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫以“Homo sapiens”(人屬)為關(guān)鍵詞進行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)換。

2.3.2 NSCLC相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[10]

通過DiSGeNET(http：//www.disgenet.org/)，以“Non-Small Cell Lung Carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索NSCLC相關(guān)靶點，獲得所有已知的與NSCLC有關(guān)的基因靶點。借助STRING數(shù)據(jù)庫，輸入上述關(guān)鍵靶點，物種限定設(shè)置為人類。將查詢到的與NSCLC有關(guān)的靶點與KCTF有效活性成分的作用靶點取交集，篩選KCTF治療NSCLC的潛在靶點。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫，輸入上述潛在靶點，隨后進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，獲取關(guān)鍵靶點。

2.3.3 關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，并通過OmicShare(http://www.omicshare.com)平臺對結(jié)果進行可視化處理。

2.3.4 總黃酮-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.6.0軟件繪制關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)和KCTF化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)。最后將KCTF化合物-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)進行合并。建立KCTF-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。通過Network analyzer分析評價網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)特性。

2.4 昆侖雪菊總黃酮對A549細胞的抗瘤作用

2.4.1 細胞培養(yǎng)

A549細胞復(fù)蘇后加入到10%的DMEM培養(yǎng)基中，置入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞進入快速生長期后傳代培養(yǎng)。

2.4.2 CCK8法檢測細胞活性

A549細胞接種于96孔板中(1×105/孔)，經(jīng)48 h細胞融合時進行實驗。不同濃度的雪菊總黃酮提取物(400、800、1 600、2 400、3 200 μg/mL)的藥物100 μL，以DDP作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8 100 μL，將培養(yǎng)液傾去，酶聯(lián)儀490 nm波長測各孔的OD值。按照如下公式計算細胞抑制率，半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)值由IC50值計算軟件求出。實驗重復(fù)3次。

細胞生長抑制率=[1-OD實驗/OD對照]×100%

2.4.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

A549細胞接種至6孔板中，待細胞達到對數(shù)生長期后，分為三個處理組：陰性對照組；雪菊總黃酮干預(yù)組；陽性對照組(順鉑，DDP)，干預(yù)處理細胞48 h，胰酶消化后收集細胞懸液，離心5 min；PBS洗滌、重懸后，取100 μL的細胞懸液與Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL混勻后避光，室溫孵育45 min；流式上機檢測，CELL Quest軟件分析。

2.4.4 細胞劃痕實驗觀察細胞遷移

按“2.4.3”干預(yù)細胞48 h后，胰酶消化細胞；用完全培養(yǎng)基制備成1×105/mL單細胞懸液，細胞接種于培養(yǎng)皿中間的2孔插件Insert(70 μL/孔，即每孔7×104/孔)，細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert。每隔12 h拍照記錄。根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。

2.4.5 RT-qPCR檢測A549細胞Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達

收集“2.4.3”中平行處理的各組A549細胞，Trizol提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，獲得cDNA后，以SYBRGreen熒光染料試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，共設(shè)置40個循環(huán)。用2-△△ct法測定目的基因相對表達量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR所用引物序列表Table 1 Primer sequences used for Real-Time PCR

2.4.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2的表達

收集“2.4.3”中平行處理的各組A549細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，電泳分離40 μg蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜，室溫2 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜5次，5 min/次。化學(xué)發(fā)光法曝光至醫(yī)用X膠片上，灰度值掃描后統(tǒng)計處理，重復(fù)三次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 KCTF活性成分篩選

通過HPLC方法對KCTF進行廣靶代謝組分析，共得出68個黃酮化合物，根據(jù)化合物的分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)從TCMPS獲得KCTF的23個活性藥效成分(OB≥30%，DL≥0.18)，其中表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、芹菜素，紫云英苷4個成分含量較高將其納入。共得到27個總黃酮的成分。KCTF活性化合物的化學(xué)信息(見表2)。

表2 KCTF主要的活性化合物Table 2 Active ingredients of KCTF

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 KCTF干預(yù)NSCLC潛在靶點選擇

KCTF的27個活性成分(見表2)從TCMSP數(shù)據(jù)庫和ETCM數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到891個靶點，通過STRING數(shù)據(jù)庫進行基因-蛋白名稱轉(zhuǎn)換及去除重復(fù)的靶基因，共得到303個化合物靶點。將DiSGeNET數(shù)據(jù)庫搜索的靶點信息與NSCLC相關(guān)的靶點取交集得到217個KCTF對NSCLC潛在的作用靶點(見圖1)。

圖1 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖Fig.1 Disease targets-drug targets Venn diagram

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將217個KCTF對NSCLC潛在的作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人類，排除游離的無相互作用蛋白，將minimum required interaction score設(shè)置為大于0.998，獲得蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，邊越粗意味著combine score越大，根據(jù)combine score的大小制作出68個關(guān)鍵蛋白節(jié)點(見圖2)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

3.4 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，88個通路被富集，P<0.01的通路有76條，依據(jù)P值大小，選擇P值最小即相關(guān)度最高的20位，包括細胞凋亡(apoptosis)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、細胞周期(cell cycle)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等?？傸S酮治療NSCLC關(guān)鍵靶點KEGG通路富集結(jié)果見圖3。說明總黃酮有效成分的作用靶點分布在不同的信號通路，通過多成分、多靶點互相調(diào)節(jié)發(fā)揮治療NSCLC的作用。

圖3 KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis

3.5 KCTF-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析

采用Cytoscape 3.6.0構(gòu)建KCTF-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)模型(見圖4)，綠色三角形代表化合物，黃色圓形代表作用靶點，藍色多邊形代表通路。由KEGG反向分析得到的前20個通路中共有65個關(guān)鍵靶點。在KCTF的活性成分中表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate)、槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、漆黃素(fisetin)、黃芩素(baicalein)、金合歡素(acacetin)的自由度較高，具有較多的作用靶點，可能在KCTF治療NSCLC的過程中起到較為核心的作用。在關(guān)鍵靶點方面，HSP90AA1、TP53、AKT1、CCND1、RELA、CDKN1A、MAPK1、CDK4、RB1、CASP3、MDM2、EGFR、CASP9、BAX的自由度均大于15，有較多的活性成分配體。在前20條通路中自由度較大的通路為癌癥的途徑(pathways in cancer)、細胞凋亡(apoptosis)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Aktt signaling pathway)、HTLV-I感染(HTLV-I infection)、病毒致癌(viral carcinogenesis)、細胞周期(cell cycle)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)自由度均大于20，其中PI3K-Akt信號通路的自由度為28。KCTF有效成分作用靶點分布于的代謝通路，相互協(xié)調(diào)。

圖4 KCTF-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.4 KCTF-target-pathways network

3.6 CCK8法檢測KCTF對A549細胞的生長抑制作用

CCK8的結(jié)果表明，KCTF對A549細胞的生長有明顯的抑制作用，且濃度越高對細胞的增殖抑制作用越強；KCTF干預(yù)A549細胞24、48及72 h后，計算IC50值(24 h：2 408.09 μg/mL；48 h：1 613.09 μg/mL；72 h：1 338.48 μg/mL)，結(jié)果表明KCTF對A549細胞的增殖抑制作用具有一定的時間依賴性。根據(jù)上述實驗結(jié)果，將KCTF干預(yù)濃度確定為1 000 μg/mL，干預(yù)時間確定為48 h，用于后續(xù)實驗(見表3)。

表3 KCTF對A549細胞的生長抑制作用Table 3 Inhibitory effect of KCTF on A549

3.7 流式細胞檢測KCTF對A549細胞凋亡的影響

流式的結(jié)果表明，與陰性對照組相比，KCTF干預(yù)組(1 000 μg/mL)干預(yù)A549細胞后明顯促進了細胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表4、圖5)。

圖5 KCTF對A549細胞凋亡的影響Fig.5 The apoptotic effect of KCTF on A549 cells注：A：陰性對照組；B：KCTF干預(yù)組；C：陽性對照組。Note:A:Negative control group;B:KCTF intervention group;C:Positive control group.

表4 KCTF對A549細胞凋亡的影響Table 4 The apoptotic effect of KCTF on A549

3.8 細胞劃痕觀察KCTF對A549細胞遷移的影響

細胞劃痕后在0、12、24、36 h分別在鏡下觀察三組細胞劃痕寬度恢復(fù)的情況，空白對照組基本保持原有的遷移能力，KCTF干預(yù)組(1 000 μg/mL)及陽性對照組在12、24、36 h細胞遷移受到抑制明顯，說明KCTF對A549細胞有抑制腫瘤細胞遷移的能力(見表5)。

表5 KCTF對A549細胞遷移的影響Table 5 Effect of KCTF on A549 cell

3.9 RT-qPCR檢測A549細胞中Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平

與陰性對照組比較，KCTF干預(yù)組(1 000 μg/mL)Bax的mRNA表達水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Bcl-2和MMP-2的mRNA表達水平與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但有下調(diào)趨勢(P>0.05)(見表6)。

表6 KCTF對A549細胞中Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平的影響Table 6 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 mRNA in A549

3.10 Western blot檢測A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白的表達水平

如表7所示，與陰性對照組相比(n=3)，KCTF干預(yù)組(1 000 μg/mL)對A549細胞內(nèi)促凋亡因子Bax的水平顯著升高(P<0.01)，抗凋亡因子Bcl-2的表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax/Bcl-2的比值上調(diào)，表明KCTF對A549細胞可能是通過上調(diào)Bax/Bcl-2的比值的表達來促進NSCLC的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(見圖6)。

表7 KCTF對A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達水平的影響Table 7 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 protein in A549

圖6 KCTF對A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達的影響Fig.6 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 protein in A549 cells注：A：陰性對照組；B：KCTF干預(yù)組；C：陽性對照組。Note:A:Negative control group;B:KCTF intervention group;C:Positive control group.

4 討論

廣泛存在于各種植物中的黃酮化合物是一種很強的抗氧化劑，能有效地清除體內(nèi)自由基，具有抗腫瘤、降血壓、抗衰老等重要的藥理作用。本研究通過HPLC技術(shù)對昆侖雪菊中的總黃酮進行成分分析，結(jié)果顯示相對含量較高的有表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、木犀草素、兒茶素等，已有大量的研究結(jié)果表明槲皮素、木犀草素等黃酮類對多種實體瘤有較好的抗瘤活性[11,12]。體外的細胞實驗已表明，昆侖雪菊總黃酮對人結(jié)腸癌HCTI16細胞、Caco-2細胞具有明顯的增殖抑制作用[13]。但中藥多成分、多靶點、多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的作用特點，使其作用機制的現(xiàn)代化研究存在困難。

2007年Hopkins[14]提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，將藥物、靶點、疾病的關(guān)系在網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出來。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以系統(tǒng)分析中藥的組成成分，挖掘藥物與疾病的共同作用靶點，進而分析生物學(xué)功能和信號通路，這種整體、系統(tǒng)的研究模式與中醫(yī)藥的整體觀理論是相一致的。

在本研究中，通過TCMSP對KCTF的68個成分進行篩選，預(yù)測27個黃酮成分的891個靶點，與NSCLC靶點交集后，獲得217個KCTF干預(yù)NSCLC的可能靶點。其中MAPK1、EGFR、Tp53、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase 3等重要靶點與多個化學(xué)成分存在關(guān)系，表明KCTF各活性成分間存在著密切的協(xié)同關(guān)系。為進一步對KCTF干預(yù)NSCLC的作用機制進行分析，將二者關(guān)系進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與KEGG生物通路富集分析，結(jié)果表明PI3K-Akt信號通路、Bax/Bcl-2抗凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路等與KCTF抗瘤作用有關(guān)。

誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、阻遏周期、抑制遷移是抗瘤藥物主要的作用機制。研究表明許多植物黃酮(如姜黃素、原花青素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等)可以通過干擾PI3K-Akt信號通路，直接抑制PI3k或阻斷PI3K-Akt信號通路，進一步調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)分子的表達，從而加速腫瘤細胞周期、促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，達到抗腫瘤的作用[15,16]。Xiang等[17]研究表明，槲皮素誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡是通過下調(diào)PI3K-Akt信號通路中PI3k、Akt和Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達，使細胞在G0/G1細胞周期阻滯。木犀草素可以通過抑制PI3K-Akt信號通路中MMP-2、MMP-9的表達抑制人黑色素瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡發(fā)揮抗瘤活性[18]。本研究細胞水平的實驗結(jié)果表明，雪菊總黃酮明顯抑制了A549細胞的增殖，促進了細胞的凋亡，抑制細胞的遷移，mRNA水平上驗證了雪菊總黃酮上調(diào)Bax的表達及下調(diào)Bcl-2和MMP-2的表達。當(dāng)細胞內(nèi)Bax高表達時，細胞對死亡信號敏感，促進了細胞發(fā)生凋亡。當(dāng)Bcl-2高表達時，Bcl-2可以和Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡。所以細胞內(nèi)Bax/Bcl-2的比例對決定細胞凋亡的敏感性起到重要作用，因此利用Western blot在細胞水平上的驗證實驗表明雪菊總黃酮明顯上調(diào)Bax/Bcl-2的比值，促進了A549細胞的凋亡。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果，雪菊總黃酮可通過多靶點、多途徑實現(xiàn)干預(yù)NSCLC的作用，其抗腫瘤活性可能與影響凋亡基因Bax及Bcl-2的表達有關(guān)。

本文在細胞水平觀察到了雪菊總黃酮提取物對A549細胞的抗瘤作用，但由于大孔樹脂純化總黃酮的得率較低，藥物對細胞抑制率的IC50較高，后續(xù)為進行體內(nèi)的動物實驗，將優(yōu)化純化方法，提高黃酮得率，降低藥物使用濃度，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，進一步深入研究其抗瘤的分子作用機制。