王露露，陳楠楠，曹夢思，李 斌，彭雪菲，劉 捷，張 靜，郭新光，劉 明, ，別小妹

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 江蘇南京 210095；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 北京100015；3.食品行業(yè)生產(chǎn)力促進(jìn)中心, 北京100015；4.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心, 北京100015；5.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206）

納豆（Natto）是大豆等豆類經(jīng)納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發(fā)酵而成的一類豆制品[1]，在1980年，芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院的日本研究員Hiroyuki Sumi通過實驗發(fā)現(xiàn)，納豆可以溶解人造纖維蛋白，1987年該團(tuán)隊從納豆中提取到了一種溶解血栓的蛋白酶，并將這種新穎的纖溶酶命名為納豆激酶（Nattokinase，NK）[2]。NK 是一種絲氨酸蛋白酶，又稱枯草桿菌蛋白酶 NAT（EC 3.4.21.62）[3?4]，是典型的單鏈多肽酶，由275個氨基酸組成，分子量約為27 kDa，等電點在 8.6 左右[5]。

NK本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，主要是通過食用納豆進(jìn)入人體發(fā)揮作用，在人體內(nèi)會被分解成多肽和氨基酸等小分子物質(zhì)，使NK無法完整的進(jìn)入血液中，存在其溶栓活性降低或完全喪失的弊端，并且部分氨基酸會在微生物分解作用下產(chǎn)生氨氣及生物胺類物質(zhì)從而使納豆散發(fā)出臭味，在感官上很難被消費者接受[6]，為了降低或者消除傳統(tǒng)發(fā)酵納豆的氨臭味，經(jīng)冷凍、提取、濃縮、干燥等程序后制得凍干粉，后經(jīng)加工工藝的優(yōu)化和口味的改良，出現(xiàn)復(fù)合粉、糖果、膠囊、片劑等產(chǎn)品形式。NK溶栓效果是評價NK質(zhì)量的核心指標(biāo)，NK除了溶解血栓的主要功能外，還可以預(yù)防骨質(zhì)疏松[7]、降血壓[8]、降血脂[9]、減脂助消化[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]等。

目前對于產(chǎn)品中NK的質(zhì)量評價主要體現(xiàn)在酶活力、酶穩(wěn)定性及感官異味等，納豆發(fā)酵產(chǎn)生NK、維生素K2等多種活性物質(zhì)的同時，還會代謝產(chǎn)生生物胺類物質(zhì)，大量攝入會影響人體的生命健康。目前我國的納豆類產(chǎn)品及其形式多樣，加之尚未建立NK的技術(shù)規(guī)范、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的檢驗方法，因此，本文通過簡要綜述NK功能與溶栓機理、產(chǎn)品質(zhì)量與安全評價研究進(jìn)展，旨在為開發(fā)NK保健食品或溶栓藥品以及規(guī)范NK產(chǎn)品質(zhì)量與安全評價方法提供理論依據(jù)。

1 質(zhì)量評價

自1987年發(fā)現(xiàn)NK以來，國內(nèi)外的科研工作者在其酶活力測定方法及酶活特性方面進(jìn)行了深入詳盡的研究[12]，目前酶活力測定方法有瓊脂糖-纖維蛋白平板法、纖維蛋白溶解法、合成基質(zhì)反映法、四肽底物法、Na-對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯法（TAME）、酪蛋白溶解法、纖維蛋白塊溶解時間法（CLT）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。NK溶栓功能作為評價其質(zhì)量的核心指標(biāo)，綜合近年來NK研究成果表明，NK溶栓功能的重點研究在體內(nèi)外溶栓效果及機理發(fā)掘等內(nèi)容上。隨著對NK特性、生理功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)溫度、pH、激活劑和抑制劑是評價NK穩(wěn)定性的重要方面，并且NK的攝入會經(jīng)過消化道吸收作用于人體，因此，考察不同NK產(chǎn)品的酶學(xué)特性是未來評價NK產(chǎn)品質(zhì)量的一大研究方向。

1.1 酶活力測定方法

瓊脂糖-纖維蛋白平板法是以纖維蛋白為底物測定NK活力的傳統(tǒng)方法，也是最早應(yīng)用于NK溶栓活力檢測的方法之一，在國內(nèi)實驗室和企業(yè)研究中應(yīng)用較為廣泛，但該方法的準(zhǔn)確度受實驗室操作者主觀及底物批次的影響較大，如果將量取平板溶解圈直徑的工具及底物統(tǒng)一化，將會大大提高準(zhǔn)確性[13]。2009年“納豆之父”須見洋行博士提出了合成基質(zhì)反應(yīng)法，該方法以發(fā)色底物S-2251（H-D-Val-Leu-LyspNA）和 S-2444（pyro-Glu-Gly-Arg-pNA）作為測定NK活力的基質(zhì)，在美國、歐盟等地區(qū)廣泛應(yīng)用，但該方法使用的基質(zhì)是最適合纖溶酶和尿激酶反應(yīng)的底物，不能完全反映NK的活力值。紫外分光光度法是在合成基質(zhì)反應(yīng)法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種方法，被日本納豆激酶協(xié)會稱為纖維蛋白溶解法（http://jnattokinase.org/），相比于四肽底物法、TAME法、酪蛋白溶解法等其他方法，該方法選擇的纖維蛋白被認(rèn)為是NK最合適的底物，解決了無法區(qū)分出真正的NK與其他相似酶的問題，測定NK活力準(zhǔn)確性和精密度比其他方法要高，被認(rèn)為是目前測定NK活力最合適的一種方法，日本最大的試劑制造廠商和光純藥（WAKO）已經(jīng)采用該法來測定NK活力，并銷售NK標(biāo)準(zhǔn)品?；诂F(xiàn)有的國內(nèi)外NK活力測定方法各有利弊的現(xiàn)狀，亟需結(jié)合不同測定方法對市場產(chǎn)品檢測的準(zhǔn)確性差異進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，統(tǒng)一NK活力測定方法，更好的服務(wù)于NK類產(chǎn)品的質(zhì)量評價。目前NK活力測定方法及檢測活力的準(zhǔn)確性總結(jié)如表1。

表1 NK酶活力測定方法Table 1 NK enzyme activity determination method

1.2 NK溶栓功能與機理

1.2.1 溶栓功能 NK在體內(nèi)外溶栓實驗中都表現(xiàn)出較強的纖溶活性，2008年，周伏忠等[16]提取純化實驗室的兩種NK，分別作用于自然凝固的新鮮兔血，20 h后觀察到兩種NK的血塊溶解率分別達(dá)到77.38%和85.08%。2003年，SUZUKI[17]采用光化學(xué)法致 Sprague Dawley（SD）大鼠（五周大，雄性）內(nèi)皮損傷形成壁血栓，納豆提取物（NK）處理組血管壁血栓明顯溶解，大部分血栓從血管壁表面脫落，說明NK對由內(nèi)皮損傷引起的血栓具有良好的溶解效果。2019年，GUO等[18]采用肌肉注射舒泰的方式麻醉SD大鼠（n=8，雌雄各半），分離大鼠的右頸動脈，將浸漬過三氯化鐵（FeCl3）的濾紙條覆蓋于暴露的大腦中動脈誘導(dǎo)血栓形成，注射NK，使用激光多普勒流量計監(jiān)測血流量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK基本阻止了血栓的形成。2020年，WU等[19]選取6周大昆明小鼠（雄性，18~22 g）建立二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腎小球血栓模型，LPS觸發(fā)了氧化應(yīng)激導(dǎo)致丙二醛（MDA）水平的升高，口服NK明顯抑制了血清纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ（PAI-1）水平，打破了炎癥、氧化應(yīng)激和凝血之間的惡性循環(huán)，表明NK可以通過抗炎和抗氧化應(yīng)激防止血栓形成的加速，為NK抗血栓機制提供了一種新型的見解。2009年，HSIA等[20]進(jìn)行人體志愿者自身對照臨床試驗，將NK粗酶液凍干粉碎制成NK腸溶性膠囊（約200 mg/d），連續(xù)服用兩個月可顯著降低血清中幾種凝血因子的水平，包括纖維蛋白原、Ⅶ因子和Ⅷ因子。

以上的體內(nèi)外以及人體試驗都證明了NK具有溶栓功能，和其它臨床使用的抗血栓酶類物質(zhì)如尿激酶（Urokinase，UK）、鏈激酶（Streptokinase，SK）等相比，它表現(xiàn)出更強的溶栓效果，纖溶能力約是纖溶酶的4倍[21]，且成本較低、來源方便、無副作用、不容易引發(fā)出血等，能更好的改善血液流動，因此在預(yù)防和治療血栓類心腦血管疾病方面具有廣闊的發(fā)展前景，有望開發(fā)成抗血栓類藥物，投入臨床應(yīng)用[22?23]。

1.2.2 溶栓機理 目前臨床上治療血栓類疾病的酶類藥物主要有 UK、SK、組織纖溶酶原激活劑（Tissue plamnipen activator，t-PA）等，NK 的溶栓作用類似于此類溶栓藥物，目前比較成熟的NK溶栓機理有四種（圖1）：a.NK的直接溶栓作用最早是FUJITA等[24]發(fā)現(xiàn)的，將純化后的NK和交聯(lián)纖維蛋白發(fā)生酶解反應(yīng)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）觀察，在降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了 175、110、41、36、14.3 kDa等不同大小的片段，表明NK可以直接降解交聯(lián)纖維蛋白。b.NK激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生t-PA，t-PA促使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，達(dá)到溶栓效果[25]。SUMI等[26]進(jìn)行每天口服3次1.3 g NK腸溶膠囊人體志愿者試驗，從試驗對象的血液中提取并觀察血漿球蛋白的變化，結(jié)果表明，從口服NK的第一天開始，血液中的纖維蛋白降解產(chǎn)物就會顯著增加（P<0.05），還觀察到t-PA增加，印證了t-PA可以促進(jìn)血栓的溶解。c.NK刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生t-PA，將尿激酶原轉(zhuǎn)化為UK，UK和t-PA一起激活纖溶酶原從而溶解血栓[27]。d.NK可以溶解PAI-Ⅰ，解除對t-PA的抑制作用，從而促進(jìn)t-PA激活纖維蛋白酶溶解纖維蛋白，起到溶栓的效果。URANO等[28]將純化后的NK作用于重組原核PAI-1（Recombinant Prokaryotic PAI-1，rpPAI-1），用 SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析其蛋白水解作用，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）結(jié)合飛行時間（TOF）技術(shù)分別測定了完整和裂解形式的rpPAI-1的分子質(zhì)量，結(jié)果表明rpPAI-1被裂解成更小的片段，NK使rpPAI-1在靠近其反應(yīng)中心的位置裂解失活。

圖1 NK溶栓機理Fig.1 Thrombolytic mechanism of NK

1.3 NK酶活特性研究

影響NK穩(wěn)定性的因素有很多，主要有溫度、pH、金屬離子等。

1.3.1 溫度 一般來講，每種酶的酶活力都會有最適溫度，溫度降低酶活力會變小，溫度過高會導(dǎo)致酶變性或失活，這主要和酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。李睿等[29]從本實驗室發(fā)酵納豆菌株中純化得到NKII，結(jié)果顯示47~ 60 ℃是NK的最適溫度范圍，55 ℃是發(fā)揮酶活的最適溫度。DEVI等[30]表示45 ℃是本實驗選取NK發(fā)揮最高酶活的溫度，加熱到70 ℃時，NK的強纖維蛋白溶解活性消失。肖美燕等[31]對NK反復(fù)凍融8次, 酶活力達(dá)到78%以上，在?20 ℃下保存7 d，酶活力基本不變。以上實驗結(jié)果表明，雖然不同來源、不同蛋白結(jié)構(gòu)NK的最適溫度不一樣，但基本可以定論NK在低溫下穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)溫度越低酶活力損失越少，目前NK類產(chǎn)品的生產(chǎn)也主要是利用NK的這一特性，通過冷凍干燥的方式開發(fā)為凍干粉，進(jìn)而加工成各種形式的產(chǎn)品，使其可以在人體溫度37 ℃穩(wěn)定發(fā)揮作用。

1.3.2 pH pH會對酶活力產(chǎn)生影響，強酸強堿都會使酶變性或失活。中性和偏堿性環(huán)境下有利于NK酶活力的穩(wěn)定，但在pH5.0以下極易失活。楊亞楠等[32]將純化得到的NK和不同pH（3.0~11.0）的緩沖液混合，分別測定不同pH下的NK酶活力，結(jié)果表明該酶在此操作環(huán)境下的最適pH為7.0。王愛萍等[33]模擬人體胃液、腸液中的生理過程，對NK粗酶液和固體粉末2種狀態(tài)的樣品進(jìn)行纖溶活性研究，結(jié)果表明，粗酶液和固體粉末在人工胃液（pH1.8）處理5 h左右后, 活性分別下降了72%和65%,再用人工腸液處理5 h, 活性分別下降了11%和9%，說明2種狀態(tài)NK酶活力在人工胃液中大量損失，在人工腸液環(huán)境中較穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，NK在酸性和強堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，易失活，可以在中性或弱堿性條件下保存，保證NK酶活力的最大保留，為了避免NK類產(chǎn)品進(jìn)入消化道后受到胃酸的破壞作用, 可以將其制成腸溶性的產(chǎn)品服用。

1.3.3 金屬離子 不同金屬離子對酶活力的影響存在差異，根據(jù)對酶活力產(chǎn)生的效果可以分為激活劑和抑制劑。Mg2+、Ca2+、Na+對于NK有明顯的激活作用, Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+對 NK 的活性表現(xiàn)出不同程度的抑制，高濃度的K+對NK活性有抑制作用。MOU等[34]采用光譜法考察金屬離子對NK活性和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，化學(xué)計量比和高濃度的Cu2+、Co2+、Mn2+表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，化學(xué)計量比的Tb3+和Ca2+對NK活性沒有影響，而高濃度的Tb3+和Ca2+則表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。綜合以上實驗結(jié)果，Ca2+、Na+、Mg2+對NK酶活力有一定的促進(jìn)作用，同時是人體需要最多的金屬離子，可以將其加工成營養(yǎng)強化劑添加到NK類產(chǎn)品中，但要注意用量和非促進(jìn)作用的金屬離子攝入。

2 安全評價

NK在保健食品領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景，全面掌握NK的毒理安全性對于開發(fā)NK溶栓藥物、保健產(chǎn)品至關(guān)重要。根據(jù)我國《保健食品安全性毒理學(xué)評價規(guī)范》，原料需進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗和28 d經(jīng)口毒性試驗等毒理學(xué)評價研究。除了產(chǎn)品安全性評價，其生產(chǎn)菌的安全性也應(yīng)該得到重點關(guān)注，依據(jù)《以酶制劑等為原料的保健食品評審規(guī)定》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕100號），使用微生物發(fā)酵直接生產(chǎn)保健食品的，需要提供菌種的毒力試驗報告和菌種的安全性評價報告。

2.1 NK的安全性

2.1.1 急性毒性研究 根據(jù)急性毒性實驗要求，超過人類推薦100倍劑量無毒副反應(yīng)說明可安全食用。WU等[35]選擇六周大的昆明小鼠（18~22 g）進(jìn)行NK急性毒性實驗，每組20只，雌雄各半，以NK的最大濃度 6000 Fu/mL和最大量 40 mL/（kg·BW）灌胃，單日兩次給藥，對組織器官進(jìn)行肉眼觀察以及組織病理學(xué)評價，結(jié)果表明所有動物的體重都正常增加，未發(fā)現(xiàn)死亡或不良臨床體征或急性出血并發(fā)癥，未觀察到NK治療的毒性跡象，小鼠對NK的最大日耐受量高達(dá)480000 FU/kg。黃曉曼等[36]將酶活力為400 kU/kg的NK以最大濃度 10 kU/mL、最大給藥容量 40 mL/（kg·BW）一次灌胃給藥作用于NIH小鼠（18~22 g，雌雄各半），沒有發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)。盡管已有的動物實驗研究證明在一定濃度范圍內(nèi)飼喂NK不會產(chǎn)生急性毒性作用，仍然需要進(jìn)行大量體內(nèi)外實驗及人體流行病學(xué)調(diào)查來確保臨床應(yīng)用的安全性。

2.1.2 三項遺傳毒性實驗 2019年，WU等[35]進(jìn)行了NK的細(xì)菌反向突變（Ames）試驗、體外哺乳動物染色體畸變試驗和體內(nèi)哺乳動物微核試驗三項遺傳毒性試驗。在Ames試驗中，使用NK（EsseZymeTM）不同濃度（0、0.5、1.0、2.5 和 5.0 mg/板）對推薦菌株TA97、TA98、TA100和 TA102處理后，NK對被測菌株回復(fù)突變菌落數(shù)均無顯著影響，因此，NK對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株均無致突變性。以六周大的昆明小鼠（18~22 g，n＝10，雌雄各半）進(jìn)行體內(nèi)微核試驗，連續(xù)四天以其最大每日耐受劑量240000 FU/（kg·BW）給藥，NK 處理組幾乎未觀察到任何微核。在體外染色體畸變試驗中，在任何濃度的NK下，具有結(jié)構(gòu)和數(shù)字染色體畸變的CHL細(xì)胞數(shù)量均不超過所檢查細(xì)胞總數(shù)（每劑量水平200個細(xì)胞）的5%。本實驗所選用的NK（EsseZymeTM）在三項遺傳毒性試驗中均未檢測出遺傳毒性。

2.1.3 28 d經(jīng)口毒性研究 付玉生等[37]將規(guī)格為0.4 g/粒的NK膠囊設(shè)低、中、高三個劑量組, 即1.0、2.0、4.0 g/（kg·BW）摻入飼料中投喂 SD 大鼠，劑量分別為人體推薦量的25、50、100 倍，結(jié)果表明試驗期間動物的活動、攝食、排便等一般狀況未見明顯異常，對大鼠體重、進(jìn)食量和食物利用率、血液學(xué)檢查結(jié)果、血清生化檢驗結(jié)果、對臟器重量和臟器系數(shù)等的影響和對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義，各組動物剖檢后肉眼觀察各臟器顏色、形狀、大小等均未見明顯病變。FUJI等[38]選擇SD大鼠進(jìn)行28 d重復(fù)經(jīng)口毒性研究，結(jié)果表明，大鼠的臨床體征無明顯變化，體重和食物消耗基本相等，進(jìn)行肉眼檢查并確定器官重量，準(zhǔn)備選定的器官和組織以進(jìn)行組織病理學(xué)研究，最終確定未觀察到有害作用水平（No observed adverse effect level，NOAEL）為每天 167 mg/（kg·BW）。

2.1.4 90 d經(jīng)口毒性研究 BOZO等[38]通過管飼法分別以 0、100、300 和 1000 mg/（kg·BW）的劑量施用于SD大鼠（每組12只，雌雄各半）90 d，每天進(jìn)行臨床體征的檢查，最終未發(fā)現(xiàn)異常，這項研究的NOAEL 為每天 1000 mg/（kg·BW），這是目前 NK 90 d經(jīng)口毒性試驗NOAEL的最高劑量。LAMPE等[39]使用NK產(chǎn)品NSK-SD（日本生物科學(xué)實驗室有限公司，日本，20000 FU/g）對SD大鼠進(jìn)行的28 d經(jīng)口和 90 d經(jīng)口毒性研究，管飼劑量分別為167 mg/（kg·d）和 1000 mg/（kg·d），臨床及組織學(xué)病理研究都未觀察到不良反應(yīng)。

2.1.5 消化和吸收 NK作為一種具有溶栓功能的營養(yǎng)物質(zhì)，其健康保健功效備受關(guān)注，雖然已有諸多動物[40]以及人體實驗[41]證明口服NK后可以在腸胃道內(nèi)檢測到不同分子量的片段，但其在腸胃道內(nèi)具體是以何形式被吸收來發(fā)揮治療和預(yù)防作用鮮有研究。喬斌[42]通過在體外構(gòu)建胃部與小腸模擬消化模型，復(fù)原人體的消化道環(huán)境，結(jié)果同王愛萍的實驗結(jié)果一致，NK作為堿性蛋白質(zhì)，對胃酸幾乎沒有耐受性，而在腸道環(huán)境下，NK可以很好的保持其自身空間結(jié)果；使用人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2構(gòu)建體外小腸上皮細(xì)胞吸收模型，結(jié)果表明，NK只有達(dá)到一定濃度才可以以完整的蛋白質(zhì)分子穿越小腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步證實了NK可以開發(fā)成口服性腸溶膠囊產(chǎn)品。目前關(guān)于NK代謝的研究甚少，關(guān)于NK在人體內(nèi)的代謝途徑及其機制研究是未來NK開發(fā)成保健食品或者溶栓藥品的熱點方向。

2.2 生產(chǎn)菌及其代謝產(chǎn)物的安全性

NK是由納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類過程中產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，納豆芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌亞種，發(fā)酵菌株的安全性、有害代謝產(chǎn)物、雜菌污染等因素直接影響其安全性，因此明確生產(chǎn)菌及其代謝產(chǎn)物的安全性至關(guān)重要。

2.2.1 致病性 致病性也稱為毒力，是指微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。YANAGISAWA等[43]將Meguro研究所（日本）提供的產(chǎn)品中提取到的納豆枯草芽孢桿菌以 50 mg/（kg·BW）和 200 mg/（kg·BW）注射于雄性 Wistar大鼠（8~9 周齡，250~300 g），結(jié)果表明其身體健康指標(biāo)沒有明顯變化（不攝入、攝入50 mg/kg、攝入200 mg/kg納豆芽孢桿菌的優(yōu)球蛋白溶解時間分別為(430±18)、(380±23)、(268±21) min）。HONG 等[44]對新西蘭白兔（3個月，雄性）灌胃1 mL純化的納豆菌孢子懸浮液（1×109/mL），進(jìn)行 30 d重復(fù)毒性試驗，管飼 Dunkin Harley豚鼠（五周大，雌雄各半）納豆菌孢子懸浮液（1×1012/mL）進(jìn)行14 d的毒性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在試驗期間沒有死亡報告，也沒有觀察到生命體征或體重有任何明顯的變化，未觀察到所選內(nèi)臟器官和組織的變化，對照組和實驗組血液學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 耐藥性 抗生素濫用使得生物體內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性甚至超級細(xì)菌，枯草芽孢桿菌可以抑制沙門氏菌、傷寒菌和痢疾菌等致病菌，在飼料行業(yè)作為益生菌取代抗生素發(fā)揮作用。但在食品行業(yè)，如果其存在可轉(zhuǎn)移耐藥基因，則有可能引起人體腸道細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。曾祥燕等[45]從納豆中篩選到四株納豆芽孢桿菌，采用藥敏紙片法測定其對阿散酸、土霉素、抗敵素等抗生素的耐受性，結(jié)果表明，四株菌株對這幾類抗生素都表現(xiàn)出不敏感。董超等[46]在納豆芽孢桿菌生長旺盛期加入常用的抗生素類藥物，觀察所引起的反應(yīng)即耐藥性的大小，結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌對酒石酸泰樂菌素、青霉素鉀、阿莫西林最為敏感，建議在使用阿莫西林等藥物時不要進(jìn)食含納豆菌的產(chǎn)品。因為抗生素種類繁多，目前納豆芽孢桿菌耐藥性效果多采用表型檢測，缺乏耐藥基因研究，納豆菌與抗生素的相互作用效果以及食用過程中是否會產(chǎn)生耐藥性基因的轉(zhuǎn)移還需更深入細(xì)致的研究。

2.2.3 生物胺 近幾年有關(guān)生物胺的研究表明，在納豆發(fā)酵過程中會有生物胺類物質(zhì)代謝產(chǎn)生，不但影響著產(chǎn)品的風(fēng)味，還會帶來潛在的食品安全隱患，過量攝入會引發(fā)頭痛、惡心等一系列中毒癥狀[47]，因此控制和制定發(fā)酵納豆攝入水平至關(guān)重要。高澤鑫等[48]分離到一株高產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌GULR06，利用高效液相色譜法對發(fā)酵過程中的生物胺進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亞精胺、組胺都能得到很好的分離，生物胺總量范圍在26.47~72.97 mg/kg之間，在人體可接受范圍內(nèi)。目前未有納豆芽孢桿菌生物胺的代謝對人體產(chǎn)生危害的報道，工業(yè)上可以通過菌種篩選或組合發(fā)酵[49]來控制納豆過程中生物胺的代謝產(chǎn)生。

3 結(jié)語與展望

老齡化已經(jīng)成為我國一個極為嚴(yán)峻的社會問題，以心血管疾病為主的老年群體常見疾病大幅增加，據(jù)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2016年中國有近1億心血管病患者，1990~2016年，死于心腦血管病的人數(shù)從251萬增至397萬。雖然國家對于心血管疾病的投入力度加大、醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步，心血管疾病負(fù)擔(dān)顯著下降，但醫(yī)療福利覆蓋不全面，地區(qū)治療費用差異較高，老年病治愈率低，持續(xù)時間長。目前全球公眾衛(wèi)生安全面臨著新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的威脅，現(xiàn)有研究表明，COVID-19病毒侵襲機體后，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞致其損傷并誘導(dǎo)血管內(nèi)彌漫性凝血，導(dǎo)致機體凝血功能紊亂[50?51]，老年人及有基礎(chǔ)疾病者感染后病情較重。因此，提高NK酶活力和穩(wěn)定性，開發(fā)以NK為核心的保健食品，擴大其臨床和商業(yè)的應(yīng)用符合《國民營養(yǎng)計劃（2017-2030）》“老年人群營養(yǎng)支持行動”和《中國防治慢性病中長期規(guī)劃（2017-2025年）》，將為改善老年人營養(yǎng)狀況、提高老年人群的整體健康水平提供重要的政策支撐和保障。

我國NK的質(zhì)量評價主要依賴于酶活力高低的測定，評價指標(biāo)過于單一。為使產(chǎn)品適用人體服用環(huán)境，高效長久保存，研究其在不同溫度、pH等影響因素下的穩(wěn)定性，為完善NK質(zhì)量評價方法提供理論基礎(chǔ)，更好的服務(wù)于NK類保健食品及溶栓藥品的開發(fā)。在我國納豆制品類標(biāo)準(zhǔn)《DBS 44/013-2019 廣東省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 納豆粉》和《SB/T 10528-2009 中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 納豆》中，缺乏NK質(zhì)量與安全評價的相關(guān)要求，因此需要盡快完善NK的統(tǒng)一行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，保證NK產(chǎn)品的質(zhì)量安全，有利于我國以NK開發(fā)保健食品行業(yè)的健康長遠(yuǎn)發(fā)展。