陳奇娜，王 斌，郭 慶，王 靜，黃 偉，王 霄，紀(jì) 華

(1.大理大學(xué) 藥學(xué)院，云南 大理 671000；2.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；3.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650032)

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是在DNA序列的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上加一個(gè)甲基的重要表觀修飾酶，DNMT分為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B[1]，DNA甲基化修飾可在DNA復(fù)制過程中經(jīng)細(xì)胞分裂并遺傳給下一代，這種修飾通常與基因沉默有關(guān)，被認(rèn)為是構(gòu)成性和兼性異染色質(zhì)形成的重要因素[2]．此外，DNA高甲基化也被證明是用來維持基因的永久沉默[3]．因此，DNA甲基化被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因沉默[4]的重要原因．近年來，CHO-K1細(xì)胞越來越多地用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)，以及克服轉(zhuǎn)基因沉默等以提高CHO-K1高效表達(dá)的手段而備受關(guān)注．因而，獲得DNA甲基化缺陷并穩(wěn)定高效表達(dá)的CHO細(xì)胞株已成為產(chǎn)業(yè)界追求的目標(biāo)．

CRISPR/Cas9是用于基因編輯的前沿方法，以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景．例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病．此外，該技術(shù)的成果已應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾[5-6]．通過設(shè)計(jì)含有20個(gè)核苷酸的sgRNA(small guide RNA)，并且sgRNA與核苷酸序列為 NGG 的PAM序列相鄰；sgRNA和靶標(biāo)DNA之間的互補(bǔ)堿基配對(duì)，sgRNA引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶接近基因組中的任意DNA序列，Cas9-DNA的相互作用以及相關(guān)的構(gòu)象變化驅(qū)動(dòng)R-loop的形成和在靶向基因組DNA中進(jìn)行雙鏈斷裂(DSB)．雙鏈斷裂后DNA修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)并催化非同源端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)．對(duì)于NHEJ，丟失的序列可能無法恢復(fù)，導(dǎo)致序列插入或缺失，以及基因功能喪失．而對(duì)于HDR，引入外源DNA模板將填補(bǔ)DSB，從而進(jìn)行基因敲入、刪除、調(diào)整或突變[7-8]．

CHO細(xì)胞主要包括CHO-dxb11、CHO-K1、CHO-dg44和CHO-s等多種細(xì)胞系[9-11]．隨著CHO細(xì)胞培養(yǎng)條件的不斷改進(jìn)優(yōu)化，比如，改進(jìn)培養(yǎng)溫度、馴化貼壁細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、無胎牛血清培養(yǎng)等，可以獲得不同表觀遺傳背景的細(xì)胞系用于提高工業(yè)化生產(chǎn)中蛋白的表達(dá)量．雖然已有CHO-K1中甲基化酶基因DNMT3A、DNMT3B基因敲除后的報(bào)道[12-16]，但是，可能存在因?yàn)榛蚯贸悬c(diǎn)的區(qū)別、不同甲基化背景的CHO-K1細(xì)胞甲基化酶基因敲除后誘變條件的不同，導(dǎo)致表觀遺傳背景差別，以及獲得的細(xì)胞系高效表達(dá)的潛質(zhì)完全不相同，因此，篩選DNMT3B基因特異位點(diǎn)敲除的特異細(xì)胞系仍然很有必要．

本研究利用CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，通過優(yōu)化的軟瓊脂培養(yǎng)法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)的 CHO-K1 細(xì)胞進(jìn)行靶向sgRNA設(shè)計(jì)、細(xì)胞篩選和陽性克隆鑒定等，以期得到具有高效表達(dá)潛力的DNMT3B基因特異位點(diǎn)敲除的CHO-K1細(xì)胞系．

1 材料與方法

1.1 靶向DNMT3B基因的sgRNAs設(shè)計(jì)

根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則[17-18]，設(shè)計(jì)大于20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的sgRNAs[19]．同時(shí)選擇DNMT3B基因第4個(gè)外顯子3個(gè)不同的靶點(diǎn)序列(表1)，通過體外實(shí)驗(yàn)，從中篩選出效率較高的sgRNA，以增加成功率和增強(qiáng)敲除效率[8]，CRISPR/Cas基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1所示．

表1 sgRNA設(shè)計(jì)序列

圖1 CRISPR/Cas基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.2 引物合成

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)DNMT3B基因第4外顯子的檢測(cè)引物(表2),引物由上海生工生物工程有限公司合成．

表2 引物序列

1.3 轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素篩選

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 d，將24孔板的培養(yǎng)基換成不含抗生素的血清．當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染．轉(zhuǎn)染效率最佳的為 10 μL 體系，轉(zhuǎn)染試劑 3.6 μL，質(zhì)粒 1.2 μg．步驟如下：加 3.6 μL 轉(zhuǎn)染液到無抗生素培養(yǎng)基中，孵育 5 min；加 1.2 μg 的質(zhì)粒到無抗生素培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染液中孵育 20 min；24孔板換液 490 μL 無抗生素培養(yǎng)基；將孵育好的轉(zhuǎn)染試劑和DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)基中輕柔混勻．設(shè)置3個(gè)重復(fù)和陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察3個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)染效率相差不大，陰性對(duì)照沒有熒光．轉(zhuǎn)染 24 h 后加入 12 μL 的嘌呤霉素，培養(yǎng) 4 d．

1.4 單克隆篩選

本實(shí)驗(yàn)采用軟瓊脂法挑取單克?。渲媒K質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%瓊脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的下層瓊脂，以及終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%瓊脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的上層瓊脂鋪板到 5 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中[20]．細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞篩過濾以后，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞加入上層瓊脂中．

通常鋪板 14 d 左右，肉眼可以觀察到針尖樣的單克隆細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞鋪軟瓊脂期間每隔2～3 d，往軟瓊脂中加入 200 μL 的培養(yǎng)基，避免軟瓊脂過于干燥．當(dāng)肉眼能看到單克隆細(xì)胞團(tuán)時(shí)，用鑷子挑出單克隆到96孔板中將細(xì)胞團(tuán)吹散．

1.5 TE1酶切

1.5.1 反應(yīng)體系

T7E1核酸內(nèi)切酶反應(yīng)體系見表3．

表3 T7E1核酸內(nèi)切酶反應(yīng)體系

1.5.2 酶切反應(yīng)程序

95 ℃ 5 min；95～85 ℃ -2 ℃/s；85～25 ℃ -0.1 ℃/s；4 ℃；置于PCR儀中反應(yīng)結(jié)束后，加入 0.5 μL 的T7E1內(nèi)酶，嚴(yán)格冰上操作；加入T7E1內(nèi)切酶后，37 ℃ 反應(yīng) 0.5 h 后，立刻跑電泳，電泳槽TAE每次換成新的．

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆細(xì)胞中DNMT3B基因的鑒定

2.1.1 DNMT3B基因片段鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)染sgRNA的質(zhì)粒，用嘌呤霉素篩選后，通過對(duì)獲得的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂法篩選，并對(duì)獲得的單克隆進(jìn)行DNMT3B基因鑒定，擴(kuò)增片段大小為483 bp(圖2)，確定為篩選引物擴(kuò)增的目的片段．

2.1.2 基因敲除陽性細(xì)胞篩選

為了確認(rèn)獲得的單克隆是否發(fā)生基因編輯，利用T7E1酶切切割DNMT3B基因，而T7E1 核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別由于堿基缺失或改變?cè)斐刹煌耆パa(bǔ)配對(duì)的雜合雙鏈 DNA，進(jìn)行DNA切割，對(duì)野生型則不會(huì)產(chǎn)生切割．如圖3所示，1號(hào)、2號(hào)為DNMT3B-1單克隆T7E1酶切1號(hào)體系和2號(hào)體系(表3)切開的條帶，7號(hào)、8號(hào)為DNMT3B-2單克隆T7E1酶切的1號(hào)體系和2號(hào)體系(表3)切開的條帶，均切開3條條帶．

M:Marker;1:DNMT3B-1，用DNMT3B引物擴(kuò)增；2:DNMT3B-2，用DNMT3B引物擴(kuò)增．圖2 DNMT3B 基因片段PCR鑒定結(jié)果

圖3 單克隆篩選酶切鑒定結(jié)果

隨后，將T7E1酶切切開的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA克隆，菌落PCR，陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，小提質(zhì)粒，DNA測(cè)序比對(duì)，確定該單克隆基因敲除了25 bp(圖4a)和敲除了10 bp(圖4b)成功，并進(jìn)一步通過比對(duì)，確定基因敲除位點(diǎn)發(fā)生在第4外顯子上(圖4c)．

2.2 DNMT3B基因特異位點(diǎn)的細(xì)胞篩選

基于上述基因鑒定結(jié)果，確定DNMT3B基因敲出背景清楚的單克隆，再通過有限稀釋法對(duì)單克隆進(jìn)行重篩選．分別獲得DNMT3B第4個(gè)外顯子上刪除25 bp和10 bp的特異的細(xì)胞株，普通顯微鏡下顯示細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好(圖5a)．為進(jìn)一步確定單克隆均一性，用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行分析其熒光均一度(圖5b)．

圖4 DNMT3B-1、DNMT3B-2單克隆測(cè)序結(jié)果

圖5 DNMT3B-1、DNMT3B-2單克隆細(xì)胞

3 討論

DNMT3B基因由23個(gè)外顯子組成．本文通過CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，分別獲得DNMT3B第4個(gè)外顯子上刪除25 bp和10 bp的特異的細(xì)胞株．雖然已有利用CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，將CHO-K1甲基化酶基因DNMT3B中第1個(gè)外顯子上的一部分片段的基因敲除的報(bào)道[12]，但是該文與本文的基因敲除靶點(diǎn)完全不同，并且敲除的片段長(zhǎng)度也不同，因而有可能對(duì)細(xì)胞的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)層面，如開放染色質(zhì)、染色質(zhì)環(huán)、或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域[21]等造成不同的影響，導(dǎo)致獲得基因敲除細(xì)胞的表觀遺傳背景可能完全不同．另外，不同甲基化背景的CHO-K1細(xì)胞經(jīng)甲基化酶基因缺失后獲得的細(xì)胞表觀遺傳背景也可能有差別．由于不同的表觀遺傳背景差異，不同的DNMT3B基因敲除的細(xì)胞系可能在篩選高效表達(dá)細(xì)胞系的潛質(zhì)完全不相同．因此，本研究獲得的DNMT3B基因特異位點(diǎn)敲除的特異細(xì)胞系仍然具有一定的創(chuàng)新性．

本研究所采用的CRISPR/Cas9方法在單克隆細(xì)胞的篩選上利用軟瓊脂法，不同于與已有報(bào)道[12-15]的DNMT3B、DNMT3A基因敲除研究中用到的流式分選或者96孔板稀釋法．流式分選法的優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)省力，但與其他單克隆篩選的方法相比，費(fèi)用較高，并且有容易污染、細(xì)胞膜容易受損等缺點(diǎn)．有限稀釋法作為傳統(tǒng)篩選方法，優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單、成本較低[22]；缺點(diǎn)是單克隆得率低．而軟瓊脂法操作簡(jiǎn)單、成本較低，并且得到的單克隆細(xì)胞均質(zhì)性更好，但是生長(zhǎng)環(huán)境完全不同于有限稀釋法的96孔板，因此對(duì)獲得的細(xì)胞的表觀遺傳背景也可能產(chǎn)生不同的影響．雖然獲得的DNMT3B基因缺陷的單克隆細(xì)胞已經(jīng)過嚴(yán)格的測(cè)序鑒定，并且熒光分析結(jié)果顯示單克隆較為均一，但是，仍然需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，并在后續(xù)應(yīng)用于高效表達(dá)細(xì)胞篩選研究中對(duì)其表觀遺傳背景進(jìn)行深入分析．