禽致病性大腸桿菌的分離與毒力基因檢測

王凱莉，劉 成，侯夢丹，史慧娟，楊文文，李玉保，司振書

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000)

0 引言

禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichiacoli，APEC)可引起家禽的大腸桿菌病，出現(xiàn)特征性纖維性病變，如心包炎、氣囊炎、肝周炎、輸卵管炎及腹膜炎等，常與H9亞型流感病毒等其他病原混合感染，嚴(yán)重時可引起敗血癥，導(dǎo)致禽類死亡[1-5]。大腸桿菌分布廣泛，主要通過飲水傳播，也可以通過消化道、呼吸道及種蛋進行傳播。大腸桿菌感染雞胚后會導(dǎo)致雞胚死亡、孵化率降低以及雛雞發(fā)病死亡率增高。禽大腸桿菌病的發(fā)生往往與禽舍通風(fēng)不良、空氣潮濕、氨氣等有害氣體含量高、飼養(yǎng)密度較大等因素有關(guān)，各年齡雞都可感染，幼齡雞更易感，該病一年四季均可發(fā)生，無明顯的季節(jié)性，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[6]。對聊城某肉雞養(yǎng)殖場送檢的12只精神沉郁、消瘦的20日齡817肉雜雞進行剖檢，發(fā)現(xiàn)主要病變?yōu)椋盒陌透伟び欣w維素性滲出物、腸壁有出血點，有些雞只肝臟黃染、腸鼓氣。無菌采取肝臟和心臟進行細菌分離和病毒的檢測，經(jīng)鑒定分離到1株禽致病性大腸桿菌，并對該菌進行了藥敏試驗和毒力基因的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂，腸桿菌科生化編碼鑒定管及藥敏紙片由杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，根據(jù)參考文獻[7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成粘附相關(guān)基因(aatA、papC、tsh、fimC、mat)，侵襲及毒素相關(guān)基因(ibeB、vat、yijp、ibeA)，抗血清存活因子相關(guān)基因(ompA、neuC、cva/cai、iss)及鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(iroN、fyuA、iucD、irp2、chuA)，共18種毒力基因引物。

1.2 細菌的分離培養(yǎng)

將病料劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個菌落進行純化。純化后分別接種普通瓊脂及哥倫比亞血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察生長情況。

1.3 分離菌的染色觀察

挑取分離菌進行涂片、革蘭染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 分離菌的生化鑒定

將分離菌接種于各生化鑒定管，置37℃恒溫箱培養(yǎng)，按使用說明書觀察判定結(jié)果。

1.5 分離菌的藥物敏感性試驗

用浸濕生理鹽水的無菌棉棒擦洗分離菌菌落1～2個，在盛有滅菌生理鹽水的離心管中反復(fù)擠壓混勻，制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海捎眉埰瑪U散法對分離株進行藥物敏性試驗，觀察并測量抑菌圈直徑，按細菌藥敏試紙(擴散法)說明書判斷結(jié)果。

1.6 毒力基因的PCR檢測

挑取純化后的單菌落置于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，放到搖床增菌6～8 h后取出作為模板。采用多重PCR的方法對大腸桿菌的aatA、papC、ibeA、ompA、neuC、iss、iroN、irp2等18種毒力基因進行擴增，各毒力基因引物濃度皆為10 μmol/L。粘附素相關(guān)基因五重PCR擴增體系：aatA和tsh上、下游引物各0.3 μL，papC、fimC和mat上、下游引物各0.2 μL，菌液2 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DEPC水8.1 μL；侵襲及毒素相關(guān)基因四重PCR擴增體系：ibeB 上、下游引物各0.3 μL，vat、yijp和ibeA上、下游引物各0.2 μL，菌液2 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DEPC水8.7 μL；抗血清存活因子相關(guān)基因四重PCR擴增體系：ompA、neuC和cva/cvi上、下游引物各0.2 μL，iss上、下游引物各0.4 μL，菌液2 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DEPC水8.5 μL；鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因五重PCR擴增體系：5個基因的上、下游引物各0.2 μL，菌液2 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DEPC水8.7 μL[8]。

各多重PCR擴增程序皆為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸80 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

剖檢可見心包有纖維素滲出物，有些雞只肝臟黃染，肝包膜有纖維素性滲出物，有的腸壁有出血點，腸鼓氣，如圖1、圖2所示。

2.2 細菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

分離菌在麥康凱瓊脂平板上，的菌落呈紅色、圓形，表面光滑、濕潤，邊緣整齊；在普通瓊脂上形成圓形凸起、光滑、濕潤、灰白色的菌落；在哥倫比亞血瓊脂平板上，生長呈灰白色菌落，無溶血環(huán)如圖3所示。

圖3 分離菌在瓊脂上的生長情況

2.3 分離菌形態(tài)染色特點

菌體呈桿狀，多單個散在，兩端鈍圓。革蘭染色呈紅色，為革蘭陰性菌，如圖4所示。

圖4 分離菌革蘭染色及鏡檢結(jié)果

2.4 分離菌的生化鑒定結(jié)果

分離菌的生化特點為：賴氨酸+，鳥氨酸+，精氨酸-，尿素-，葡萄糖厭氧菌發(fā)酵+，β半乳糖+，乳糖+，山梨醇+，棉子糖+，蔗糖-，肌醇-，七葉苷-，甘露醇+，丙二酸鹽-，靛基質(zhì)試驗+，枸櫞酸鹽和VP試驗為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，與大腸桿菌的生化特點相符合。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)分離到的雞大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果可知，敏感的藥物及抑菌圈直徑分別為：頭孢西叮28 mm，妥布霉素18 mm，大觀霉素18 mm，米諾環(huán)素25 mm，頭孢他叮18 mm，多粘菌素B 14 mm，阿米卡星25 mm；耐藥的藥物及抑菌圈直徑分別為：頭孢曲松8 mm，頭孢哌酮9 mm，頭孢噻肟10 mm，氧氟沙星11 mm，左氟沙星12 mm，諾氟沙星12 mm，環(huán)丙沙星10 mm，鏈霉素10 mm，慶大霉素9 mm，哌拉西林8 mm，四環(huán)素10 mm，氯霉素8 mm；中介的藥物及抑菌圈直徑分別為：卡那霉素16 mm，氨曲南18 mm，頭孢吡肟16 mm。

2.6 毒力基因檢測

毒力基因電泳結(jié)果顯示，分離到的大腸桿菌基因組內(nèi)含有粘附相關(guān)基因aatA、fimC、mat，侵襲及毒素相關(guān)基因ibeB、yijp，抗血清存活因子相關(guān)基因ompA、iss，鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因iroN、iucD，共9種毒力基因如圖5所示。

注：1-3條帶自上而下分別為aatA、fimC和mat基因；2-2條帶自上而下分別為ibeB和yijp基因；3-2條帶自上而下分別為ompA和iss基因；4-2條帶自上而下分別為iroN和iucD基因。

3 討論

禽致病性大腸桿菌攜帶的毒力基因與菌株的致病性有直接關(guān)系[9]。因此大腸桿菌的致病性可以根據(jù)其攜帶的毒力基因來判斷，已有研究表明大腸桿菌攜帶的毒力因子的數(shù)量與致病性具有顯著相關(guān)性[10-11]。也就是說，可通過毒力基因的檢測對大腸桿菌的致病能力進行評估。目前，大腸桿菌毒力因子按功能可分為粘附素、攝鐵系統(tǒng)、毒素、脂多糖、侵襲素和血清抗性相關(guān)因子[12]。王俊麗等[8]的研究表明，聊城地區(qū)雞源大腸桿菌普遍攜帶5～9種毒力基因，且侵襲與毒素相關(guān)基因yijp的攜帶率最高。本研究對禽大腸桿菌常見的18種毒力基因進行檢測，結(jié)果分離菌檢測到9種毒力基因，包括yijp基因。王怡平等[10]的研究表明，大腸桿菌若攜帶iss、cvaC、irp2、iucD、iroN和tsh 6種基因中的3種或3種以上則可判定為致病性大腸桿菌。分離株檢測出其中的iss、iucD、iroN 3個基因，據(jù)此可判定為致病性大腸桿菌。

Oh等[13]研究了9種毒力基因與雞胚致死之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)毒力基因表達頻率越高，胚胎死亡率越高，而最能評估胚胎死亡率的基因是iucD，本試驗分離的大腸桿菌檢測出iucD，提示該分離株可能引起較高的胚胎死亡率。fimC 基因編碼 I型 菌毛，主要在協(xié)調(diào)菌毛裝配及細菌致病過程中起作用。iss 位于ColV質(zhì)粒上，是外膜蛋白的組成成分，iss 基因不僅能使大腸桿菌對 1 日齡雛雞的致病力顯著增強，還能增強轉(zhuǎn)化菌的血清抗性，所以iss基因常作為大腸桿菌毒力基因的參考指標(biāo)[14-15]。試驗中的分離株檢測出fimC和iss，提示分離株對 1 日齡雛雞的致病力較強。ompA編碼腸外致病性大腸桿菌的結(jié)構(gòu)蛋白，ompA基因能增強菌株的抗血清殺菌能力，還有助于菌株進入腦膜引發(fā)感染，增強菌株的生存力和致病性[16]。試驗中分離株攜帶ompA，提示分離株致病性和生存力較強。