利用SNP標(biāo)記分析淳安花豬群體遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)

戴麗荷，褚曉紅，陳曉宇，楊娜娜，黃孫平，徐如海

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/浙江省畜禽遺傳育種工程技術(shù)研究中心，浙江 杭州 310021）

淳安花豬是浙江省地方豬品種之一，原產(chǎn)于淳安縣境內(nèi)，距今有500多年的飼養(yǎng)歷史。1980年，淳安花豬與安徽的皖南花豬歸并，稱(chēng)為皖浙花豬[1]。淳安花豬具有大多數(shù)中國(guó)地方豬種的特點(diǎn)，如繁殖力強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低等，曾是當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的當(dāng)家豬種，1983年全縣淳安花豬能繁母豬存欄量達(dá)到8 319頭。但由于地方豬普遍存在生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低等特點(diǎn)，加上近30多年來(lái)瘦肉型豬種的沖擊，淳安花豬飼養(yǎng)量急劇減少，2005年存欄僅248頭，已瀕臨滅絕[2]。

要評(píng)估豬保種群體的現(xiàn)狀，最重要的是分析當(dāng)前群體的遺傳多樣性。目前豬群體遺傳多樣性的評(píng)估最常使用的是SNP（單核苷酸多態(tài)性）分子標(biāo)記。SNP標(biāo)記具有密度高、遺傳穩(wěn)定、可自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，在豬、雞等畜禽上都有相應(yīng)的SNP芯片。隨著SNP芯片技術(shù)的成熟和價(jià)格的降低，SNP芯片愈來(lái)愈廣泛地應(yīng)用于豬的遺傳多樣性分析以及其他遺傳學(xué)研究中[3-7]。

近年以來(lái)，淳安花豬的生存形勢(shì)愈加嚴(yán)峻，現(xiàn)有保種群體幾經(jīng)變動(dòng)，系譜記錄缺失，養(yǎng)殖數(shù)量繼續(xù)下降。目前淳安花豬保種群體的遺傳多樣性如何？群體近交情況怎么樣？家系數(shù)量到底有幾個(gè)？能否重構(gòu)群體系譜？只有解決這些問(wèn)題，才能更科學(xué)有效地保護(hù)淳安花豬這一寶貴地方豬種。本研究就是利用SNP芯片技術(shù)鑒定淳安花豬保種群體中現(xiàn)有的全部能繁公母豬的個(gè)體SNP位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上分析淳安花豬群體的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，并重新劃分家系，以指導(dǎo)淳安花豬種群后續(xù)的恢復(fù)擴(kuò)群以及種質(zhì)資源保護(hù)工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2021年4月13日至6月30日，在浙江省杭州市淳安縣采集54頭浙江省杭州市淳安縣淳安花豬現(xiàn)有保種群全部能繁公母豬的前腔靜脈血樣，其中母豬47頭，公豬7頭，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 淳安花豬群體基因組DNA的提取 采用磁珠法血液DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)，CW2531S）提取淳安花豬的DNA。所有樣品的DNA利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000進(jìn)行定量分析，DNA的濃度調(diào)整至50 ng/μL。

1.2.2 SNP芯片分型 所有合格的DNA樣品利用Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片進(jìn)行基因型分型，然后對(duì)獲得的芯片掃描數(shù)據(jù)按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控：先除去性染色體上的標(biāo)記，只使用常染色體上的位點(diǎn)，再選擇SNP檢出率大于0.9、個(gè)體檢出率大于0.9的位點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 遺傳多樣性分析 遺傳多樣性分析包括有效群體含量（Effective population content, Ne）分析[8]、群體的多態(tài)性標(biāo)記比例（Proportion of polymorphic marker, PN）分析[9]、群體的期望雜合度（Expected heterozygosity, He）和觀察雜合度（Observed heterozygosity, Ho）分析[10]。利用Plink（V1.90）軟件分析多態(tài)性標(biāo)記比例、期望雜合度和觀察雜合度，利用SNeP（V1.1）軟件分析群體有效含量。

1.2.4 種群基因組親緣關(guān)系分析 利用Plink（V1.90）軟件計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離，構(gòu)建狀態(tài)同源（identity by state, IBS）矩陣，進(jìn)行IBS遺傳距離分析。通過(guò)全基因組標(biāo)記信息構(gòu)建基因組關(guān)系G矩陣[11]，利用Gmatrix（V2）軟件進(jìn)行G矩陣分子親緣關(guān)系分析，繪制熱圖展現(xiàn)個(gè)體之間的基因組親緣關(guān)系。

1.2.5 基于長(zhǎng)純合片段的近交系數(shù)分析 使用Plink1.9b軟件進(jìn)行基因組長(zhǎng)純合片段（Runs of homozygosity, ROH）分析。首先使用Plink（V1.90）計(jì)算得到每個(gè)樣本的ROH長(zhǎng)度[9]，然后通過(guò)計(jì)算個(gè)體中ROH片段的總長(zhǎng)度占常染色體基因組總長(zhǎng)的比例得到基于ROH的近交系數(shù)[12]。

1.2.6 聚類(lèi)分析構(gòu)建淳安花豬群體家系 基于IBS遺傳距離分析結(jié)果和G矩陣分析結(jié)果，利用Mega X（V10.0）軟件構(gòu)建鄰接法進(jìn)化發(fā)育樹(shù)（Neighbor-Joining tree, NJ tree），進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建淳安花豬保種群體家系。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA檢測(cè)

54份淳安花豬DNA樣品的濃度均大于100 ng/μL，OD260nm/OD280nm為1.7～2.0，基因組DNA樣品質(zhì)量較好，無(wú)蛋白質(zhì)污染，也無(wú)降解，達(dá)到基因芯片的分析要求，可以用于后續(xù)研究。

2.2 SNP分型及質(zhì)控

利用Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片分析54頭淳安花豬的基因組DNA，共檢測(cè)到44 739個(gè)SNPS位點(diǎn)，個(gè)體的基因型檢出率為98.25% ～99.14%，平均值為98.49%。通過(guò)質(zhì)量控制，總共得到32 713個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，在染色體上的分布情況如表1所示。這些位點(diǎn)的分布密度在1號(hào)染色體最多，為3 835個(gè)，說(shuō)明1號(hào)染色體的遺傳變異相對(duì)較豐富；18號(hào)染色體的SNP數(shù)目最少，為742個(gè)。

表1 質(zhì)控前后的SNP在染色體上的分布

2.3 遺傳多樣性分析

54頭淳安花豬共檢測(cè)到了73.187個(gè)有效等位基因，平均有效等位基因數(shù)為1.355，最小等位基因頻率平均為0.143，分布比較均勻，其中0.1～0.2之間的相對(duì)較多，占25.05%，分布情況如圖1A。SNP位點(diǎn)的多態(tài)性標(biāo)記比例（PN）為0.543，表明54.3% 的SNP位點(diǎn)具有多態(tài)性，SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.018～0.375，平均多態(tài)信息含量為0.193，其中，14 582個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量大于0.25（用于計(jì)算多態(tài)信息含量的SNP位點(diǎn)共35 679個(gè)），為中度多態(tài)性SNP位點(diǎn)，如圖1B所示。淳安花豬有效群體含量（Ne）為5.0，平均觀察雜合度（Ho）為0.254，平均期望雜合度（He）為0.257，平均觀察雜合度略小于平均期望雜合度，但兩者十分接近。

圖1 淳安花豬遺傳多樣性分析

2.4 IBS距離矩陣分析

54頭保種淳安花豬之間的IBS遺傳距離在0.083 3～0.388 7之間，平均為0.212 9；7頭種公豬的IBS遺傳距離在0.104 2～0.286 2之間，平均為0.233 9。淳安花豬保種群體IBS距離矩陣的結(jié)果如圖2所示，大部分方格顏色較淺（呈中等程度的親緣關(guān)系），小部分個(gè)體間的IBS遺傳距離較近，存在較高的親緣關(guān)系。

圖2 淳安花豬種群的狀態(tài)同源（IBS）矩陣

2.5 G矩陣分析

利用SNP位點(diǎn)構(gòu)建的基因組關(guān)系G矩陣，進(jìn)一步分析淳安花豬保種群體的親緣關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。大部分淳安花豬個(gè)體間呈中等程度的親緣關(guān)系（圖3中顏色較淺的方格），而部分個(gè)體之間存在較近的親緣關(guān)系（圖3中顏色較深的方格），與IBS距離結(jié)果一致。

圖3 淳安花豬種群的G矩陣

2.6 ROH分析

在54頭淳安花豬保種群體中共檢測(cè)到2 646個(gè)ROH片段，長(zhǎng)度在1～10 Mb之間的ROH數(shù)量最多，占72.54% （圖4A），其中，最短的ROH的長(zhǎng)度為1.12 Mb，位于15號(hào)染色體上，最長(zhǎng)的ROH的長(zhǎng)度為135.85 Mb，位于13號(hào)染色體上。ROH的分布比較均勻，1號(hào)染色體上的ROH數(shù)量最多，為313個(gè)；12號(hào)染色體上的ROH數(shù)量最少，為65個(gè)（圖4B）。每頭淳安花豬的ROH總長(zhǎng)度在2.93～1 050.05 Mb之間，平均ROH總長(zhǎng)度為488.91 Mb，ROH總長(zhǎng)度在400～700 Mb之間的個(gè)體數(shù)最多，共有35頭（圖4C），占65%。

圖4 淳安花豬ROH分析

淳安花豬保種群體基于ROH計(jì)算的平均近交系數(shù)為0.199，大部分集中在0.1～0.3，最低0.001 2，最高0.428 5，表明淳安花豬保種群體出現(xiàn)了近交現(xiàn)象。

2.7 淳安花豬保種群體家系結(jié)構(gòu)分析

一般來(lái)講，豬保種群體的家系劃分是基于公豬。同時(shí)結(jié)合G矩陣和遺傳距離分析結(jié)果，將這7頭種公豬劃分為5個(gè)家系，分別命名為家系A(chǔ)、家系B、家系C、家系D、家系E，分別含有2、2、1、1、1頭種公豬。

根據(jù)47頭淳安花豬母豬與不同家系公豬親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度，將母豬劃分進(jìn)上面已構(gòu)建的5個(gè)公豬家系中。另外，在這5個(gè)家系分類(lèi)以外，有25頭母豬與所檢測(cè)的公豬血緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)，將其合并構(gòu)建為家系F，最終整個(gè)淳安花豬保種群體家系分析結(jié)果見(jiàn)表2，共分為6個(gè)家系。

表2 群體家系構(gòu)建結(jié)果

3 討論

豬群體遺傳多樣性研究一般使用微衛(wèi)星標(biāo)記或SNP標(biāo)記。章學(xué)東等[13]利用9對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)淳安花豬群體遺傳多樣性，認(rèn)為淳安花豬群體遺傳多樣性豐富。但隨著技術(shù)的發(fā)展，SNP芯片突顯出了更大的優(yōu)勢(shì)，與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記覆蓋密度大，分布廣泛，數(shù)量豐富，突變率低，遺傳穩(wěn)定性高。有研究表明，采用SNP標(biāo)記比采用微衛(wèi)星標(biāo)記估計(jì)親緣關(guān)系的準(zhǔn)確性更高[14]。本研究主要利用中國(guó)地方豬種的Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片，發(fā)現(xiàn)個(gè)體的基因型檢出率為98.25% ～99.14%，平均值為98.49%，且這些位點(diǎn)幾乎覆蓋全部基因組，分布相對(duì)均勻，具有很好的代表性。利用同樣的芯片，藍(lán)塘豬個(gè)體基因型檢出率94.88% ～98.43%，平均為98.24%[7]。馬身豬個(gè)體基因型檢出率為97.75% ～98.16%，平均為98.01%[4]。這些研究表明，該款SNP芯片適用于我國(guó)地方豬種的SNP檢測(cè)。

黃樹(shù)文[5]利用SNP芯片對(duì)中國(guó)華南地區(qū)（云南、廣東、廣西、福建、海南）21個(gè)地方豬種和6個(gè)西方豬種的分析表明，27個(gè)豬種的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.795～0.995。蔡春波等[4]發(fā)現(xiàn)馬身豬的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.724。本研究中淳安花豬SNP位點(diǎn)的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.543，與第三世代青峪豬群體的0.536 7[3]基本相當(dāng)，說(shuō)明淳安花豬的遺傳多樣性較少。淳安花豬并沒(méi)有像西方商業(yè)豬種那樣經(jīng)受過(guò)高強(qiáng)度的選育，但卻沒(méi)有表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性，這反映了大多數(shù)中國(guó)地方豬種保種群規(guī)模較小、遺傳多樣性丟失嚴(yán)重的現(xiàn)象[15-16]。在雜合度方面，27個(gè)豬種的觀測(cè)雜合度為0.25～0.43，中國(guó)地方豬種中，以官莊花豬的觀測(cè)雜合度最低，為0.298；期望雜合度為0.295～0.421，中國(guó)地方豬種中，閩北花豬最低，為0.295[5]。本研究中淳安花豬的平均觀察雜合度（Ho）為0.254，平均期望雜合度（He）為0.257，均低于華南地區(qū)的地方豬種，原因可能是由于一直以來(lái)淳安花豬的保種群體小，近親繁殖普遍存在而使群體發(fā)生純合反應(yīng)，導(dǎo)致雜合度降低。此外，淳安花豬的平均觀察雜合度略小于平均期望雜合度，但兩者十分接近，表明現(xiàn)有的淳安花豬群體未經(jīng)受過(guò)嚴(yán)格的選育，豬群幾乎處于自由交配狀態(tài)[17]，這與近幾年淳安花豬保種群變動(dòng)劇烈有關(guān)。因此，在淳安花豬保種工作中，應(yīng)盡量引入新的血統(tǒng)，避免近親繁殖，以提高遺傳多樣性。

衡量群體遺傳關(guān)系的指標(biāo)主要看遺傳距離和根據(jù)基因組G矩陣分析的親緣關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)群體遺傳距離越近，遺傳相似系數(shù)越大，則親緣關(guān)系越近[18]。陳究成[19]利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)浙江省地方豬群體平均遺傳距離為0.151，其中淳安花豬遺傳距離為0.159。本研究發(fā)現(xiàn)淳安花豬遺傳距離為0.212 9，這與SNP標(biāo)記檢測(cè)方法、樣本分析數(shù)量、保種群體變動(dòng)等有關(guān)。G矩陣分析結(jié)果也同樣表明，大部分淳安花豬個(gè)體間呈中等程度的親緣關(guān)系，部分個(gè)體之間存在較近的親緣關(guān)系，與IBS距離結(jié)果一致，表明淳安花豬保種群體存在近交風(fēng)險(xiǎn)。

ROH是個(gè)體基因組內(nèi)純合基因型的連續(xù)片段，蘊(yùn)含著群體近交的信息，其長(zhǎng)度和頻率可以反映群體歷史?；赗OH計(jì)算的基因組近交系數(shù)是個(gè)體真實(shí)的近交系數(shù)，不依賴(lài)于系譜記錄的準(zhǔn)確性和完整性，能準(zhǔn)確地反映兩個(gè)配子間的關(guān)系。本研究基于ROH值計(jì)算的群體平均近交系數(shù)為0.199，比馬身豬（0.237）[4]低，但比青峪豬（0.075）[3]、恩施黑豬（0.069）[6]和深縣豬（0.009 3）[20]都要高，表明淳安花豬群體出現(xiàn)了近交現(xiàn)象，這與IBS矩陣以及G矩陣結(jié)果相一致。后續(xù)工作中應(yīng)引入新的血統(tǒng)，擴(kuò)大群體含量，進(jìn)行科學(xué)選配，避免近親繁殖。

實(shí)際育種工作中，在系譜的準(zhǔn)確性和完整性上出現(xiàn)誤差或缺失很難避免，尤其是在大部分的地方豬保種場(chǎng)，由于規(guī)模和技術(shù)力量受限，系譜的完整性、連續(xù)性及準(zhǔn)確性等問(wèn)題尤為突出。淳安花豬保種群體由于這幾年變動(dòng)較大，存在系譜缺失的情況，本研究將54頭淳安花豬分為6個(gè)家系，其中5個(gè)家系均含有種公豬，但不同家系中個(gè)體數(shù)目差異很大，家系E沒(méi)有母豬，家系F沒(méi)有公豬，在后續(xù)的保種工作中，需要關(guān)注各家系種豬的數(shù)量，盡量維持一個(gè)平衡的家系結(jié)構(gòu)。

總之，淳安花豬保種群體的雜合度低，近交程度高，家系少，各家系的個(gè)體數(shù)量差異大，容易引起遺傳多樣性的丟失。結(jié)合研究結(jié)果，筆者認(rèn)為切實(shí)可行的淳安花豬保種策略，一是根據(jù)家系劃分結(jié)果，在實(shí)際選配中可采取不同家系間的輪回配種，實(shí)現(xiàn)避開(kāi)全同胞、半同胞的不完全隨機(jī)交配；二是可利用回交法造就新的公豬血統(tǒng)，增加群體有效含量；三是延長(zhǎng)世代間隔，控制近交增量；四是加強(qiáng)檔案管理，及時(shí)建立電子檔案及規(guī)范耳號(hào)編號(hào)、系譜記錄流程，對(duì)遺傳數(shù)據(jù)做到可及時(shí)跟蹤和監(jiān)測(cè)，定期分析，及時(shí)調(diào)整保種方案。本研究對(duì)淳安花豬的保種工作具有實(shí)際指導(dǎo)意義。