張寶會, 王晨桐, 郭 淼, 肖 華

(微生物代謝國家重點實驗室, 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 上海 200240)

在生命活動的調(diào)解中,蛋白質(zhì)通過改變自身的豐度、定位、降解和翻譯后修飾(PTM)來實現(xiàn)催化、免疫和細(xì)胞增殖等各項功能[1]。磷酸化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式[2],在特定時間內(nèi),超過30%的蛋白質(zhì)會發(fā)生磷酸化或以磷酸化形式呈現(xiàn)[3]。固定化金屬離子親和色譜(IMAC)是一種高效的磷酸化肽段富集技術(shù)[4],金屬離子(如Ti4+、Fe3+和Ga3+)[5,6]通過螯合固定在基質(zhì)上,在酸性條件下吸附磷酸化肽段,并在堿性條件下洗脫[7]。該方法具有很高的特異性,能夠富集不同氨基酸位點上的磷酸基團。新型鈦離子螯合IMAC材料(Ti4+-IMAC)具有高選擇性和高穩(wěn)定性[8]。通過使用Ti4+-IMAC材料,Giansanti等[9]從Jurkat T細(xì)胞中分離鑒定到了30 000多種特征磷酸化肽段。

蛋白質(zhì)的磷酸化會影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等特性[10],而癌癥的轉(zhuǎn)移又是癌癥進展和惡化的主要表現(xiàn)。在臨床上,癌癥通常會在中晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移,影響原發(fā)灶以外的其他臟器,給治療和預(yù)后帶來極大挑戰(zhàn)。以肺癌為例,其常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、大腦、骨骼和淋巴等,而相應(yīng)的生物學(xué)機制尚不十分清楚[11]。因此,比較不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組有助于研究蛋白質(zhì)磷酸化在癌癥轉(zhuǎn)移和進展中的作用。

人低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95C和人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95D是通過單細(xì)胞克隆技術(shù)從人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系(PLA-801)中分離得到的4個亞系(A、C、D、E株)中的兩株。皮下接種裸鼠后,D株(95D)自發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高,A、E株中等,而C株(95C)較低,95D和95C是研究腫瘤轉(zhuǎn)移和非小細(xì)胞肺癌的理想模型。MRC5是貼壁、梭型、成纖維肺細(xì)胞,從14周胎兒正常肺組織中獲得。研究這些正常肺細(xì)胞和不同轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組,將有助于發(fā)現(xiàn)與肺癌轉(zhuǎn)移進展相關(guān)的關(guān)鍵通路和調(diào)控蛋白[11]。

本文在現(xiàn)有Ti4+-IMAC方法的基礎(chǔ)上,比較兩種尺寸(10 μm和30 μm)Ti4+-IMAC在磷酸肽富集中的差異,并對比了10 μm Ti4+-IMAC通過振蕩法和固相萃取法(SPE)富集磷酸化肽的效果,采用優(yōu)化的策略研究了3種轉(zhuǎn)移能力不同的肺細(xì)胞系(MRC5、95C和95D),通過對不同轉(zhuǎn)移能力肺細(xì)胞的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行比較分析,對差異蛋白質(zhì)進行生信分析,揭示了差異表達(dá)的磷酸化位點和磷酸化肽段,從而發(fā)掘肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升液相色譜(Easy-nLC1000)和軌道離子阱質(zhì)譜儀(LTQ-Orbitrap XL)購于賽默飛公司(美國)。電熱鼓風(fēng)干燥箱購于上海恒科學(xué)儀器有限公司(中國),超聲波清洗器購于昆山市超聲波儀器有限公司(中國), 5424離心機和離心濃縮儀購于艾本德公司(美國),多功能酶標(biāo)儀購于GE公司(美國)。

蛋白質(zhì)酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于羅氏公司(瑞士), Ti4+-IMAC(～10 μm)和Ti4+-IMAC(～30 μm)購于百靈威科技有限公司(中國),蛋白質(zhì)濃度測定(BCA)試劑盒購于賽默飛公司(美國), MEM基本培養(yǎng)基和RPMI1640基本培養(yǎng)基購于Gibco公司(美國)。

1.2 模式磷酸化肽段樣本的制備

對牛血清白蛋白(BSA)和α-酪蛋白(α-casein)分別進行酶解,并按照質(zhì)量比200∶1的比例混合,制備模式磷酸化肽段樣本。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解

MRC5使用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),95C和95D細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(10%胎牛血清,1×青霉素/鏈霉素溶液)。所有細(xì)胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長到對數(shù)生長期后期傳代,胰酶37 ℃消化數(shù)分鐘,傳代密度控制在細(xì)胞增殖最快的狀態(tài)。取長勢良好的細(xì)胞,300×g下離心5 min,棄上清,收集細(xì)胞沉淀,用含6 mol/L尿素的碳酸氫銨溶液裂解細(xì)胞,棄上層脂質(zhì)部分,向澄清的細(xì)胞樣本中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,得到細(xì)胞蛋白質(zhì)樣本。參照BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明書測定細(xì)胞蛋白樣本的濃度。取適當(dāng)質(zhì)量的蛋白質(zhì)溶液,加入終濃度2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT), 60 ℃水浴1 h,加入10 mmol/L碘乙酰胺(IAA),室溫避光反應(yīng)40 min。按照常規(guī)FASP(filter-aided sample preparation)方法進行蛋白酶解(胰酶與樣品蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶50)。

1.4 磷酸化肽段的富集

將30 μm的大尺寸Ti4+-IMAC標(biāo)記為Ti4+-IMAC-L,將10 μm的小尺寸Ti4+-IMAC標(biāo)記為Ti4+-IMAC-S,按照Ti4+-IMAC說明書將Ti4+螯合在IMAC上,并配制以下溶液:上樣緩沖液(80%(v/v,下同)乙腈,6%三氟乙酸)、洗滌緩沖液1(50%乙腈,6%三氟乙酸,200 mmol/L氯化鈉)、洗滌緩沖液2(30%乙腈,0.1%三氟乙酸)、洗脫緩沖液1(10%氨水)和洗脫緩沖液2(1%甲酸)。

振蕩法富集磷酸化肽段方法:將凍干后的肽段樣品重溶于1倍體積的上樣緩沖液至終濃度為1 mg/mL,將肽段溶液與Ti4+-IMAC混合(材料與肽段質(zhì)量比為25∶1)振蕩30 min, 15 000×g離心去上清。加入1倍體積的洗滌緩沖液1,振蕩30 min,離心棄上清,再加入1倍體積的洗滌緩沖液2洗滌兩次(混合振蕩15 min并離心棄上清),將鹽離子充分洗去。加入150 μL洗脫緩沖液1超聲15 min,再振蕩15 min,離心收集洗脫液,再向材料中加入150 μL洗脫緩沖液1振蕩15 min,離心收集第二次的洗脫液,將兩份洗脫液合并,18 000×g離心5 min,充分去除材料沉淀,真空干燥。

SPE法富集磷酸化肽段[12]:參考文獻[12]制作SPE柱,肽段溶液與Ti4+-IMAC質(zhì)量比為1∶20,加入緩沖液的體積使肽段濃度保持在1 mg/mL左右。用適當(dāng)轉(zhuǎn)速離心,使液體全部流下時間約為10 min。加入200 μL洗滌緩沖液1,用相同轉(zhuǎn)速離心至液體全部流下并重復(fù)洗滌一次,再用洗滌緩沖液2以同樣方法洗滌兩次。更換收集管,加入200 μL洗脫緩沖液洗滌1兩次,再用100 μL洗脫緩沖液2洗脫兩次。將濾出液真空干燥。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜分析

取細(xì)胞總蛋白質(zhì)酶解后的肽段,通過ZipTipC18除鹽。取2 μg除鹽后的肽段上樣進行基于液相色譜-質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分析,每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。

取500 μg各細(xì)胞總蛋白質(zhì)酶解后的肽段,采用Ti4+-IMAC富集磷酸化肽段,除鹽后上樣,進行基于液相色譜-質(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)組分析,每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。

液相色譜-質(zhì)譜的相關(guān)參數(shù)如下:C18反相柱(15 cm×75 μm, 3 μm, Thermo Fisher Scientific),離子源為電噴霧(ESI),質(zhì)譜電噴霧毛細(xì)管電壓1 900 V,氣體流速2.0 L/min,離子源溫度為120 ℃,選擇質(zhì)核比為350～2 000的母離子進行CID(collision-induced dissociation)二級碎裂掃描,碰撞能量為20～70 eV,動態(tài)排除0.25 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Proteome Discoverer(PD,版本1.3)搜庫:Homo sapiens數(shù)據(jù)庫(版本2017_11_28, 20 244條序列),胰酶消化,母離子質(zhì)量誤差值為15 ppm(15×10-6),漏切位點最大值設(shè)置為2;蛋白質(zhì)和肽段鑒定假陽性率(FDR)小于1%,蛋白質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)為至少檢測到兩個特征肽段。

MaxQuant(版本1.6.7.0)搜庫:數(shù)據(jù)庫、消化酶、漏切位點最大值、固定修飾、可變修飾等參數(shù)與PD搜庫的設(shè)置相同。母離子質(zhì)量誤差值設(shè)置為20 ppm(20×10-6),主要搜索肽段誤差值為4.5 ppm(4.5×10-6)。蛋白質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)為至少檢測到兩個特征肽段,且肽段長度大于或等于7個氨基酸,設(shè)置蛋白質(zhì)及二級譜圖數(shù)量(peptide-spectrum matches, PSM)的假陽性率為0.01。用Perseus軟件進行數(shù)據(jù)分析[13],篩選肽段及位點等,篩選出符合要求的總蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)、總肽段和磷酸化肽段以及磷酸化位點(位置可能性>0.75)。

免標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析以四分位法對iBAQ(intensity-based absolute quantification)值進行歸一化。針對磷酸化位點的定量分析,我們首先以在一組中至少有兩個以上強度值不為零的標(biāo)準(zhǔn)篩選磷酸化位點,用t-test檢驗法計算p值。然后,篩選有顯著差異的(p-value<0.05)磷酸化位點,并計算它們的上下調(diào)倍數(shù)(fold change, FC)。若FC≥1.5或≤0.66且p-value<0.05,即為顯著上調(diào)或下調(diào)的磷酸化位點。

對蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行生物學(xué)分析,利用GO(Gene Ontology)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析等探索蛋白質(zhì)功能。對定量數(shù)據(jù)進行IPA(Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen)途徑分析,包括經(jīng)典通路、疾病和生物學(xué)功能分析等,并對磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組進行比較分析。

表 1 Ti4+-IMAC-S通過SPE和振蕩法富集磷酸化肽段的特異性

表 2 Ti4+-IMAC-S和Ti4+-IMAC-L富集95C細(xì)胞磷酸化肽段的特異性

2 結(jié)果與討論

2.1 Ti4+-IMAC-S通過SPE和振蕩法富集模式磷酸化肽段的特異性比較

為優(yōu)化富集方法,采用模式磷酸化肽段比較了SPE[8]和振蕩法對Ti4+-IMAC-S富集效果的影響。分別選取200 μg和400 μg為肽段的富集起始量,在相同條件下酶解模式磷酸化肽段。然后利用SPE和振蕩法對相同起始量的肽段進行磷酸化肽的富集,PD的搜庫結(jié)果表明,與SPE相比,振蕩法可以富集到更多的磷酸化肽段(見表1)。

在富集效率方面,振蕩法和SPE相差不大。SPE可用于樣品量較大的研究[12]。同時發(fā)現(xiàn),樣品起始用量越大,所檢測到的磷酸化肽段數(shù)就越多。在起始蛋白質(zhì)用量為200 μg和400 μg的條件下,振蕩法中材料與肽段的振蕩混合時間為30 min,接觸時間較長,磷酸化肽段被材料吸附的概率增大,因此Ti4+-IMAC-S用振蕩法富集到的磷酸化肽段較多。

2.2 Ti4+-IMAC-S與Ti4+-IMAC-L在95C細(xì)胞磷酸化肽段富集中的比較分析

用振蕩法,尺寸不同的Ti4+-IMAC-S和Ti4+-IMAC-L分別對95C細(xì)胞磷酸化肽段進行富集。Ti4+-IMAC-L在溶液中較分散,無法通過振蕩后離心的方法使固液分離,因此采用SPE進行磷酸化肽段的富集[12]。磷酸肽的分析結(jié)果(PD搜庫)如表2所示,與Ti4+-IMAC-L相比,Ti4+-IMAC-S富集到的磷酸化肽段的數(shù)量更多,特異性更高。

2.3 不同轉(zhuǎn)移能力肺細(xì)胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的比較分析

為探究細(xì)胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組之間的聯(lián)系,我們進行了MRC5、95C和95D的細(xì)胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析?；谏鲜龇椒▋?yōu)化結(jié)果,我們選用Ti4+-IMAC-S(振蕩法)進行了細(xì)胞的磷酸化肽段富集。取相同質(zhì)量肽段樣品進行LC-MS/MS分析(3次技術(shù)重復(fù)),實驗結(jié)果采用Maxquant軟件進行分析。

2.3.1肺細(xì)胞蛋白質(zhì)組定量分析

圖1a為MRC5、95C和95D細(xì)胞系全蛋白質(zhì)組的韋恩圖,3種細(xì)胞系的3次技術(shù)重復(fù)中共鑒定到1 262種蛋白質(zhì),3種細(xì)胞系全蛋白質(zhì)數(shù)目較為接近,分別鑒定到992、1 102、1 182種蛋白質(zhì),其中共有的蛋白質(zhì)達(dá)到840種,占所有檢測到蛋白質(zhì)的66.6%。

圖 1 MRC5、95C和95D細(xì)胞系(a)全蛋白質(zhì)和 (b)磷酸化蛋白質(zhì)的韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of (a) proteins and (b) phospho- proteins among MRC5, 95C, and 95D

與正常肺細(xì)胞MRC5相比,95C中有325個蛋白質(zhì)上調(diào),292個蛋白質(zhì)下調(diào)(見圖2a)。與MRC5相比,95C和95D中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目依次增加,細(xì)胞活性增強,轉(zhuǎn)移能力和增殖能力也隨之越強。

表 3 磷酸化蛋白質(zhì)位點數(shù)頻數(shù)表

2.3.2肺細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組定量分析

與全蛋白質(zhì)相比,3種細(xì)胞系共有的磷酸化蛋白質(zhì)種類比例顯著下降。如圖1b所示,MRC5、95C和95D細(xì)胞系分別富集到510、863和1 108種磷酸化蛋白質(zhì),只有317種磷酸化蛋白質(zhì)是3種細(xì)胞系共有的,僅占25.0%。3種細(xì)胞系中較大差異的磷酸化蛋白質(zhì)能夠反映細(xì)胞的更多動態(tài)信息,為研究細(xì)胞轉(zhuǎn)移等特征提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),高轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞有更多的蛋白質(zhì)發(fā)生了磷酸化修飾,并且蛋白質(zhì)上的磷酸化位點也更多(見表3)。95D中含有7到11個磷酸化位點、13到15個磷酸化位點的磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)量比95C和MRC5明顯增多。

圖 2 MRC5、95C和95D細(xì)胞差異表達(dá)的(a)蛋白質(zhì)和 (b)磷酸化位點Fig. 2 Dysregulated (a) proteins and (b) phospho- sites in MRC5, 95C, and 95D

3種細(xì)胞系中共檢測到7 560個磷酸化位點,其中定量到1 983個磷酸化位點。顯著變化的磷酸化位點的數(shù)量如圖2b所示,肺癌細(xì)胞比正常肺細(xì)胞磷酸化位點多,其中高轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞95D的磷酸化位點數(shù)最多。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是控制細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)方式,由于MRC5細(xì)胞為肺成纖維細(xì)胞,而95C和95D分別為低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞,因此這些結(jié)果表明,癌細(xì)胞較正常細(xì)胞代謝旺盛,分裂能力更強。雖然3種細(xì)胞的蛋白質(zhì)種類及含量差異較小,但由于蛋白質(zhì)的磷酸化水平發(fā)生變化,因此起調(diào)節(jié)作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化位點差異較大,說明蛋白質(zhì)磷酸化可能在癌癥轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

對3種細(xì)胞系中富集到的磷酸化肽段及磷酸化位點進行分析發(fā)現(xiàn),三磷酸化肽段(3-P)在95D中數(shù)量最多,占比最高(見圖3a)。圖3b顯示了絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上磷酸化的數(shù)量及比例,結(jié)果表明,絲氨酸磷酸化在轉(zhuǎn)移能力越高的細(xì)胞中含量略有升高。

2.3.3磷酸化蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析

對1 130個異常表達(dá)的磷酸化位點所對應(yīng)的磷酸化蛋白質(zhì)進行GO分析(見表4)。結(jié)果表明,這些差異磷酸化蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程集中在代謝和RNA加工相關(guān)的過程,所屬的細(xì)胞成分主要集中在細(xì)胞核,具有的分子功能表現(xiàn)為與蛋白質(zhì)、核酸均有結(jié)合。

磷酸化位點定量分析得到了73個在MRC5、95C、95D中依次上調(diào)的磷酸化位點,對這些磷酸化位點對應(yīng)的磷酸化蛋白質(zhì)進行GO分析,有助于探究這些在轉(zhuǎn)移能力較強的肺細(xì)胞中上調(diào)的磷酸化位點與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和癌變的關(guān)系。分析結(jié)果表明,在假陽性率最低的前10個生物學(xué)過程中,與細(xì)胞正調(diào)控有關(guān)的過程有4個,與細(xì)胞周期、有絲分裂有關(guān)的過程有3個。與所有異常表達(dá)的1 130個磷酸化位點所對應(yīng)的RNA有關(guān)的生物過程不同,這些磷酸化蛋白質(zhì)偏向于與細(xì)胞癌變有關(guān);對于細(xì)胞成分而言,大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)都集中在細(xì)胞核部分,與蛋白質(zhì)組相同;分子功能分析中,與激酶結(jié)合的占3個,置信度較高,且與DNA結(jié)合置信度及位點所對應(yīng)的蛋白質(zhì)所占比例均較大。因為MRC5、95C、95D依次上調(diào)的磷酸化位點所對應(yīng)的蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞分裂周期的調(diào)節(jié)及DNA的結(jié)合,所以對磷酸化位點進行定量分析是研究細(xì)胞轉(zhuǎn)移及癌變過程的一個重要切入點,可以為后續(xù)機理或生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ),為癌癥等疾病診斷提供依據(jù)。

圖 3 (a)單、多磷酸化肽段和(b)磷酸化位點的數(shù)量及比例Fig. 3 Numbers and ratios of (a) mono- and multi-phosphopeptides and (b) different phosphosites1-P: singly phosphorylation; 2-P: doubly phosphorylation; 3-P: triply phosphorylation.

表 4 異常表達(dá)磷酸化位點對應(yīng)磷酸化蛋白質(zhì)的GO分析

表 5 全蛋白質(zhì)組顯著調(diào)節(jié)的激酶相關(guān)蛋白質(zhì)

2.3.4激酶及其磷酸化位點分析

全蛋白質(zhì)組中激酶表達(dá)情況與磷酸化蛋白質(zhì)組有一定關(guān)聯(lián),全蛋白質(zhì)組共鑒定到43種激酶,其中28種激酶在3種細(xì)胞中有顯著變化,如表5所示。

其中,6種激酶在磷酸化肽富集之后的位點分析中同樣出現(xiàn)顯著性變化(粗體顯示),分別是ATP依賴6磷酸果糖激酶(PFKAP)、C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4(JIP4)、T淋巴細(xì)胞活化的殺傷細(xì)胞來源蛋白激酶(TOPK)、富含肉豆蔻堿的C激酶底物(MARCKS)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(DCLK1)和S期激酶相關(guān)蛋白1(SKP1),其磷酸化位點上下調(diào)的倍數(shù)顯示在蛋白質(zhì)的倍數(shù)下方(斜體加粗)。對于這28個差異激酶,經(jīng)文獻檢索,選取其中8個分析其典型激酶調(diào)節(jié)特征。

1. 腺苷酸激酶(KAD):是催化腺嘌呤核苷酸(AMP/ADP/ATP)相互轉(zhuǎn)化的磷酸轉(zhuǎn)移酶,在維持細(xì)胞能量平衡中起重要作用,在95C和95D細(xì)胞中依次呈現(xiàn)過表達(dá)趨勢。研究[14]發(fā)現(xiàn),KAD2在肺腺癌患者肺癌組織中過表達(dá),且KAD2的下調(diào)可抑制人肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。

2. 激酶A錨定蛋白12(AKA12):僅在95C和95D細(xì)胞中被檢測到,在MRC5細(xì)胞中未鑒定到。研究[15]發(fā)現(xiàn),AKA12是介導(dǎo)蛋白激酶A和蛋白激酶C亞細(xì)胞分區(qū)的錨定蛋白質(zhì),與細(xì)胞內(nèi)β腎上腺素受體信號調(diào)節(jié)相關(guān)。

3. PFKAP:與糖酵解相關(guān)[16],在癌細(xì)胞中高表達(dá)。值得注意的是,該酶的磷酸化水平在癌細(xì)胞中也顯著升高,說明PFKAP在癌細(xì)胞中代謝活力強。

4. 肌酸激酶(KCRB):能夠可逆催化ATP的合成,在能量需求大的細(xì)胞中高表達(dá),也有大量研究表明KCRB為潛在腫瘤標(biāo)志物[17]。

5. JIP4:又叫人肺致癌基因6蛋白,C-Jun是原癌基因,在多種癌癥中表達(dá)顯著增強[18],在本文實驗數(shù)據(jù)中,JIP4及其磷酸化位點(T586)在癌細(xì)胞中表達(dá)增強。

6. TOPK:在癌細(xì)胞中高表達(dá),研究[19]表明TOPK在白血病和骨髓瘤等高增殖腫瘤中過表達(dá),在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

7. MARCKS及其磷酸化:在癌細(xì)胞中高表達(dá),研究[20]發(fā)現(xiàn)MARCKS可以調(diào)節(jié)膽道癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

8. SKP1:研究[21]發(fā)現(xiàn),其在56.3%的非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá),且預(yù)后不良時其表達(dá)升高;在95D細(xì)胞中高表達(dá),磷酸化水平顯著提高,現(xiàn)象與文獻[21]一致。

我們鑒定到的異常表達(dá)的激酶中大部分已被證實與細(xì)胞癌變及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),另有部分異常表達(dá)的激酶尚未見報道,可作候選蛋白質(zhì),驗證其成為生物標(biāo)志物的可能性。因此,全蛋白質(zhì)水平的激酶調(diào)節(jié)對癌癥進展和后續(xù)磷酸化蛋白質(zhì)組的研究都具有重要意義。

2.3.5蛋白質(zhì)組與磷酸化蛋白質(zhì)組對比分析

將顯著變化的蛋白質(zhì)與磷酸化蛋白質(zhì)進行了IPA分析。在疾病和生物功能方面,蛋白質(zhì)組顯示了與DNA、細(xì)胞周期有關(guān)的上調(diào),而與RNA、細(xì)胞死亡有關(guān)的下調(diào),并且肺癌進展有關(guān)的蛋白質(zhì)上調(diào)。磷酸化蛋白質(zhì)組顯示了與死亡相關(guān)、細(xì)胞生長相關(guān)的蛋白質(zhì)下調(diào),遷移侵襲、DNA修復(fù)有關(guān)的蛋白質(zhì)上調(diào)。磷酸化蛋白質(zhì)組的對比分析發(fā)現(xiàn),95D/95C、95C/MRC5、95D/MRC5有相同的變化趨勢,即MRC5、95C、95D依次上調(diào)或下調(diào),且與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)上調(diào)。與蛋白質(zhì)組相比,磷酸化蛋白質(zhì)組更能反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的差異。

本研究鑒定到的Histone H1.5(H15)、真核翻譯起始因子4B(IF4B)、富含十四烷基的富含丙氨酸的C激酶底物(MARCS)和神經(jīng)母細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(AHNAK)等蛋白質(zhì)的磷酸化位點表達(dá)量變化也與肺癌進展正相關(guān)[22],提示其在肺癌轉(zhuǎn)移中的潛在功能。

3 結(jié)論

與大尺寸的Ti4+-IMAC-L相比,Ti4+-IMAC-S在富集磷酸化肽段的數(shù)量和特異性上更優(yōu)。與SPE相比,振蕩法由于樣品與Ti4+-IMAC-S材料接觸的時間較長,富集到的磷酸化肽段數(shù)量更多。將Ti4+-IMAC-S的振蕩法應(yīng)用于不同轉(zhuǎn)移能力的肺細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),3種細(xì)胞系的全蛋白質(zhì)水平差異較小,而磷酸化蛋白質(zhì)水平差異較大。隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的增加,蛋白磷酸化水平也顯著增加。其中95C和95D上調(diào)的磷酸化位點對應(yīng)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖顯著相關(guān)。一些異常表達(dá)的激酶及其磷酸化程度與細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)。異常表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞侵襲、遷移和死亡等細(xì)胞遷移方面的功能有關(guān),后續(xù)研究可對這些異常表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化位點進行肺癌轉(zhuǎn)移等功能的驗證。本研究充分說明基于Ti4+-IMAC的親和色譜技術(shù)是開展癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)研究的強有力工具。