王 綺，李永玉*，彭彥昆，韓東海，劉亞超

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院 國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心 北京100083 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

活菌飲料具有大量活性乳酸菌，其具有改善腸胃環(huán)境，促進腸道吸收，促進腸道蠕動，并且在腸道中制造人體所需的維生素，緩解腹瀉等一系列優(yōu)點，在飲品行業(yè)逐漸占據(jù)廣泛的市場[1-4]。乳酸活菌數(shù)是活菌飲料的重要指標。國家標準GB 7101-2015《食品安全國家標準 飲料》中明確規(guī)定活菌飲料中活菌數(shù)要大于10-6CFU/mL。

國內(nèi)外乳酸菌的檢測方法主要分為傳統(tǒng)檢測方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)方法為平板計數(shù)法，分子生物學(xué)方法主要為流式細胞儀法、熒光PCR、阻抗法和TEMPO/TVC 法等。這些檢測方法操作復(fù)雜費時，所需儀器比較昂貴，而且需要有專業(yè)知識的人員操作，還需進行專業(yè)培訓(xùn)，不能滿足現(xiàn)場快速、實時在線檢測需求[5-6]。光譜具有快速、無損、高效等特點，在食品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)中廣泛應(yīng)用，如在乳及乳制品中的應(yīng)用也十分廣泛[7-9]。岳田利等[10]利用傅里葉變換近紅外光譜進行菌落鑒定時，能夠定性判別6 種微生物，準確率達100%。趙文靜等[11]利用高光譜檢測冷藏原料乳的細菌總數(shù)，經(jīng)平滑預(yù)處理與降維后，最優(yōu)模型為Rc、Rp分別為0.9195 和0.8214。馬世榜等[12]利用近紅外光譜預(yù)測牛肉的菌落總數(shù)，進而預(yù)測生鮮牛肉的儲存期。馮東等[13]利用紫外吸收光譜檢測酸奶中維生素A 的含量，其平均值的標準偏差為0.32。Pereira 等[14]用近紅外光譜測量污染的和不含沙門氏菌的脫脂與全脂牛奶樣品，用偏最小二乘法進行判別分析，脫脂乳樣品判別模型的RMSEC 為0.1639，RMSEP 為0.0971，而全脂乳判別模型RMSEC 為0.1351，RMSEP 為0.0928。利用近紅外光譜可以鑒別牛奶中的沙門氏菌。Triana 等[15]利用原子吸收光譜法和紫外-可見分光光度法分析法測定了27 份市售山羊奶發(fā)酵產(chǎn)品、牛奶發(fā)酵樣品以及9 份添加益生菌菌株發(fā)酵乳桿菌D3 的山羊奶發(fā)酵產(chǎn)品樣品中鈣、鎂、磷、鋅的含量。雖然利用光譜檢測菌落總數(shù)等的研究不少，但是在乳酸菌的定量分析方面未見報道?；罹嬃现腥樗峋罹鷶?shù)是重要品質(zhì)指標，在生產(chǎn)、銷售、流通過程中乳酸菌活菌數(shù)的無損快速監(jiān)測具有重要意義。

本文以市售活性飲料為研究對象，基于近紅外光譜與紫外吸收光譜進行活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的快速定量檢測。探討不同乳酸菌活菌數(shù)飲料樣品的傅里葉變換近紅外光譜和紫外吸收光譜的吸收峰及其乳酸菌的相關(guān)性，確定最合適的光譜預(yù)處理方法，建立市售活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的定量預(yù)測模型，并對所建立的最優(yōu)定量模型進行外部驗證，旨在利用光學(xué)的方法實現(xiàn)乳酸菌活菌數(shù)的快速定量檢測，為各類食品中乳酸菌定量檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

剛上市活菌飲料共145 個樣品，購買于北京物美超市。菌種為干酪乳桿菌，活菌含量≥1×108CFU/mL，放置在4 ℃條件下儲存。

AntarisTMII FT-NIR 傅里葉近紅外分析儀【光譜范圍為10 000～4 000 cm-1（1 000～2 500 nm），掃描次數(shù)為5 次/s】，賽默飛世爾科技公司；UV759s 型紫外-可見分光光度計【光譜范圍190～1 100 nm，帶寬1 nm】，上海精密儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 活菌飲料光譜采集

1）近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集 預(yù)熱30 min，采用透反射的方式進行光譜采集。145 個樣品每隔2 d 隨機選取3 個樣品，每次用移液槍吸取190 μL 的樣品原液放在1 mm 深的樣品池內(nèi)，光譜掃描次數(shù)為32 次，儀器分辨率為4 cm-1，每個樣品采集3 次光譜，取平均光譜為最后進行建模分析的光譜，每條光譜共計1 557 個變量。參數(shù)增益，以空氣為參考對儀器檢測條件進行優(yōu)化。

2）紫外吸收光譜數(shù)據(jù)的采集 利用紫外-可見分光光度計對樣品采集紫外吸收光譜，用生理鹽水將樣品稀釋到10-3梯度，取3.5 mL 稀釋樣品放入厚度為1 cm 的比色皿中進行采集。光譜數(shù)據(jù)采集范圍為190～500 nm，紫外-可見分光光度計提前預(yù)熱30 min，采集樣品前用生理鹽水作為校準的溶液進行基線校準。

1.2.2 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)標準值的測定根據(jù)GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》中的平板計數(shù)法測定樣品中乳酸菌活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)標準理化值測定結(jié)果

145 個活菌飲料樣品每次選取3 個樣品每隔2 d 分別采集近紅外和紫外光譜，同時利用平板計數(shù)法進行了乳酸菌活菌數(shù)標準值的測定?；罹嬃现腥樗峋罹鷶?shù)隨著儲存時間的延長而減少。將145 個不同儲藏期的樣品根據(jù)馬氏距離按3∶1的比例分為校正集與驗證集，本次試驗中樣品乳酸菌數(shù)采用菌落數(shù)對數(shù)值進行表示（見表1）。

表1 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果Table 1 The statistical results of the number of live Lactobacillus in live bacteria beverage

2.2 活菌飲料傅里葉變換近紅外光譜預(yù)處理及分析

利用傅里葉近紅外分析儀采集的145 個活菌飲料樣品近紅外原始光譜曲線如圖1a所示。蛋白質(zhì)是乳酸菌細胞結(jié)構(gòu)的組成成分，而且活菌飲料在長期保存過程中蛋白質(zhì)與碳水化合物為乳酸菌提供營養(yǎng)物質(zhì)。蛋白質(zhì)被乳酸菌的蛋白酶水解成多肽，并進一步被肽酶分解成氨基酸[16]，采集的近紅外光譜在4 900～5 204 cm-1范圍出現(xiàn)有關(guān)蛋白質(zhì)的吸收峰[17]。同時6 838 cm-1和4 022 cm-1附近出現(xiàn)了脂肪酸和糖類C-H 伸縮振動組合頻[18]引起的吸收峰。另外，活菌飲料中主要成分為水，在6 901 cm-1附近出現(xiàn)水的吸收峰，其中6 838 cm-1處和6 901 cm-1處吸收峰非常接近，采集的光譜中2 個特征峰被合并為一個吸收峰。為了消除隨機噪聲、儀器誤差等對樣品的影響，需要對原始光譜進行預(yù)處理。多元散射校正（MSC）預(yù)處理后光譜曲線如圖1b所示，MSC 預(yù)處理方法主要是對光譜的散射進行校正[19]，使得4 900 cm-1和4 022 cm-1附近的特征峰呈現(xiàn)更好的規(guī)律性。SG 平滑與一階求導(dǎo)（FD）的預(yù)處理光譜曲線如圖1c所示，F(xiàn)D 預(yù)處理獲得了原始光譜的形態(tài)變換信息[20]，然而并沒有將樣品之間的差異變得更加明顯，反而使得不同樣品間相關(guān)吸收峰差異變小。經(jīng)正交信號校正（OSC）預(yù)處理之后光譜曲線如圖1d所示，OSC預(yù)處理后光譜3 個主要特征峰樣品間差異更加明顯，而且保留了全波段的光譜信息。

圖1 活菌飲料傅里葉變換近紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform near infrared spectrum of living bacteria beverage

2.3 活菌飲料紫外吸收光譜預(yù)處理及分析

不同乳酸菌數(shù)的145 個樣品的紫外吸收原始光譜如圖2a所示。隨著存儲時間的增加，活菌飲料中的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，酸度逐漸增加，乳酸菌數(shù)逐漸減小。所有樣品在波長206 nm 附近出現(xiàn)了明顯的吸收峰，發(fā)現(xiàn)峰值吸光度隨樣品儲存時間的增加而逐漸降低。研究表明，羧基（-COOH）在波長204 nm 附近有吸收峰[21]，由于溶劑的不同會產(chǎn)生一定的偏移，采集的活菌飲料紫外吸收光譜在波長206 nm 處出現(xiàn)了羧基吸收峰。分別對原始吸收光譜進行MSC、SG+FD 與OSC 預(yù)處理，結(jié)果如圖2b～d所示。因活菌飲料樣品中存在一些顆粒物，MSC 預(yù)處理可以有效消除散射影響，增強了與成分含量相關(guān)的光譜吸收信息。與OSC 預(yù)處理光譜相比，MSC 預(yù)處理校正了基線平移和偏移使其更加緊湊，但是仍有效保留了波長206 nm 處樣品間特征吸收峰差異。SG 平滑與FD 預(yù)處理雖使光譜中波長206 nm 處的特征峰更加明顯，但同時擴大了波長225 nm 處與特征峰無關(guān)的光譜信息，影響建模效果。

圖2 活菌飲料紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of living bacteria beverage

2.4 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)定量預(yù)測模型的建立

采集145 個飲料樣品的傅里葉變換近紅外光譜和紫外吸收光譜，并分別進行了MSC、SG+FD和OSC 預(yù)處理，其中95 個樣品作為校正集50 個樣品作為驗證集，分別進行了偏最小二乘（PLS）回歸分析[22]。

基于傅里葉變換近紅外光譜的不同預(yù)處理后的活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)PLS 建模結(jié)果如表2所示。原始光譜以及MSC、SG+FD 和OSC 預(yù)處理后的乳酸菌活菌數(shù)PLS 定量預(yù)測模型均有較好的預(yù)測效果。其中OSC 預(yù)處理后的乳酸菌活菌數(shù)PLS 定量預(yù)測模型最優(yōu)，可能因為OSC 預(yù)處理方式能夠去掉與樣品無關(guān)的信息，減小光譜由于外界因素所產(chǎn)生的誤差[23]，使3 個主要特征峰樣品間差異更加明顯，提高光譜峰值與理化標準值的相關(guān)性。采用OSC 預(yù)處理最優(yōu)模型校正集與驗證集的相關(guān)系數(shù)分別為0.9878 與0.9565，均方根誤差為0.0454 與0.0832。

表2 活菌飲料傅里葉變換近紅外光譜的建模結(jié)果Table 2 Modeling results of Fourier transform near infrared spectrum of living bacteria beverage

基于紫外吸收光譜的活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)PLS 模型分析結(jié)果如表3所示。紫外吸收原始光譜的乳酸菌活菌數(shù)PLS 定量預(yù)測模型結(jié)果相比傅里葉近紅外光譜模型結(jié)果不太理想，然而MSC預(yù)處理后消除了樣品光譜中粒子散射的影響，校正了基線的平移和偏移，使得模型的預(yù)測結(jié)果有了顯著的提升。采用MSC 預(yù)處理最優(yōu)模型校正集與驗證集相關(guān)系數(shù)分別為0.8705 與0.8229，均方根誤差為0.1489 和0.1600。

表3 活菌飲料紫外吸收光譜的建模結(jié)果Table 3 Modeling results of ultraviolet absorption spectrum of living bacteria beverage

基于傅里葉變換近紅外光譜和紫外吸收光譜的活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)定量預(yù)測最優(yōu)模型結(jié)果分別如圖3所示?；罹嬃现腥樗峋罹鷶?shù)傅里葉變換近紅外光譜定量預(yù)測模型結(jié)果明顯優(yōu)于紫外吸收光譜的預(yù)測模型。這是因為近紅外光譜范圍更廣，所含乳酸菌活菌數(shù)的相關(guān)信息比較豐富，能夠較好的與活菌數(shù)之間建立相關(guān)性，說明可以基于傅里葉變換近紅外光譜對乳酸菌活菌數(shù)進行快速檢測。

圖3 2 種光譜模型的最優(yōu)結(jié)果散點圖Fig.3 The optimal result scatter diagram of two spectral models

2.5 傅里葉變換近紅外模型的優(yōu)化

為進一步優(yōu)化所建模型，本研究利用競爭自適應(yīng)重加權(quán)法（CARS）[24-25]對OSC 預(yù)處理之后的傅里葉變換近紅外光譜進行特征波長的篩選，CARS 算法中隨著MC 采樣次數(shù)的增加，變量個數(shù)、交叉驗證均方根誤差RMSECV 與每個變量回歸系數(shù)的變化如圖4所示。由圖4a 可知，由于指數(shù)衰減函數(shù)EDF 的作用，前19 次MC 采樣中變量個數(shù)減小速度非?？欤?9 次之后變量個數(shù)減小速度變得緩慢。RMSECV 隨著MC呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢（圖4b），這是因為隨著MC 的增加，RMSECV 逐漸減小，大量與乳酸菌活菌數(shù)無關(guān)的信息或者部分共線的信息被剔除，但是隨著MC 的繼續(xù)增加，RMSECV 開始變大，這是由于光譜中一些與乳酸菌活菌數(shù)有關(guān)的信息被提出，導(dǎo)致預(yù)測測性能變差。RMSECV最小為0.0441，此時蒙特卡洛運行次數(shù)為19 次，共篩選出135 個變量為與活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)有關(guān)的特征波長。

圖4 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)特征波長提取圖Fig.4 Characteristic wavelength extraction of lactic acid bacteria in live bacteria beverage

利用CARS 算法篩選的135 個特征波長建立乳酸菌活菌數(shù)PLS 預(yù)測模型，其校正集與驗證集的散點圖如圖5所示。經(jīng)特征波長篩選后，模型的校正集與驗證集的相關(guān)系數(shù)為0.9974 和0.9837，均方根誤差分別為0.0211，0.0508。結(jié)果顯示，CARS 算法可有效剔除乳酸菌活菌數(shù)無關(guān)的信息或者部分共線的信息，預(yù)測模型效果優(yōu)于全波段建模結(jié)果，提高模型的精度與穩(wěn)定性，減小運算量。

圖5 優(yōu)化后活菌飲料的模型結(jié)果散點圖Fig.5 The scatter diagram of the model results of the optimized live bacteria beverage

2.6 活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)預(yù)測模型外部驗證

基于2.5 節(jié)所建的活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的傅里葉變換近紅外光譜預(yù)測模型，預(yù)測了與建模樣品無關(guān)的9 個市售活菌飲料樣品的乳酸菌活菌數(shù)，同時利用國標法檢測9 個樣品的乳酸菌活菌數(shù)的標準值，并進行了相關(guān)性分析?；罹嬃现腥樗峋罹鷶?shù)的預(yù)測值與標準理化值相關(guān)系數(shù)為0.9068，誤差（SEP）為0.0108（圖6），說明活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的傅里葉變換近紅外光譜預(yù)測模型可以對活菌飲料中的乳酸菌活菌數(shù)快速定量檢測。

圖6 模型外部驗證結(jié)果Fig.6 External model validation results

3 結(jié)論

本文以市售活性飲料為研究對象，分別基于近紅外光譜與紫外吸收光譜進行了活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的快速定量檢測研究。將145 個活菌飲料樣品的原始光譜分別進行MSC、OSC 與SG結(jié)合FD 預(yù)處理，再利用PLS 方法進行乳酸菌活菌數(shù)的建模分析。根據(jù)結(jié)果可以得出采用傅里葉變換近紅外光譜建立的模型整體優(yōu)于紫外吸收光譜所建立的模型，其中傅里葉變換近紅外光譜經(jīng)OSC 預(yù)處理方法建立的PLS 模型對于乳酸菌活菌數(shù)的預(yù)測效果最好，Rc和RMSEC 分別為0.9878，0.0454，Rp與RMSEP 分別是0.9565，0.0832。針對活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的最佳預(yù)處理光譜結(jié)合CARS 算法進行波長的篩選，獲取了135 個預(yù)測乳酸菌數(shù)的關(guān)鍵變量，有效剔除了光譜中與乳酸菌活菌數(shù)無關(guān)的信息變量，顯著提高了預(yù)測模型的精度，Rc與Rp為0.9974，0.9837，RMSEC 與RMSEP 分別為0.0211，0.0508。最后，利用市售未參與建模的9 個樣品對傅里葉近紅外預(yù)測模型進行外部驗證，均方根誤差為0.0108。結(jié)果表明，利用傅里葉變換近紅外光譜能夠快速準確的預(yù)測活菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)的數(shù)量，為活菌飲料的品質(zhì)檢測具有重要意義。