張廣萍 任德帥 陳團(tuán)團(tuán) 姜巖 杜姝

【摘 要】目的：探討HIF-1α/miR-128-3p和AXIN1在海馬神經(jīng)元凋亡中的作用，旨在闡明缺氧誘導(dǎo)因子miR-128-3p軸在MPTP所致PD小鼠海馬神經(jīng)變性中的作用。方法：通過(guò)腹腔注射MPTP進(jìn)行PD小鼠模型的建立，利用RT-PCR技術(shù)、Western Bolt和TUNEL染色檢測(cè)小鼠海馬腦組織HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表達(dá)與凋亡。結(jié)果：AXIN1在PD小鼠模型中高表達(dá)，而HIF-1α呈低表達(dá)；HIF-1α/miR-128-3p過(guò)表達(dá)可以使Axin1下調(diào)，而Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)升高。結(jié)論：HIF-1α/miR-128-3p軸上調(diào)可通過(guò)抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制MPTP損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

【關(guān)鍵詞】帕金森；miR-128-3p；AXIN1；Wnt/β-catenin；凋亡

帕金森?。≒arkinsons disease，PD）是一種常見(jiàn)而復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，主要以靜止震顫、肌肉強(qiáng)直以及運(yùn)動(dòng)遲緩等為主，其發(fā)病與氧化應(yīng)激、氧氣葡萄糖供應(yīng)不足以及黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性丟失有關(guān)[1]。PD的病因尚未完全闡明，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位變性為主，尚有其他臨床特點(diǎn)，如進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）、紋狀體黑質(zhì)變性（SND）、ShyDrager綜合征（SDS）及橄欖腦橋小腦萎縮（OPCA）等[2]。miRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)PD小鼠模型中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元來(lái)影響PD的進(jìn)展。本研究探討HIF-1α、miR-128-3p和AXIN1在海馬神經(jīng)元凋亡中的作用，旨在闡明缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α/microRNA-128-3p（miR-128-3p）軸在MPTP所致PD小鼠海馬神經(jīng)變性中的作用，為臨床上治療PD提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 構(gòu)建模型與轉(zhuǎn)染

取健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射稀釋后的MPTP溶液，按每千克30mg/次/天，連續(xù)進(jìn)行5d。如果出現(xiàn)倦怠、煩躁、震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等形態(tài)特征表明PD模型構(gòu)建成功。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PD模型組、HIF-1α/miR-128-3p組、AXIN1組，收集小鼠血清以及腦組織進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 RT-PCR技術(shù)

采用TRIZOL試劑盒進(jìn)行提取組織或細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)置條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。放入熒光定量PCR儀檢測(cè)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表達(dá)水平。

1.3 TUNEL法

將獲取的小鼠腦組織經(jīng)過(guò)切片、脫蠟、水化、TBS洗滌室溫孵育等處理后，雙蒸水洗片，滴加TUNEL反應(yīng)液并保持在37℃下孵育90分鐘，室溫后洗滌，加正常山羊血清封閉20分鐘。去掉血清后加入轉(zhuǎn)化的POD溶液于37℃下留置30分鐘。TBS洗滌后加入顯色液，待陽(yáng)性細(xì)胞核染成棕黃色時(shí)用雙蒸水沖洗，終止反應(yīng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 Western Bolt

按照說(shuō)明書(shū)采用RIPA提取組織或細(xì)胞蛋白，裂解離心后用BCA試劑盒檢測(cè)樣本蛋白濃度。

2 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（χ±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MPTP誘導(dǎo)下各指標(biāo)的表達(dá)情況

利用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠腦組織中各指標(biāo)的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，相比于正常組AXIN1呈高表達(dá)，而HIF-1α、 miR-128-3p呈低表達(dá)（P<0.05）。

3.2 過(guò)表達(dá)的HIF-1α/miR-128-3p下調(diào)AXIN1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路利用TUNEL法檢測(cè)

與正常組相比PD組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與PD組相比，注射過(guò)表達(dá)HIF-1α/miR-128-3p組小鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯下降，Wnt/β-catenin蛋白的表達(dá)顯著升高（P<0.05）。由此可知過(guò)表達(dá)的HIF-1α/miR-128-3p通過(guò)下調(diào)AXIN1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而調(diào)控PD引起的神經(jīng)元凋亡。

4 討論

迄今為止，隨著對(duì)PD研究的不斷深入，其病因傾向于與年齡老化、環(huán)境因素、家族遺傳性以及遺傳易感等綜合因素有關(guān)。年齡老化：PD多發(fā)生于中老年人群，通常40歲前發(fā)病的可能性較低，而隨著年齡的增長(zhǎng)，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元、酪氨酸氧化酶和多巴脫羧酶活力，紋狀體多巴胺遞質(zhì)水平隨年齡增長(zhǎng)逐漸減少，PD的發(fā)病率會(huì)出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)，而僅少部分的老年人患此病，表明生理性多巴胺能神經(jīng)元蛻變不足以致病，年齡老化只是促發(fā)因素之一，但仍然存在著密切的關(guān)系[3]。環(huán)境因素：據(jù)臨床流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，PD的患者分別存在一定的地區(qū)差異，因此人文在一些環(huán)境中，某種具有毒性的物質(zhì)會(huì)對(duì)大腦神經(jīng)元造成損傷，加重了PD的發(fā)病[4]。家族遺傳：醫(yī)學(xué)家們?cè)陂L(zhǎng)期的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)帕金森病似乎有家族聚集的傾向，有帕金森病患者的家族其親屬的發(fā)病率較正常人群高一些[5]。遺傳易患：近年在PD患者中曾發(fā)現(xiàn)a共同核素基因的Alα-53THr突變[6]。

microRNAs（miRNAs）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、功能和疾病的關(guān)鍵因子，某些miRNA，如miR-124和miR-128，在神經(jīng)元中高度表達(dá)，并且在腦膠質(zhì)瘤患者中被HIF-1α上調(diào)[7]。而HIF-1α作為調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，是PD進(jìn)展的重要標(biāo)志物，還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞存活信號(hào)，對(duì)某些神經(jīng)退行性變發(fā)揮治療作用[8]。而Wnt作為一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)PD的幾個(gè)細(xì)胞過(guò)程，包括分化，神經(jīng)元存活，神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)[9]。β-catenin在人腦中表達(dá)，是Wnt信號(hào)通路的重要組成部分，參與PD的病理生理[10]。同時(shí)，AXIN1負(fù)性調(diào)節(jié)典型的Wnt信號(hào)通路，和Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的相互作用在細(xì)胞凋亡中起著中心調(diào)節(jié)作用，因此被認(rèn)為是參與PD發(fā)病的新基因之一[11，12]。與此同時(shí)，研究認(rèn)為AXIN1是miR-128的靶基因，有望成為PD的治療候選基因[13]。通過(guò)假設(shè)HIF-1α/miR-128-3p軸可能通過(guò)調(diào)節(jié)AXIN1和相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)PD病理學(xué)產(chǎn)生影響[14]。

本研究表明，HIF-1α/miR-128-3p軸上調(diào)可通過(guò)抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制MPTP損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。HIF-1α具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能用于PD的治療，預(yù)測(cè)HIF-1α同樣可能干擾特發(fā)性PD的發(fā)病機(jī)制，并改善PD患者的臨床預(yù)后，HIF-1α/miR-128-3p的升高可能成為PD患者治療的新靶點(diǎn)[15]。AXIN1有望成為PD的治療候選基因，正在進(jìn)行的臨床前研究應(yīng)最終為這種方法在帕金森病的疾病改良治療中的臨床應(yīng)用開(kāi)辟前景。

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基金項(xiàng)目：《miR-128-3p信號(hào)軸介導(dǎo)AXIN1調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制帕金森海馬神經(jīng)元凋亡》（CSFGG-2020005）。