土壤熏蒸對土壤氮循環(huán)及其功能微生物的影響研究進展

王 晴, 張大琪, 方文生, 李 園,2, 王秋霞,2, 顏冬冬*,,2, 曹坳程*,,2

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，北京 100193；2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊，北京 100193)

0 引言

目前，高度集約化和長期單一化的連作栽培模式在增加高附加值作物產(chǎn)量的同時也引發(fā)了一系列的問題，不僅易導致土壤退化，而且土傳病害的發(fā)生還愈加嚴重，使得農(nóng)作物產(chǎn)量大大降低[1]。目前，國內(nèi)外主要利用傳統(tǒng)耕作調(diào)控、生物防治技術(shù)、物理消毒技術(shù)和化學防治技術(shù)等系列措施改善土壤環(huán)境，控制土傳病害的傳播蔓延。其中，在農(nóng)作物種植前使用熏蒸劑對土壤進行消毒處理，是當前最為有效的防治土傳病害的措施[2]。溴甲烷 (methyl bromide) 曾是一種有效的土壤熏蒸劑，但由于其可顯著破壞臭氧層，中國已于2015 年禁止其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中使用[3]。目前，溴甲烷的化學替代劑主要有氯化苦 (chloropicrin)[4]、威百畝 (metam-sodium)[5]、棉隆 (dazomet)[6]、二甲基二硫 (dimethyl disulfide)[7]、1,3-二氯丙烯 (1,3-dichloropropene)[8-10]、異硫氰酸甲酯 (methyl isothiocyanato)[11-12]和異硫氰酸烯丙酯 (allyl isothiocyanate)[13-14]等。

氮素是植物生長必需的營養(yǎng)元素之一。其主要通過氮輸入與氮輸出等外循環(huán)過程以及土壤氮礦化、生物固持、硝化與反硝化作用等內(nèi)循環(huán)過程進行遷移轉(zhuǎn)化，是陸地生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)的基本物質(zhì)之一[15]。其中，土壤氮素的輸入來源主要是氮肥的添加和植物凋落物的分解釋放；氮素輸出主要包括植物吸收、微生物固定和揮發(fā)淋失等過程[16]。大氣中的氮氣是最大的可自由獲取的氮庫，但僅有少量的固氮細菌或者真菌可以通過生物固氮作用直接將其利用[17]。土壤氮庫中的氮主要以有機氮的形式存在，而植物吸收的氮幾乎都是無機形式，因此，土壤氮庫中的有機氮必須不斷地通過微生物的礦化作用轉(zhuǎn)化為植物可吸收的有效態(tài)氮[18]。另外，硝化作用產(chǎn)生的硝態(tài)氮容易淋溶到水體和土壤中，反硝化作用的產(chǎn)物N2O 是重要的溫室氣體，對臭氧層具有破壞作用。因此，土壤氮素內(nèi)循環(huán)不僅影響著土壤對植物本身的供氮能力，還與氮素在大氣、土壤、水體中的轉(zhuǎn)化和遷移等過程緊密相關(guān)[19]。

鑒于溴甲烷是因為嚴重破壞臭氧層而被禁止在農(nóng)業(yè)上使用的，對于熏蒸劑的研究，除了關(guān)注土壤熏蒸劑本身的藥效外，越來越多的學者關(guān)注其在環(huán)境中的行為。氮既是植物必需的營養(yǎng)元素，又是造成環(huán)境污染的重要元素[20]。土壤熏蒸除了能夠有效殺滅土壤中有害生物外，對土壤中的非靶標生物也會產(chǎn)生一定的影響，進而改變土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[21]。微生物是驅(qū)動土壤元素循環(huán)轉(zhuǎn)化的引擎，與氮循環(huán)有關(guān)的關(guān)鍵過程均由微生物所驅(qū)動[22-23]，并且微生物發(fā)揮作用的過程均是由各種關(guān)鍵酶介導的酶促反應，其酶均由相應的功能基因編碼，因此土壤中氮素的轉(zhuǎn)化可以用功能基因和微生物的變化進行表征 (圖1)。土壤氮循環(huán)過程及主要微生物可以作為生態(tài)系統(tǒng)服務功能指標，部分微生物可以作為土壤微生態(tài)指示性微生物開展研究。土壤熏蒸對土壤中氮循環(huán)轉(zhuǎn)化過程及其功能微生物的影響一直是廣大學者研究的熱點問題。目前常采用高通量測序、熒光定量qPCR、宏轉(zhuǎn)錄組學等分子生物學手段以及常規(guī)生物學手段對其進行相關(guān)研究[24-26]。本文就近年來關(guān)于熏蒸劑對土壤氮循環(huán)過程中的固氮作用、礦化作用、硝化作用、反硝化作用及其功能微生物的影響的相關(guān)研究進展進行綜述，旨在為研究土壤熏蒸的環(huán)境風險提供依據(jù)。

1 土壤熏蒸對固氮作用及其功能微生物的影響

生物固氮作用是指在固氮微生物的參與下，氣態(tài)氮還原為氨的過程[17]。根據(jù)固氮微生物的特性及其與植物的關(guān)系，可以將固氮微生物分為共生固氮微生物 (包括根瘤菌Rhizobium、弗蘭克氏放線菌Frankiaceae、念珠藻Nostoc、單岐藻Tolypothrix等)、聯(lián)合固氮微生物 (包括固氮螺菌Azospirillum、部分假單胞菌Pseudomonas adaceae等) 和自生固氮微生物 (包括固氮菌Azotobactersp.、克雷伯氏菌Klebsiella、部分芽孢桿菌Bacillus、梭菌Clostridium、產(chǎn)甲烷菌Methanogenus及魚腥藻Anabaena等) 3 類[27-29]。據(jù)方文生[24]研究顯示，大多數(shù)的固氮微生物在土壤熏蒸后都被短暫抑制，比如：用1,3-二氯丙烯熏蒸，顯著降低了固氮螺菌屬的豐度，而提高了根瘤菌屬的豐度；用棉隆熏蒸，前期會降低中慢生根瘤菌屬和類芽孢桿菌屬的數(shù)量；用氯化苦熏蒸，會降低中慢生根瘤菌屬和固氮弓菌的數(shù)量；二甲基二硫會短暫抑制類芽孢桿菌屬的生長，促進固氮弓菌屬和中慢生根瘤菌屬的生長 (表1)。

固氮酶是生物固氮過程中最重要的酶，其由鉬鐵蛋白 (由nifD和nifK基因編碼) 和鐵蛋白 (由nifH基因編碼) 兩個多亞基組成[30]。只有鉬鐵蛋白和鐵蛋白同時存在時固氮酶才能發(fā)生固氮作用。nifH基因可以用來檢測固氮微生物[31]。方文生[24]的研究表明，分別使用1,3-二氯丙烯、氯化苦、二甲基二硫和異硫氰酸烯丙酯進行熏蒸的前期均降低了土壤中nifH的豐度，而使用棉隆進行熏蒸的前期，nifH豐度顯著高于對照組處理，用1,3-二氯丙烯處理后土壤中的nifH豐度也高于對照組，這可能是由于此前的肥料使用或者農(nóng)事操作影響了土壤中的營養(yǎng)成分，之前有研究表明，增加土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)可促進微生物的生長[32]，上述熏蒸對土壤氮循環(huán)中的固氮微生物影響效應不同可能也是此原因。Li 等[25]的研究表明，威百畝對nifH基因也有短暫的抑制作用 (表2)。

表2 土壤熏蒸對氮循環(huán)功能基因的影響Table 2 Effects of soil fumigation on functional genes of nitrogen cycle

2 土壤熏蒸對礦化作用的影響

礦化作用是指在微生物的作用下，將土壤中的有機氮轉(zhuǎn)化為植物可直接利用的無機氮 (硝態(tài)氮、銨態(tài)氮) 的過程。分為兩個階段：第一階段為氨基化階段，在這個階段各種復雜的含氮化合物如蛋白質(zhì)、核酸等在微生物酶的水解下，分解形成簡單的氨基化合物；第二階段為氨化階段，即經(jīng)氨基化作用產(chǎn)生的氨基酸等簡單的氨基化合物，在微生物參與下，進一步轉(zhuǎn)化釋放出氨的過程。

顏冬冬等[33]發(fā)現(xiàn)，土壤分別用氯化苦、碘甲烷、1,3-二氯丙烯和二甲基二硫熏蒸處理，短期內(nèi)均能提高土壤中氮的礦化速率，增加土壤中氮素累積礦化量。Neve等[34]的研究表明，用Cyanamid DD95 (1,3-二氯丙烯+1,3-二氯丙烷) 熏蒸土壤后，短期內(nèi)也提高了氮的礦化速率，但是隨著微生物群落的恢復，在熏蒸處理后期，土壤中氮的礦化速率并沒有顯著差異。陳云峰等[35]報道，用溴甲烷熏蒸后覆蓋不透膜 (VIF 膜) ，可提高土壤銨態(tài)氮的釋放，太陽能消毒也能提高土壤銨態(tài)氮的釋放。而Collins[36]研究發(fā)現(xiàn)，生物熏蒸可提高土壤的礦化速率，但經(jīng)過威百畝和1,3-二氯丙烯進行化學熏蒸后土壤的氮礦化速率降低。

土壤中的可溶性有機氮 (soluble organic nitrogen,SON) 能反映出土壤有機氮礦化的難易程度，可以作為反映土壤氮素礦化能力的指標。馬濤濤等[37]的研究顯示，氯化苦處理后土壤中硝態(tài)氮含量的變化與SON 含量有著極顯著的相關(guān)關(guān)系。土壤經(jīng)熏蒸后SON 含量會大幅上升，進而增強了有機氮礦化為無機氮的過程，有助于植物對氮素的吸收利用。有關(guān)熏蒸后土壤中SON 轉(zhuǎn)化為礦質(zhì)氮的具體機制還有待進一步研究[38]，但已有研究表明，熏蒸后土壤中的礦質(zhì)氮含量增加，主要是由于土壤中的異養(yǎng)微生物將熏蒸劑殺死的微生物殘體分解所致[34,39]。

3 土壤熏蒸對硝化作用及其功能微生物的影響

典型的硝化作用是指在有氧條件以及硝化微生物的參與下，將NH3或NH4+經(jīng)羥胺、亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的過程 (NH3/NH4+→NH2OH→NO2?→NO3?)，包括氨氧化和亞硝酸鹽氧化兩個反應。

研究表明，多種熏蒸劑對硝化作用都有著不同程度的抑制作用。程新勝等[40]發(fā)現(xiàn)，用溴甲烷和威百畝熏蒸后，土壤的硝化作用受到明顯抑制。馬濤濤[38]發(fā)現(xiàn)，棉隆有較強地抑制氨氧化過程的作用，在一定程度上起到了硝化抑制劑作用。顏冬冬等[33]的研究表明，在分別使用氯化苦、碘甲烷、1,3-二氯丙烯和二甲基二硫4 種熏蒸劑處理后，土壤硝化作用過程受到顯著抑制，各熏蒸處理土壤中銨態(tài)氮的含量均高于對照組，其中碘甲烷處理組銨態(tài)氮的含量最高。Stromberger[41]認為，用溴甲烷熏蒸土壤后，土壤的硝化速率與對照組相比減少55%以上。但是，Chen 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，使用臭氧熏蒸5 年后，小麥根際土壤中的硝化酶活性增加了10%～34%。由于熏蒸劑本身性質(zhì)的存在差異，導致不同熏蒸劑的半衰期不同，對硝化作用的抑制持續(xù)時間也不盡相同。馬濤濤等[38]的研究表明，氯化苦和1,3-二氯丙烯對土壤氮素硝化作用的抑制較強，至少維持28 d，而二甲基二硫和威百畝的抑制作用維持至少14 d；Ibekwe[43]報道，用Cyanamid DD95 熏蒸土壤后至少21 d 內(nèi)，土壤的硝化作用都會受到抑制。另外，Yan 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，氯化苦在不同類型土壤中，硝化作用的恢復時間有顯著差異。

硝化作用第一步是在氨氧化細菌 (ammoniaoxidizing bacteria, AOB) 和氨氧化古菌 (ammoniaoxidizing archaea, AOA) 作用下完成氨的氧化，第二步是在亞硝酸鹽氧化細菌 (nitrite-oxidizing bacteria, NOB) 作用下完成亞硝酸的氧化。其中，氨氧化反應是整個硝化反應的限速步驟，各藥劑對硝化作用的抑制主要是抑制AOB 的活性。AOB 產(chǎn)生的氨單加氧酶 (AMO) 可催化NH3或NH4+轉(zhuǎn)化成羥胺，氯化苦、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫和威百畝均能作為AMO 的底物被催化氧化[45]，這些熏蒸劑對AMO 活性抑制效應的強弱主要取決于它們同AMO 的親和力。Li 等[25]發(fā)現(xiàn)，用氯化苦熏蒸后，土壤中AOA 的豐度明顯降低，而AOB 的豐度明顯增加，這可能是由于氯化苦對AOA 和AOB 的敏感性存在差異，導致主導氨氧化過程的群體發(fā)生改變。

氨氧化細菌可分成5 個菌屬：亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬 (Nitrosospira)、亞硝化球菌屬 (Nitrosococcus)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio) 以及亞硝化葉菌屬 (Nitrosolobus)[46]。大多數(shù)氨氧化細菌屬于β-變形菌和γ-變形菌兩類[47]。方文生[24]研究表明，分別用1,3-二氯丙烯和氯化苦熏蒸，可顯著減少土壤中亞硝化單胞菌屬的豐度，而用棉隆熏蒸的前期會增加亞硝螺菌屬的豐度。用1,3-二氯丙烯、氯化苦和二甲基二硫熏蒸，短期內(nèi)均可降低硝化螺菌屬的豐度；而Neilson[48]研究結(jié)果表明，使用氯化苦熏蒸后土壤中硝化螺菌屬的數(shù)量得以提高。

氨氧化反應是指NH3或NH4+在氨單加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO，amoA基因編碼)的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱u胺[47,49]，然后羥胺在羥胺還原酶 (hydroxylamine oxidoreductase，HAO，hao基因編碼) 的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镹O2?[49]。亞硝酸鹽氧化反應是指在亞硝酸鹽氧化還原酶 (n i t r i t e oxidoreductase，NXR，nxrB基因編碼) 作用下[50]，由NO2?轉(zhuǎn)化為NO3?的過程，并且分別用功能基因古菌amoA(AOAamoA)、細菌amoA(AOBamoA)和nxrB的豐度來評估古菌和細菌氨單加氧酶及亞硝酸鹽氧化酶的活性。但是目前氨氧化過程的主導群體尚未確定。Leininger 等[51]的研究表明，古菌主導土壤中的氨氧化過程，然而Di[52]研究發(fā)現(xiàn)，在含氮豐富的草地中的氨氧化過程是由細菌驅(qū)動的而不是古菌，因此結(jié)果具有不確定性。李君[26]研究表明，被威百畝抑制的土壤，其硝化過程主要反映在AOAamoA基因，AOBamoA的下降并沒有達到統(tǒng)計學的顯著水平；同時Chen 等[42]也發(fā)現(xiàn)，AOAamoA的豐度高于AOBamoA，但是兩者的變化均未達到顯著性差異。Fang 等[53]發(fā)現(xiàn)，在使用棉隆熏蒸后，會顯著降低土壤硝化反應中的AOAamoA、AOBamoA和nxrB功能基因的豐度。

4 土壤熏蒸對反硝化作用及其功能微生物的影響

反硝化作用是微生物在無氧或低氧條件下，將硝酸鹽 (NO3?) 作為電子受體完成呼吸作用以獲得能量的過程，因其會導致大量的氮流失，因此又稱為脫氮作用[54]。反硝化過程主要分為4 個步驟：NO3?→NO2?→NO→N2O→N2。燕平梅等[55]研究表明，分別用溴甲烷、威百畝和氯化苦進行熏蒸處理后，土壤反硝化作用在熏蒸前期均受到抑制，到后期則自然恢復。但是顏冬冬[56]、Chen 等[42]卻得到了相反的結(jié)果，用氯化苦和棉隆熏蒸土壤后，表現(xiàn)出明顯的促進土壤反硝化作用過程；Chen等[42]使用臭氧對土壤進行熏蒸處理5 年后，發(fā)現(xiàn)小麥根際土壤中生物反硝化酶的活性增加了4%～5%。對反硝化作用有顯著促進作用的氯化苦和棉隆均為含氮化合物，可在土壤中經(jīng)過微生物降解和化學降解為亞硝酸鹽、硝酸鹽、硝基甲烷和甲酰胺等小分子的含氮化合物，這些化合物都是典型的反硝化作用底物，從而在一定程度上促進了土壤的反硝化作用過程。

土壤中的反硝化微生物種類眾多，在真菌、細菌、古細菌中均有發(fā)現(xiàn)[57-58]，并且已有多人證明熏蒸處理可對反硝化細菌的數(shù)量產(chǎn)生影響。Roux-Michollet 等[59]發(fā)現(xiàn)，用蒸氣對土壤進行熏蒸處理后，土壤中的反硝化細菌數(shù)量減少，反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶活性受到持續(xù)的抑制。燕平梅等[60]的研究結(jié)果顯示，溴甲烷熏蒸改變了土壤中的nosZ型反硝化微生物群落組成和反硝化細菌數(shù)量，但是不同濃度的氯化苦、威百畝熏蒸對土壤nirS型反硝化細菌群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)無顯著影響。方文生[24]研究表明，用1,3-二氯丙烯熏蒸，顯著減少了土壤中的假單胞菌和副球菌等的豐度，增加了食堿菌、芽孢桿菌和鏈霉菌等的豐度；棉隆可抑制芽孢桿菌、假單胞菌、貪銅菌和鞘脂單胞菌的數(shù)量，短暫增加無氧芽孢桿菌、黃桿菌及鏈霉菌的數(shù)量；氯化苦在熏蒸初期，可降低黃桿菌、假單胞菌和貪銅菌的數(shù)量，在熏蒸后期則可顯著刺激芽單胞菌、芽孢桿菌和劍菌的生長；在熏蒸后期，二甲基二硫可顯著增加假單胞菌、無色桿菌和鏈霉菌等的豐度；同樣地，異硫氰酸烯丙酯可顯著增加黃桿菌、無色桿菌、鏈霉菌和無氧芽孢桿菌等的豐度。

由NO3?還原成NO2?的過程是在硝酸鹽還原酶的催化下完成的。硝酸鹽還原酶包含膜結(jié)合硝酸鹽還原酶 (membrane-bound nitrate reductase,NAR，由narG、narH、narJ基因編碼)、周質(zhì)硝酸鹽還原酶 (periplasmic-bound nitrate reductase,NAP，由napA、napB基因編碼) 兩種[61]，多數(shù)生物含有這兩種酶[54]。由NO2?還原成NO 的過程是由亞硝酸鹽還原酶 (nitrite reductase, NIR) 催化完成的。亞硝酸還原酶包含cdl-NIR(nirS基因編碼)和Cu-NIR(nirK基因編碼) 兩種，這兩種酶普遍存在于細菌和古菌中[62]。NO 還原成N2O 的過程是由一氧化氮還原酶 (nitric oxide reductase,NOR) 催化完成，一氧化氮還原酶包含cNOR(cnorB、norC基因編碼)、qNOR(qnorB基因編碼)兩種[63]，廣泛存在于各種環(huán)境中。N2O 還原成N2的過程是在一氧化二氮還原酶 (nitrous oxide reductase, NOS) 催化下完成的。一氧化二氮還原酶存在于多種細菌 (變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠菌門Chloromycota) 和古菌(泉古菌門Crenarchaeota 和嗜鹽菌門Halophilic bacteria) 中[64]，nos基因簇通常包含nosL、nosY、nosF、nosD、nosZ、nosR等6 個基因[24]。

反硝化過程中硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶分別通過測定napA和narG、nirS 和nirK、qnorB和cnorB、nosZ基因拷貝數(shù)來定量。李君[26]的研究結(jié)果表明，只有使用高劑量威百畝處理，土壤中的nosZ、nirS和narG才會被短暫抑制，并且其在第12 天時就恢復到了對照組的水平。Fang 等[65]發(fā)現(xiàn)，土壤分別經(jīng)氯化苦、棉隆、二甲基二硫、異硫氰酸烯丙酯和1,3-二氯丙烯5 種熏蒸劑處理后，均暫時減少了包含napA、narG、nirS和nirK酶編碼基因的反硝化細菌的種群。用棉隆和二甲基二硫熏蒸后，帶有cnorB、qnorB和nosZ基因的反硝化細菌相對穩(wěn)定。Chen 等[42]的研究也顯示，使用氯化苦連續(xù)熏蒸5 年后，小麥田土壤中的nirS和nirK基因均沒有顯著性差異。由于土壤中能參與反硝化作用的微生物種類較多，許多具有反硝化用功能的微生物均能參與1,3-二氯丙烯、異硫氰酸甲酯、氯化苦和溴甲烷等熏蒸劑在土壤中的生物降解，而且每部分反應的功能基因所起的作用也存在較大差異，因此土壤熏蒸對反硝化過程中的微生物種群和功能基因的影響也不盡相同。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，熏蒸劑對土壤氮循環(huán)各過程及其功能微生物均有著不同程度的影響。氮礦化速率決定了土壤中用于植物生長的氮素的可利用性。熏蒸過后，土壤氮循環(huán)中礦化作用增強，使植物對土壤氮素的利用率有所提高。雖然硝化作用消耗了銨態(tài)氮，減少了氨的揮發(fā)損失，但是，硝化作用產(chǎn)生的硝酸鹽極易淋溶，引起土壤性狀惡化，地下水富營養(yǎng)化且被嚴重污染等環(huán)境問題。土壤經(jīng)熏蒸劑處理后，硝化作用受到抑制，減少了硝酸鹽的產(chǎn)生，在一定程度上減輕了氮素的淋溶損失。土壤反硝化作用可引起氮的氣態(tài)損失而污染大氣，這關(guān)系到環(huán)境污染和氮素的經(jīng)濟利用；同時，反硝化作用產(chǎn)生的N2O 是重要的溫室氣體。土壤熏蒸處理能抑制反硝化過程，減少氣態(tài)氮的揮發(fā)損失?？傊?，土壤熏蒸不僅對氮循環(huán)有著重要影響，還影響著與氮循環(huán)相關(guān)聯(lián)的大氣、土壤、植物生長等各種環(huán)境，在一定程度上緩解了對環(huán)境的壓力。此外，李君[26]、顏冬冬[18]和Ruzo[66]等的研究表明，氯化苦不僅能夠控制病害發(fā)生還能提高作物產(chǎn)量，表明氯化苦在熏蒸過程產(chǎn)生了肥料效應，這可能是由于氯化苦造成了銨態(tài)氮的積累，提高了植株對氮的吸收。

另外，不同的土壤類型和土壤性質(zhì)也會在熏蒸過程中對氮循環(huán)過程的響應及其恢復的影響造成差異。方文生的研究發(fā)現(xiàn)，1,3-二氯丙烯、棉隆和氯化苦對功能基因的抑制作用，在江西酸性紅壤中比在北京堿性潮土的更強，且抑制時間較長[24]。熏蒸劑處理對土壤中氮循環(huán)各過程的影響主要發(fā)生在熏蒸初期，待到熏蒸后期，土壤微生物可以恢復到熏蒸之前的水平，對硝化、反硝化過程的抑制作用也都減弱直至消失。而此恢復和重建過程同樣受到土壤類型的影響，如控制硝化作用的微生物大部分屬于好氧微生物，所以在通氣性好的砂壤土中恢復較快，而在酸性土壤中一般會抑制硝化作用的活性，故在酸性土壤中，控制硝化作用的微生物經(jīng)熏蒸處理后恢復得相對較慢[44]。此外，方文生的研究還顯示，分別用異硫氰酸烯丙酯和二甲基二硫進行熏蒸，在北京堿性潮土中的細菌總豐度在第38 天時恢復到對照水平，而在江西酸性紅壤中至培養(yǎng)結(jié)束時總細菌的豐度也未能恢復[24]。氮循環(huán)功能基因的恢復與土壤中熏蒸劑的殘留量及殘留時間緊密相關(guān)，熏蒸劑在砂性土壤中降解速率更快，殘存時間較短，延緩了功能基因及功能微生物的恢復。另外，有多個研究發(fā)現(xiàn)，氮循環(huán)硝化與反硝化過程的功能微生物種群結(jié)構(gòu)、功能基因與硝化、反硝化反應的強度存在著解偶聯(lián)性，與響應時間存在時間差[18,55,60,67-69]。這可能也是由于礦化、硝化、反硝化等各個過程受到土壤類型、pH 值、溫度和土壤有機質(zhì)等多方面影響的結(jié)果。

現(xiàn)階段，關(guān)于土壤熏蒸對土壤中氮循環(huán)及其微生物的影響取得了一定的研究進展。李君[26]和方文生[24]均應用熒光定量qPCR 技術(shù)對土壤氮循環(huán)相關(guān)的功能基因及16S rRNA 進行了定量，明確了土壤氮循環(huán)主要功能基因?qū)Σ煌魟┑捻憫獎討B(tài)；通過宏轉(zhuǎn)錄組分析，研究土壤氮循環(huán)的功能基因在轉(zhuǎn)錄水平上對不同熏蒸劑的響應；方文生[24]還采用高通量測序技術(shù)分析了熏蒸條件下土壤細菌及氮循環(huán)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化；此外，方文生還借助15N、18O 雙同位素法研究了熏蒸土壤中硝化作用、反硝化作用、硝化細菌的反硝化、硝化與反硝化耦合作用對N2O 排放的貢獻，明確了土壤熏蒸對N2O 生成路徑的影響。

熒光定量qPCR 技術(shù)、宏基因組分析、高通量測序等現(xiàn)代化分子技術(shù)以及同位素標記等傳統(tǒng)方法的應用，使土壤熏蒸對土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因和微生物的影響的研究愈加透徹，但是其中的研究大多集中于室內(nèi)試驗，關(guān)于田間自然條件下的定量試驗較少。近期已有研究利用不同氮素轉(zhuǎn)化過程中氮同位素效應的差異及主要微生物過程中特異同位素值 (site preference, SP) 的差異構(gòu)建出同位素模型，分析自然豐度的同位素值準確地定量主要微生物過程的貢獻份額，進而解決自然條件下區(qū)分微生物過程的難題[17,70]?？傊?，運用穩(wěn)定同位素技術(shù)，聯(lián)合參與微生物過程功能基因和氮素轉(zhuǎn)化的同位素效應，對未來研究氮素轉(zhuǎn)化過程的微生物驅(qū)動機制具有重要的指導意義。

有關(guān)熏蒸劑處理對土壤中氮素循環(huán)影響的研究，除了文中描述的研究較多的固氮過程、礦化過程、硝化過程及反硝化過程外，還包括厭氧氨氧化作用及亞硝酸鹽異化還原等其他氮素循環(huán)過程。此外，在硝化過程的研究中，全程硝化過程(complete nitrification) 的發(fā)現(xiàn)也不斷豐富著人們對硝化作用的認識[46]。隨著研究的不斷深入，嘗試使用基因芯片、宏轉(zhuǎn)錄組、代謝組學以及多組學等手段，在對土壤氮素循環(huán)過程的研究中，將不斷會有新途徑、新功能微生物以及功能基因被發(fā)現(xiàn)和認知，也由此決定下一步的研究方向。