王曉英

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

1 引言

李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌，呈圓尾帶狀，是一種非芽孢兼性厭氧菌[1]，有6個(gè)種：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes,LM）、（綿羊）伊氏李斯特氏菌（L.ivanovii）、斯氏李斯特氏菌（L.seeligeri）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）、威氏李斯特氏菌（L.welshimeri）、英諾克李斯特氏菌（L.innocua）[2]。這些菌中，只有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患病[3]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，簡(jiǎn)稱“單增李斯特氏菌”，常見于乳制品、肉類、禽類等食品中，易引起新生兒腦膜炎、孕婦流產(chǎn)、成人敗血癥等疾病，多發(fā)于免疫缺陷患者、妊娠婦女、老人和新生兒[4]。其中孕婦感染比健康成年人高達(dá)20倍，2001年，美國(guó)將其列為法定上報(bào)疾病[5]。國(guó)內(nèi)感染單增李斯特氏菌報(bào)告數(shù)量呈上升趨勢(shì)，主要以新生兒和孕婦為主[6]。GB 29921—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》規(guī)定熟肉制品和即食生肉制品中不得檢出單增李斯特氏菌[7]，因此，單增李斯特氏菌快速、精準(zhǔn)檢測(cè)顯得尤為重要。

本文從單增李斯特氏菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法和VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)應(yīng)用兩方面對(duì)食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)展開分析，找出檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)并提出單增李斯特氏菌快速、精準(zhǔn)檢測(cè)的對(duì)策建議。

2 國(guó)標(biāo)檢測(cè)法分析

2.1 LB1和LB2選擇性增菌

LB 1和LB2均為選擇性增菌液體培養(yǎng)基，含有萘啶酮酸，廣譜抗菌，尤其對(duì)革蘭氏陰性桿菌的抑制生長(zhǎng)能力明顯。多數(shù)情況下，可疑菌經(jīng)LB1增菌培養(yǎng)后進(jìn)行選擇性分離即可被檢測(cè)到，但LB2增菌必不可少，因?yàn)闃悠分腥绻梢删康投?jìng)爭(zhēng)菌含量高，且可疑菌活力很低，需要通過LB2二次增菌培養(yǎng)以提高單增李斯特氏菌的檢出率。

2.2 選擇性平板分離

2.2.1 PALCAM瓊脂培養(yǎng)基

PALCAM 瓊脂除提供必要營(yíng)養(yǎng)外，七葉苷經(jīng)李斯特氏菌水解后，與Fe2+反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素；氯化鋰和其他的抗生素能抑制G-和大多數(shù)G+。李斯特氏菌屬均可水解七葉苷（表1），在PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上均為圓形、灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈。因此，當(dāng)樣品中混雜除單增李斯特氏菌以外的李斯特氏菌屬菌種時(shí)，PALCAM瓊脂培養(yǎng)基無法快速篩選出單增李斯特氏菌。

2.2.2 顯色培養(yǎng)基

李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基，均含有一些細(xì)菌特異性酶的顯色底物，檢驗(yàn)人員可根據(jù)菌落顏色或是否有乳白色暈環(huán)等對(duì)可疑菌做出快速篩選，可極大提高單增李斯特氏菌的檢出率和準(zhǔn)確性。HKListeria和CHROMagar Listeria對(duì)單增李斯特氏菌基本無抑制作用，可根據(jù)菌落顏色和形態(tài)直接對(duì)單增李斯特氏菌進(jìn)行分離篩選。其具有較高靈敏度、特異性和選擇性，是非常有效的選擇性分離培養(yǎng)基。一般情況下，單增李斯特氏菌在HKListeria呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，在CHROMagar Listeria有明顯的白色暈環(huán)（圖1）。為避免出現(xiàn)假陽性，檢測(cè)人員可將可疑菌分離純化后輔以木糖、鼠李糖試驗(yàn)初步確證。

圖1 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基菌落形態(tài)

2.3 木糖、鼠李糖試驗(yàn)

從顯色平板上選取可疑菌進(jìn)行木糖、鼠李糖試驗(yàn)，單增李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖陽性，英諾克李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖反應(yīng)不定。因此，通常情況下，除英諾克李斯特氏菌外，其它李斯特氏菌均可與單增李斯特氏菌快速區(qū)分（表1）。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的生化鑒定。

表1 單增李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別

3 VITEK 2 Compact 30鑒定分析

目前，VITEK 2 Compact 30已成為食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)可疑菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，檢測(cè)人員在可疑菌的鑒定環(huán)節(jié)普遍采用VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)。然而，當(dāng)前測(cè)試卡反應(yīng)底物下，單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌反應(yīng)類型極為相似，僅PIPLC反應(yīng)存在差別（表2）。因此，顯色培養(yǎng)基上的單增李斯特氏菌可疑菌落經(jīng)VITEK 2 Compact 30鑒定后，結(jié)果有可能被誤定為英諾克李斯特氏菌，且可信度達(dá)到可接受水平（≥85%），嚴(yán)重影響了檢測(cè)人員對(duì)可疑菌的準(zhǔn)確檢出。類似情況，國(guó)內(nèi)的多家檢測(cè)機(jī)構(gòu)在參加檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能力驗(yàn)證中均有遇到。筆者咨詢儀器售后服務(wù)工程師后，認(rèn)為可能是VITEK 2 Compact 30分析軟件版本的影響，也可能是菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。

表2 單增李斯特氏菌VITEK 2 COMPACT反應(yīng)情況

4 檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)和對(duì)策建議

綜上，食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)關(guān)鍵在于區(qū)分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌。國(guó)標(biāo)法雖然操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，但仍是目前公認(rèn)的最可靠的方法。為了準(zhǔn)確區(qū)分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌，本文在傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)（圖2）。檢測(cè)人員可用SN/T 5224—2019《出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)標(biāo)法》[8]對(duì)LB2增菌液進(jìn)行快速篩查以初步判斷是否含單增李斯特氏菌。顯色平板上分離所得可疑菌接種木糖和鼠李糖并進(jìn)行溶血試驗(yàn)，同時(shí)劃線TSA-YE平板充分純化。一般情況下，單增李斯特氏菌在新鮮血平板上具有清晰、狹窄、明亮的溶血圈。選擇具有明顯溶血的TSA-YE培養(yǎng)純菌落通過VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和API Listeria測(cè)試卡鑒定。在VITEK 2 Compact 30鑒定結(jié)果與顯色培養(yǎng)基菌落形態(tài)、溶血實(shí)驗(yàn)和熒光PCR檢測(cè)結(jié)果均不一致的情況下，以API Listeria測(cè)試卡補(bǔ)充鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最終判斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序

5 討論

單增李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌，廣泛分布于自然界中，當(dāng)人食用污染有單增李斯特氏菌的食物后，極易發(fā)病，尤其對(duì)新生兒、老年人、孕婦等免疫力低下者。WHO已將單增李斯特氏菌列為四大食源性致病菌之一[9]。國(guó)標(biāo)檢測(cè)法對(duì)樣品進(jìn)行選擇性增菌，然后根據(jù)顯色平板上的特征性菌落分離單增李斯特氏菌，再經(jīng)過一系列生化試驗(yàn)進(jìn)行確證，所需設(shè)備要求、成本低，但操作性強(qiáng)，對(duì)檢驗(yàn)人員檢測(cè)法的掌握程度要求高。筆者認(rèn)為，在傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)法基礎(chǔ)上輔以一些快速檢測(cè)設(shè)備如熒光PCR進(jìn)行初篩是單增李斯特氏菌檢測(cè)的有效手段。另外，國(guó)標(biāo)檢測(cè)法中顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用至關(guān)重要，國(guó)產(chǎn)的有HKListeria，進(jìn)口的有CHROMagar Listeria，單增李斯特氏菌菌落特征明顯，可有效分離出可疑菌。單增李斯特氏菌具有獨(dú)特的溶血特征，對(duì)于顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落先做溶血實(shí)驗(yàn)，綜合溶血、木糖、鼠李糖反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行可疑菌落的后續(xù)鑒定，可大大增強(qiáng)目標(biāo)菌選擇的準(zhǔn)確性。API Listeria測(cè)試卡中的DIM孔是梅里埃的專利，用于檢測(cè)房基酰胺酶，專門用于區(qū)分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌，可等同或替代VITEK 2 Compact 30的鑒定結(jié)果[10]。再者，表1中所列是李斯特氏菌屬典型菌株的生化反應(yīng)特征，但有些菌株某些反應(yīng)類型具有差異，如少數(shù)單增李斯特菌溶血實(shí)驗(yàn)為陰性（ATCC 15313），少數(shù)英諾克李斯特菌木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性（CICC 10416）等，檢驗(yàn)人員不能單純通過表1或某個(gè)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確認(rèn)或排除某一種李斯特氏菌，需同時(shí)采用多種方法進(jìn)行綜合判斷。