張德林，喻 文，王 梅，任 敏，茍 琰,3，劉 薇，李 敏*

1成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137；2四川省中藥材集團(tuán)有限責(zé)任公司，成都 610015；3四川省藥品檢驗(yàn)研究院，成都 611731

川芎是傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖，是中醫(yī)臨床上重要的活血止痛藥，被譽(yù)為“血中之氣藥”，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效，常用于胸痹心痛、月經(jīng)不調(diào)、頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥[1,2]。川芎藥效成分主要包括內(nèi)酯類、酚酸類和生物堿類等化合物，如：阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、Z-藁本內(nèi)酯、阿魏酸松柏酯和綠原酸等?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抑制血小板聚集和擴(kuò)張血管等多方面的作用[3]。

川芎是著名的川產(chǎn)道地藥材，也是常用大宗藥材和重要的出口品種，具有近千年的栽種歷史，主產(chǎn)于四川，以四川都江堰、彭州、郫縣等地為道地，當(dāng)前以彭州和眉山兩地產(chǎn)量最大。市售川芎均為人工種植，其中90%以上產(chǎn)自四川[2]。川芎是重金屬鎘(Cd)富集植物，近年來因川芎重金屬含量超標(biāo)(主要是Cd)，嚴(yán)重影響了川芎的出口創(chuàng)匯、用藥安全以及地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和藥農(nóng)的收入[4-6]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，川芎Cd含量超標(biāo)高達(dá)87.99%[7]，川芎藥材Cd含量超標(biāo)給產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來了不利影響。

土壤修復(fù)技術(shù)是緩解土壤重金屬超標(biāo)使用的常規(guī)土壤改良方法，該技術(shù)通常是施用改良劑改變土壤理化性質(zhì)，減少土壤中有效態(tài)重金屬含量，降低植物對(duì)重金屬的吸收。前人研究證實(shí)影響川芎藥材Cd含量的主要因素是其Cd富集特性和土壤中離子態(tài)Cd濃度，而生石灰可通過提高土壤pH、降低土壤中離子態(tài)Cd濃度，進(jìn)而降低川芎藥材Cd含量[4,6,8,9]。Dong等[10]研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)氨基淀粉與Cd2+可通過配位作用結(jié)合，吸附水中的Cd2+。Lu[11]等報(bào)道，石灰、鈣鎂磷肥、泥炭、活性炭和聚丙烯酸鈉組成的復(fù)合改良劑的施用不僅能夠明顯提高蕹菜地上部分生物量，還可以降低蕹菜中Pb、Cd的含量。目前，川芎降低重金屬含量的方法研究主要集中在單施生石灰、硅肥、KH2PO4-NaOH緩沖液等土壤改良劑，而采用復(fù)合形式研究?jī)H課題組前期報(bào)道過一些探索性工作。本文在課題組研究的基礎(chǔ)上[5-7]，采用大田試驗(yàn)，探究生石灰單施或與淀粉、活性炭、磷酸二氫鉀、聚丙烯酸鈉復(fù)合施用對(duì)川芎重金屬含量、藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，并采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法比較各指標(biāo)含量差異，以期篩選出能有效降低川芎重金屬含量，同時(shí)保障藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的方法，為川芎優(yōu)質(zhì)綠色生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

350型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)PE公司)；MARS型微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；ULUP-IV-10T優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)；QUINTIX224-1CN電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；Agilent 1290 Infinity II UHPLC超高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)，色譜柱為Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥

65%MOS級(jí)硝酸(德國(guó)CNW公司)；鎘單元素標(biāo)液1 000 μg/mL(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，GBW08612)；銅(GSB04-1725-2004)、鉛(GSB04-1742-2004)、汞(GSB04-1729-2004)、鍺(GSB04-1728-2004)、銦(GSB04-1731-2004)、(GSB04-1719-2004)、金(GSB04-1715-2004)單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 μg/mL(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；30%過氧化氫(GR)、磷酸二氫鉀(AR)、活性炭(粒狀)均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；生石灰(購(gòu)自西隴化工股份有限公司)；淀粉(吉林中糧能源銷售有限公司)；聚丙烯酸鈉(食品級(jí)，鄭州雪泉聚合材料有限公司)；調(diào)諧液(美國(guó)PE公司，Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb、U混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 μg/L)；超純水由優(yōu)普超純水系統(tǒng)制得。阿魏酸(wkq18042309)、洋川芎內(nèi)酯A(wkq19042509)、綠原酸(wkq17112007)、阿魏酸松柏酯(wkq19042409)、洋川芎內(nèi)酯I(wkq19041810)對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，Z-藁本內(nèi)酯(5408)對(duì)照品購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 樣品來源

2018年在川芎主產(chǎn)區(qū)彭州市敖平鎮(zhèn)(E103°59′21.60″，N31°04′56.70″)、眉山市永壽鎮(zhèn)(E103°51′02.80″，N29°55′45.51″)川芎基地開展大田試驗(yàn)，以汶川縣水磨鎮(zhèn)自繁F1代苓種為試驗(yàn)材料，設(shè)置7個(gè)試驗(yàn)組，詳見表1。以單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)小區(qū)，重復(fù)3次，每個(gè)小區(qū)4 m2(2 m×2 m)，在川芎播種前將相應(yīng)試劑與表土(20 cm)均勻混合，正常播種，統(tǒng)一田間管理。分別于2019年4月中旬(眉山)、5月中旬(彭州)進(jìn)行樣品采挖，樣品采集后去除雜質(zhì)、洗凈泥沙，干燥測(cè)產(chǎn)，粉碎過65目篩備用。

表1 試驗(yàn)處理方法Table 1 Experimental treatment methods

所有藥材樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。

1.4 產(chǎn)量分析

采樣時(shí)挖起全株，去掉非藥用部分，快速洗凈，置電熱鼓風(fēng)干燥箱55 ℃烘干至恒重，冷卻后稱重計(jì)量，以小區(qū)單位面積產(chǎn)量計(jì)算藥材產(chǎn)量。

1.5 浸出物分析

醇溶性浸出物參照《中國(guó)藥典》2020年版一部川芎項(xiàng)下方法測(cè)定；水溶性浸出物參照《中國(guó)藥典》2020年版四部(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定[1]。

1.6 揮發(fā)油分析

參照《中國(guó)藥典》2020年版四部(通則2204)項(xiàng)下?lián)]發(fā)油測(cè)定法中乙法測(cè)定[1]。

1.7 化學(xué)成分分析

阿魏酸含量測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2020年版一部川芎項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定[1]。色譜條件：色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取阿魏酸對(duì)照品2 mg置10 mL棕色量容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，作為阿魏酸貯備液(阿魏酸的濃度為200 μg/mL)；精密量取適量阿魏酸貯備液置于2 mL棕色量容量瓶中，用70%甲醇稀釋至每mL含阿魏酸10、25、50、75、100 μg/mL的系列濃度溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、綠原酸、阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯參照文獻(xiàn)方法[12]測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脫0～0.2 min(5%A)，0.2～7.5 min(5%→80%A)，7.5～8.0 min(80%→100%A)，8.0～8.5 min(100%A)，8.5～9.0 min(100%→5%A)，9.0～10.0 min(5%A)；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm(洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A)，320 nm(綠原酸、阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯)；進(jìn)樣體積2 μL。對(duì)照品溶液的制備：取綠原酸、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸松柏酯和Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品各5 mg，精密稱定，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇-甲酸(95∶5)溶解并定容至刻度，配成對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇-甲酸(95∶5)定容至刻度，配制成含綠原酸178.40 μg/mL、洋川芎內(nèi)酯A 561.60 μg/mL、洋川芎內(nèi)酯I 8.72 μg/mL、阿魏酸松柏酯237.60 μg/mL、Z-藁本內(nèi)酯1 204.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-甲酸(95∶5)25 mL，密塞，稱定重量，超聲(功率180 W，頻率40 kHz)提取60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-甲酸(95∶5)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.8 重金屬分析

川芎藥材重金屬含量參照課題組建立方法[5]進(jìn)行測(cè)定。ICP-MS運(yùn)行條件見表2。

表2 ICP-MS運(yùn)行條件Table 2 ICP-MS operating conditions

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2019進(jìn)行整理計(jì)算，采用R(4.0.3)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析(Pearson)、聚類分析(Complete)、ANOVA分析(Tukey HSD檢驗(yàn))并作圖。參照《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[13](WM/T2-2004)對(duì)樣品中5種重金屬含量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及測(cè)定結(jié)果

Cd、Hg、Pb、As、Cu 5種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，詳見表3，結(jié)果顯示5種元素的線性關(guān)系良好，r值大于0.999，符合藥典規(guī)定；洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、綠原酸、阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯6種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，詳見表4，色譜圖詳見圖1、圖2，結(jié)果表明6種成分的線性關(guān)系良好，r值大于0.999，符合藥典規(guī)定。

表3 5種重金屬的線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限Table 3 Linear relationship,detection limit,and quantitative limit of five elements

表4 6種化學(xué)成分的線性關(guān)系及線性范圍Table 4 Linear relationship and linear range of six chemical components

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram注：A-阿魏酸對(duì)照品；B-川芎樣品。Note:A-Ferulic acid;B-Sample.

圖2 UHPLC色譜圖Fig.2 UHPLC chromatogram注：A-對(duì)照品；B-川芎樣品。1-綠原酸；2-洋川芎內(nèi)酯I；3-洋川芎內(nèi)酯A；4-阿魏酸松柏酯；5-Z-藁本內(nèi)酯。Note:A-Reference substance;B-Sample.1-Chlorogenic acid;2-Senkyunolide I;3-Senkyunolide A;4-Coniferyl ferulate;5-Z-Ligustilide.

川芎樣品檢測(cè)結(jié)果詳見表5。兩地川芎藥材產(chǎn)量為1.98～3.26 t/hm2，醇溶性浸出物為28.70%～36.91%，水溶性浸出物為38.25%～46.26%，揮發(fā)油為0.60～1.29 mL/100g，阿魏酸為0.30%～0.51%，洋川芎內(nèi)酯I為0.02%～0.04%，洋川芎內(nèi)酯A為0.67%～1.94%，綠原酸為0.43%～0.71%，阿魏酸松柏酯為0.57%～1.00%，Z-藁本內(nèi)酯為2.32%～2.92%，Pb為0.48～2.89 mg/kg，Cd為0.12～0.70 mg/kg、As為0.15～0.27 mg/kg、Hg為0.01～0.05 mg/kg、Cu為7.76～14.34 mg/kg。

表5 川芎樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Test results of Chuanxiong samples

2.2 生石灰類處理對(duì)川芎藥材中5種元素含量的影響

生石灰類處理后川芎藥材中5種重金屬含量發(fā)生了不同程度的變化(圖3)?！端幱弥参锛爸苿┩饨?jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(WM/T2-2004)規(guī)定Pb、Cd、As、Hg、Cu含量分別不得過5.0、0.3、2.0、0.2、20 mg/kg，由圖3可看出，眉山產(chǎn)川芎5種元素含量均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，而彭州產(chǎn)川芎僅Cd含量超過標(biāo)準(zhǔn)限量。眉山試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CK相比，T-1～T-5處理川芎Cd含量降低了1.26%～35.22%，其中T-1、T-2、T-3處理降Cd效果最突出，分別降低了26.85%(P<0.01)、15.44%(P<0.05)、35.22%(P<0.01)；T-5、T-6處理川芎Pb含量分別降低了37.76%(P<0.01)、19.77%(P<0.05)；T-2～T-6處理川芎As含量降低了17.33%～42.81%；T-2、T-3處理川芎Cu含量分別降低了17.51%(P<0.01)、19.73%(P<0.01)；不同處理后川芎Hg含量有一定程度的升高，但遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)限量。彭州試驗(yàn)結(jié)果表明，與CK相比，不同處理川芎Cd、Pb、Hg含量均顯著降低，分別降低了15.42%～39.05%、30.15%～50.41%、23.34%～38.05%，其中T-2處理Cd、Pb含量降低最突出，分別降低了39.05%(P<0.01)、50.41%(P<0.01)，不同處理降Cd效果依次是T2>T1>T4>T6>T5>T3；T-1、T-2、T-6處理川芎As含量顯著降低，其中T-1降低最多，降低了31.05%(P<0.01)；不同處理川芎Cu含量較CK無顯著變化。綜合分析，T-1、T-2、T-3處理能顯著降低川芎Cd含量，T-4、T-5、T-6處理能顯著降低彭州川芎Cd含量，T-5、T-6處理能顯著降低川芎Pb含量，T-2、T-6處理能顯著降低川芎As含量，而不同處理對(duì)川芎Hg、Cu含量影響較小。

圖3 生石灰類處理川芎藥材中5種重金屬含量的差異比較Fig.3 Comparison of contents of 5 elements in CX treated by quicklime methods注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001(下同)。Note:Compared with CK,*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001 (the same below).

2.3 生石灰類處理對(duì)川芎藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的影響

生石灰類處理后川芎藥材產(chǎn)量、浸出物及揮發(fā)油有一定程度的變化(圖4)。由圖4可知，與CK相比，眉山不同處理川芎藥材增產(chǎn)0.93%～39.03%，其中T-5處理川芎產(chǎn)量顯著增加(P<0.05)；醇溶性浸出物在28.70%～35.90%之間，符合《中國(guó)藥典》2020年版川芎項(xiàng)下規(guī)定最低限量(12%)，其中T-1～T-4處理醇溶性浸出物較CK顯著降低，降低了14.66%～20.06%(P<0.05)；水溶性浸出物在38.25%～45.58%之間，T-1、T-4處理水溶性浸出物較CK分別降低了10.72%、9.39%(P<0.05)；不同處理川芎揮發(fā)油含量較CK無顯著變化。彭州不同處理川芎藥材增產(chǎn)15.91%～34.97%，其中以T-1增產(chǎn)效果最佳；醇溶性浸出物在31.83%～36.91%之間，符合藥典規(guī)定，除T-2醇溶性浸出物顯著高于CK外，其余處理與CK無顯著差異；川芎樣品水溶性浸出物在40.86%～46.26%之間，不同處理與CK無顯著性差異；與CK相比，T-3、T-4處理?yè)]發(fā)油含量分別降低24.97%(P<0.05)、43.74%(P<0.01)，其余處理與CK無顯著差異。兩地試驗(yàn)結(jié)果表明，生石灰類處理均能不同程度的提高川芎藥材產(chǎn)量，T-2處理能顯著增加川芎醇溶性浸出物，而對(duì)水溶性浸出物、揮發(fā)油含量影響較小。

圖4 生石灰類處理川芎藥材產(chǎn)量、浸出物及揮發(fā)油的差異比較Fig.4 Comparison of yield,extract and volatile oil of CX treated by quicklime methods

生石灰類處理對(duì)阿魏酸等6種成分含量影響差異較大(圖5)。由圖5可見，眉山不同處理川芎阿魏酸含量為0.40%～0.51%，符合《中國(guó)藥典》2020年版川芎項(xiàng)下規(guī)定最低限量(0.1%)，其中T-1、T-3、T-4、T-5處理阿魏酸含量較CK降低了10.13%～21.78%。與CK相比，T-2、T3、T-4處理川芎洋川芎內(nèi)酯I含量顯著升高32.23%～43.25%(P<0.05)；不同處理川芎綠原酸含量顯著降低，其中T-3降低最多，降低了39.23%(P<0.01)；T-1處理川芎阿魏酸松柏酯含量顯著降低了16.25%(P<0.05)；T-4、T-6處理川芎Z-藁本內(nèi)酯含量分別增加12.99%(P<0.05)、17.18%(P<0.01)。彭州不同處理組川芎阿魏酸含量為0.30%～0.34%，符合藥典規(guī)定。與CK相比，T-2、T-5處理川芎洋川芎內(nèi)酯I含量分別增加30.98%、31.88%(P<0.05)；不同處理川芎洋川芎內(nèi)酯A含量均有一定程度地降低，其中T-1、T-2、T-4、T-6處理洋川芎內(nèi)酯A含量降低了23.32%～32.84%(P<0.05)；T-3、T-5、T-6處理川芎綠原酸含量增加28.66%～42.03%(P<0.01)；不同處理川芎阿魏酸松柏酯含量均有一定程度的降低，T-2處理川芎阿魏酸松柏酯、Z-藁本內(nèi)酯含量分別降低30.30%、14.42%(P<0.01)。兩地試驗(yàn)結(jié)果表明，生石灰類處理在兩地對(duì)阿魏酸等6種成分含量影響差異較大，不同處理后彭州川芎洋川芎內(nèi)酯A和阿魏酸松柏酯含量不同程度地降低，眉山川芎阿魏酸和綠原酸含量不同程度的降低，T-2處理能顯著增加川芎中洋川芎內(nèi)酯I含量。

圖5 生石灰類處理川芎藥材中6種成分含量的差異比較Fig.5 Comparison of the contents of 6 components in CX treated by quicklime methods

2.4 相關(guān)性分析

川芎各指標(biāo)相關(guān)分析結(jié)果見圖6。眉山試驗(yàn)結(jié)果表明，醇溶性浸出物、水溶性浸出物、阿魏酸、Cd、Cu與處理方法顯著正相關(guān)，洋川芎內(nèi)酯I、Hg與處理方法顯著負(fù)相關(guān)；洋川芎內(nèi)酯A與Pb呈顯著正相關(guān)；阿魏酸與Hg顯著負(fù)相關(guān)；綠原酸與Cu顯著正相關(guān)；Pb與As顯著正相關(guān)；Pb與Cd顯著負(fù)相關(guān)；Cd與Cu均呈顯著正相關(guān)。彭州試驗(yàn)結(jié)果表明，Pb、Cd、As、Hg 4種元素及洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯2種成分與處理方式顯著正相關(guān)，產(chǎn)量、醇溶性浸出物、水溶性浸出物與處理方式顯著負(fù)相關(guān)；洋川芎內(nèi)酯I與Cu呈顯著負(fù)相關(guān)；洋川芎內(nèi)酯A和阿魏酸松柏酯均與Pb、Cd、Hg呈顯著正相關(guān)；阿魏酸松柏酯與As顯著正相關(guān)；Z-藁本內(nèi)酯與Cd顯著正相關(guān)；Pb與Cd、As、Hg以及Cd與Hg均顯著正相關(guān)。綜合分析，處理方法與Cd顯著正相關(guān)，Pb與Cd顯著負(fù)相關(guān)，Pb與洋川芎內(nèi)酯A、As顯著正相關(guān)。

圖6 相關(guān)分析圖Fig.6 Correlation analysis diagram注：A-眉山；B-彭州。1-處理方法；2-產(chǎn)量；3-醇溶性浸出物；4-水溶性浸出物；5-揮發(fā)油；6-阿魏酸；7-洋川芎內(nèi)酯I；8-洋川芎內(nèi)酯A；9-綠原酸；10-阿魏酸松柏酯；11-Z-藁本內(nèi)酯；12-Pb；13-Cd；14-As；15-Hg；16-Cu。Note:A-Meishan;B-Pengzhou.1-Treatment method;2-Yield;3-Alcohol-soluble extract;4-Water-soluble extract;5-Volatile oil ;6-Ferulic acid;7-Senkyunolide I;8-Senkyunolide A;9-Chlorogenic acid;10-Coniferyl ferulate;11-Z-Ligustilide;12-Pb;13-Cd;14-As;15-Hg;16-Cu.

2.5 聚類分析

為了進(jìn)一步明確產(chǎn)地和處理方法對(duì)川芎各指標(biāo)的影響，利用R軟件繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖7所示。通過橫向聚類反映各指標(biāo)的關(guān)系，通過縱向聚類反映產(chǎn)地和處理方式之間的關(guān)系，并以熱圖顏色的深淺反映各樣品指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值大小。聚類分析結(jié)果顯示，在指標(biāo)方面分為兩類，As、Hg、Pb、Cd、醇溶性浸出物、水溶性浸出物、產(chǎn)量、Z-藁本內(nèi)酯聚為一類，剩余指標(biāo)聚為一類；在產(chǎn)地和處理方式方面，分為眉山產(chǎn)地和彭州產(chǎn)地兩類，而彭州產(chǎn)地將T-2聚為一類，其他處理聚為一類，眉山產(chǎn)地將CK、T-5、T-6聚為一類，其他處理聚為一類。整體來看，彭州樣品在醇溶性浸出物、水溶性浸出物、產(chǎn)量、Z-藁本內(nèi)酯、Hg、Pb、Cd、As高于眉山樣品，而揮發(fā)油、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、綠原酸、Cu、阿魏酸、阿魏酸松柏酯低于眉山樣品，從而說明產(chǎn)地和處理方式均對(duì)各指標(biāo)有影響。

圖7 聚類熱圖Fig.7 Heat map clustering注：1-As；2-醇溶性浸出物；3-水溶性浸出物；4-產(chǎn)量；5-Z-藁本內(nèi)酯；6-Hg；7-Pb；8-Cd；9-揮發(fā)油；10-洋川芎內(nèi)酯I；11-綠原酸；12-阿魏酸；13-Cu；14-洋川芎內(nèi)酯A；15-阿魏酸松柏酯。Note:1-As;2-Alcohol-soluble extract;3-Water-soluble extract;4-Yield;5-Z-Ligustilide;6-Hg;7-Pb;8-Cd;9-Volatile oil;10-Senkyunolide I;11-Chlorogenic acid;12-Ferulic acid;13-Cu;14-Senkyunolide A;15-Coniferyl ferulate.

3 結(jié)論和討論

3.1 結(jié)論

生石灰類處理對(duì)川芎5種重金屬含量、藥材產(chǎn)量及質(zhì)量影響不一，且產(chǎn)地和處理方法均對(duì)各指標(biāo)有影響。綜合考慮降低重金屬效果(主要是Cd)、藥材產(chǎn)量及質(zhì)量，T-1(生石灰6.67 kg/hm2)、T-2(生石灰6.67 kg/hm2+磷酸二氫鉀1.33 kg/hm2)可作為彭州、眉山川芎生產(chǎn)中降低重金屬的方法，T-3(生石灰6.67 kg/hm2+淀粉6.67 kg/hm2)、T-4(生石灰6.67 kg/hm2+聚丙烯酸鈉10 kg/hm2)可分別作為眉山、彭州川芎生產(chǎn)中降低重金屬的方法。T-2處理能顯著降低川芎Cd、As含量，顯著增加川芎醇溶性浸出物和洋川芎內(nèi)酯I含量，并且能一定程度地提高藥材產(chǎn)量；T-1、T-3、T-4能顯著降低川芎Cd含量，提高藥材產(chǎn)量，上述方法既達(dá)到了降低重金屬的效果，同時(shí)也保障了藥材產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，上述方法的降Cd效果與課題組人員Ren[6]前期報(bào)道結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明上述方法在川芎降Cd效果方面的穩(wěn)定性較好，可以為川芎主產(chǎn)區(qū)低Cd川芎藥材的生產(chǎn)提供參考。

3.2 討論

單獨(dú)施用生石灰(T-1 生石灰6.67 kg/hm2)在眉山(26.85%)、彭州(35.18%)均取得較好的降Cd效果，川芎生產(chǎn)過程中添加生石灰可提高土壤pH、降低土壤有效性Cd含量，降低川芎藥材Cd含量[[4,6,8,9]]。因此，生產(chǎn)上通過施用生石灰等土壤改良劑適當(dāng)提高土壤pH是有效降低川芎中Cd含量的有效措施之一。然而，添加生石灰的同時(shí)增加了土壤中Ca濃度，有研究發(fā)現(xiàn)土壤中施加Ca可以減少玉米[14]、小油菜[15]等植物對(duì)Cd的吸收和富集，而He等[16]研究表明Ca對(duì)Cd有一定的活化作用，能夠提高互花米草對(duì)重金屬Cd的吸收積累和向地上部分的轉(zhuǎn)移能力。因此，川芎生產(chǎn)過程土壤中Ca的增加是否對(duì)其Cd吸收和富集有影響有待進(jìn)一步研究闡釋。

土壤中P與Cd存在密切關(guān)系，磷酸鹽可通過誘導(dǎo)吸附和沉淀作用影響Cd的有效性[17]。將磷酸二氫鉀施入土壤中，可提高土壤pH，促進(jìn)Cd生成難溶性磷酸鹽沉淀和羥基磷鉛鎘礦物，降低Cd有效性[18]。有研究報(bào)道，磷酸二氫鉀能顯著降低水稻鎘積累[19]。6個(gè)處理中，眉山T-2(生石灰6.67 kg/hm2+磷酸二氫鉀1.33 kg/hm2)、彭州T-3(生石灰6.67 kg/hm2+淀粉6.67 kg/hm2)處理降Cd效果優(yōu)于T-1，說明磷酸二氫鉀、淀粉與生石灰復(fù)合使用，可以增強(qiáng)降Cd效果。然而相同措施在兩地對(duì)川芎Cd含量的影響存在差異，推測(cè)生石灰類處理對(duì)植物降鎘Cd效果受到土壤理化性質(zhì)的影響，相關(guān)分析和聚類分析顯示，產(chǎn)地和處理方式均對(duì)各指標(biāo)有影響，進(jìn)一步證實(shí)了此猜想。因此，篩選最佳降重金屬方法時(shí)應(yīng)因地制宜。同時(shí)也說明了適宜的土壤改良劑復(fù)合使用能取得更好地降低重金屬的效果。

研究結(jié)果顯示，14份川芎樣品中7份樣品Cd含量超標(biāo)，超標(biāo)率達(dá)50%，并且超標(biāo)的7份樣品均來自彭州試驗(yàn)點(diǎn)，這與彭州土壤Cd背景值(0.54 mg/kg)高于眉山土壤Cd背景值(0.22 mg/kg)以及眉山土壤pH(7.53)大于彭州土壤pH(5.47)有關(guān)。川芎藥材Cd含量的主要影響因素除了土壤Cd高背景值外，其自身的高Cd富集特性仍是主要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)彭州6個(gè)處理組川芎Cd含量較CK降低了15.42%～39.05%，但其鎘含量仍在0.42～0.59 mg/kg之間，基于川芎傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)Cd超標(biāo)現(xiàn)狀，課題組正在開展低Cd富集川芎新品種的篩選，擬為解決川芎重金屬Cd超標(biāo)問題提供更多的可能性。

通過各指標(biāo)的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)Pb與Cd顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)川芎在吸收Pb和Cd時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，許中堅(jiān)等在油菜中發(fā)現(xiàn)相同規(guī)律，Cd對(duì)Pb的吸收積累具有明顯的抑制作用[20]；Pb與洋川芎內(nèi)酯A、As顯著正相關(guān)，推測(cè)川芎生長(zhǎng)發(fā)育過程中植株體內(nèi)Pb含量對(duì)洋川芎內(nèi)酯A合成有一定的影響，川芎吸收As和Pb時(shí)有相互促進(jìn)的作用，Hu在水稻中發(fā)現(xiàn)水稻根系吸收As、Pb時(shí)有相互促進(jìn)的作用[21]。