非洲堇葉片試管快繁體系技術(shù)研究

李佳蔓, 曹昆彬, 黃振, 陳炙, 郭洪英

四川省林業(yè)科學(xué)研究院, 四川 成都 610081

非洲堇又名非洲紫羅蘭，拉丁學(xué)名：Saintpaulia ionanthaWendl.，為苦苣苔科非洲堇屬植物，多年生常綠草本。非洲堇為聚傘花序、腋生、花序高出葉叢、每個花莖上1朵或數(shù)朵并生、花冠平展[1]?；ò觐愋陀袉伟?、半重瓣、重瓣、皺瓣等，花型有花邊型、三色堇型、星型、斑紋型、波浪型、胡蜂花型、鐘花型、管花型等，花色幾乎包含了除大紅和黃色外的各種顏色[2-4]。非洲堇栽培條件簡單，室內(nèi)具有散射光的窗邊，適宜人居住的空調(diào)環(huán)境等即可滿足其生長需要，而且只要養(yǎng)護(hù)得當(dāng)，一年四季均可開花，是優(yōu)良的窗臺、案頭點(diǎn)綴花卉，被譽(yù)為“室內(nèi)花卉皇后”[5-6]。另外，其品類繁多，至2005年，美國非洲紫羅蘭協(xié)會正式登記的非洲堇品種已超過9 500種，而未登記或未命名的估計在20 000種以上[2]。我國于20世紀(jì)80年代開始從美國和荷蘭引種非洲堇試管苗，目前少數(shù)中外合資園藝公司僅有小批量的生產(chǎn)，栽培尚不普遍，但發(fā)展前景依然很好。

研究擬針對非洲堇某些新奇品種開展組織培養(yǎng)技術(shù)研究，開發(fā)非洲堇新奇品種高效組培再生技術(shù)體系，快速繁殖優(yōu)良品種，為非洲堇新奇品種的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究材料購買于正規(guī)種苗公司，共13個品種，材料背景清晰（見表1）。

表1 非洲堇外植體來源信息Tab.1 Source information of Saintpaulia explants

1.2 方法

（1）外植體選擇

選擇顏色深綠、形態(tài)飽滿的非洲堇植株中部完整葉片作為外植體材料，用毛刷輕刷以除去雜質(zhì)，流水沖洗3～5 min，撈出置于平盤中，用吸水濾紙吸干表面水分。

（2）消毒處理

在超凈工作臺上消毒清洗后（消毒處理方案見表2），用無菌吸水濾紙吸干表面水分，切分成1 cm2左右大小方塊，接種于附加蔗糖濃度為30 g·L-1、卡拉膠濃度6.5 g·L-1的MS培養(yǎng)基上。每個消毒處理接種10個方塊（每瓶一個外植體），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。光照強(qiáng)度2000 Lux～3000 Lux，培養(yǎng)溫度25±3℃（如無特殊說明，培養(yǎng)條件下同）。第5天開始記錄污染率、褐化率，到第15天，統(tǒng)計整個過程的污染率、褐化率，計算無菌外植體獲得率。

表2 非洲堇外植體消毒方案Tab.2 Sterilization plan for Saintpaulia explants

（3）愈傷出芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基篩選

無菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率，計算單個外植體平均出芽個數(shù)和正常不定芽率。以期篩選最佳愈傷出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的正常不定芽分成單株或3～4個芽為一叢，接種于含有6-BA、NAA、IBA不同濃度配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，采用3因素3水平的L9（3）4正交試驗(yàn)設(shè)計，用以篩選較佳的非洲堇增殖培養(yǎng)基配方，設(shè)計及結(jié)果見表5、表6。25～30天繼代1次，連續(xù)培養(yǎng)3代，統(tǒng)計有效增殖芽數(shù)，計算有效增殖系數(shù)。

（4）生根培養(yǎng)

以大量元素減半的MS培養(yǎng)基（以下簡稱1/2MS）為非洲堇生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，蔗糖減半，添加不同濃度配比的IBA和NAA，預(yù)設(shè)IBA濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA濃 度 分 別 為0.02、0.05、0.08 mg·L-1，采用完全試驗(yàn)設(shè)計，以期篩選出較佳的非洲堇生根培養(yǎng)基激素濃度配比。選取有效不定芽接種于生根培養(yǎng)基中，15天后統(tǒng)計生根率及根系長勢。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2015和SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理分析，Origin 2019進(jìn)行繪圖。

污染率（%）=污染的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100%；

褐化率（%）=褐化的外植體數(shù)／無菌外植體總數(shù)×100%；

無菌外植體獲得率（%）=1-污染率-褐化率-致死率；

愈傷誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷的無菌外植體數(shù)／接種無菌外植體總數(shù)×100%；

不定芽誘導(dǎo)率（%）=發(fā)生不定芽的無菌外植體數(shù)量／接種無菌外植體總數(shù)×100%；

單個外植體不定芽平均發(fā)生個數(shù)=不定芽總數(shù)／發(fā)生不定芽外植體數(shù)；

正常不定芽率（%）=正常不定芽數(shù)／不定芽總數(shù)×100%；

有效增殖系數(shù)=有效不定芽總數(shù)／接種不定芽數(shù)；

有效不定芽：即培養(yǎng)一個周期后，完整葉心四周均勻著生著形態(tài)完整的葉片不少于5片。

畸形不定芽：葉心無發(fā)育或發(fā)育不全、葉片發(fā)育不全等的非正常不定芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒效果與無菌外植體獲得

兩種消毒劑對非洲堇外植體的消毒效果隨作用時間推移變化趨勢大致相同，均為先升高后降低的趨勢，并且兩種消毒劑均能對非洲堇外植體起到較好的消毒作用，0.1% HgCl2作用5 min和10% 84（有效成分NaClO，有效含氯量8 000～10 500 mg/L）作用8 min，無菌外植體獲得率分別為67.9%和72.8%。消毒劑作用時間過短達(dá)不到消毒效果，過長使外植體組織受到破壞失去活性，致死率增加（見圖1）。

圖1 不同消毒方案的消毒效果Fig.1 Disinfection effect of different sterilization plan

其中，處理7較適合非洲堇外植體消毒，13個品種均獲得了無菌外植體，但同種消毒方式對不同品種非洲堇外植體的消毒效果呈現(xiàn)極顯著差異，消毒效果最好的品種為莓果泡芙，獲得率78.93%；其次為魔法懸垂，獲得率76.65%，消毒效果最差的為品種為暗戀，獲得率僅為48.82%（見表3）。

表3 無菌外植體獲得Tab.3 Acquisition of sterile explants

2.2 愈傷出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表明（見表4）：在不同激素濃度配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，非洲堇無菌外植體的愈傷誘導(dǎo)率（A）、不定芽誘導(dǎo)率（B）、單個外植體不定芽平均發(fā)生個數(shù)（C）、有效不定芽率（D）均存在極顯著差異（P＜0.01），表明6-BA和NAA是非洲堇愈傷誘導(dǎo)的2個關(guān)鍵因子。

表4 非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)方差分析Tab.4 Variance analysis of callus bud induction of Saintpaulia ionantha

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)Duncan法多重比較結(jié)果表明（見表5）：隨著6-BA濃度增高，A、B、C三個指標(biāo)隨之增高，而指標(biāo)D則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；當(dāng)NAA濃度升高時（處理5、7、8），指標(biāo)A、B、C隨之升高，但差異不顯著，指標(biāo)D逐漸降低且差異極顯著，這主要由于激素濃度過高，畸形芽發(fā)生比例上升，畸形芽上升個數(shù)和不定芽上升個數(shù)的比值增大。當(dāng)6-BA≥0.15 mg·L-1、NAA≥0.1 mg·L-1時，單個外植體不定芽發(fā)生個數(shù)在15～50個間，平均在25.4～3.65個間，正常芽發(fā)生個數(shù)在8～32個間，平均在13.5～20.1個間，當(dāng)6-BA為0.15 mg·L-1、NAA為0.1 mg·L-1時（處 理4），A為65.9%，B為58.0%，此處理?xiàng)l件下，不定芽發(fā)生時間大致相同，生長較為一致，且C為25.42%，D達(dá)78.9%，平均正常芽個數(shù)20.1個（見圖2A）。

表5 非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)Tab.5 Callus bud induction of Saintpaulia ionantha

因此認(rèn)為，處理4為較好的非洲堇誘導(dǎo)培養(yǎng)激素組合，即MS+蔗糖30 g·L-1+卡拉膠6.5 g·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為非洲堇較佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

正交試驗(yàn)方差分析（見表6）可知，影響因子中，6-BA濃度對非洲堇有效增殖系數(shù)（D）具有顯著影響（P＜0.05），NAA、IBA濃度對非洲堇增殖系數(shù)影響不顯著（P＞0.01），極差分析（見表7）表明：3個因素的主次關(guān)系為：甲＞乙＞丙，即6-BA＞NAA＞IBA，且6-BA對非洲堇增殖系數(shù)的影響是后兩者的近3倍。Duncan法多重比較結(jié)果顯示，非洲堇繼代增殖培養(yǎng)的最佳激素配比為甲2乙2丙3，及6-BA、NAA、IBA分別為0.2、0.1、0.15 mg·L-1平均有效增殖系數(shù)可達(dá)6.43（見圖2B）。

表6 方差分析結(jié)果Tab.6 Results of ANOVA analysis

表7 增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Tab.7 Design and results of proliferation cultureorthogonal experiment

2.4 生根培養(yǎng)基篩選

生根試驗(yàn)表明（見表8和圖3），當(dāng)NAA濃度一定時，非洲堇生根率隨IBA濃度的升高呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢（處理1～3），同理，當(dāng)IBA濃度一定時，NAA對非洲堇生根的影響也表現(xiàn)出相同的趨勢（處理4～6）。當(dāng)IBA為1.0 mg·L-1、NAA為0.05 mg·L-1時（處理5），平均生根率92.67%，生根數(shù)14～50條/株，平均生根數(shù)＞20條/株，此時，苗健壯、基部愈傷少、根系發(fā)達(dá)（見圖2-C）。當(dāng)IBA＞1.0 mg·L-1、NAA＞0.05 mg·L-1時，隨著兩種激素濃度的上升，生根率上升極為緩慢（處理6、8、9），尤其當(dāng)NAA為0.1 mg·L-1時，苗基部愈傷較多，移栽時根容易受損（見圖2-D），因此選用處理5為非洲堇較佳的生根培養(yǎng)基激素濃度配比。

表8 非洲堇生根試驗(yàn)設(shè)計Tab.8 Rooting experiment design of Saintpaulia ionantha

圖2 非洲堇組織培養(yǎng)各階段圖片F(xiàn)ig.2 Different stages pictures of tissue culture of Saintpaulia ionantha

圖3 不同激素配比對非洲堇生根的影響Fig.3 Effect of different hormone ratios on the rooting of Saintpaulia ionantha

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，0.1% HgCl2和10% 84只要在合理的作用間范圍內(nèi)均能使非洲堇葉片得到較好的消毒效果（無菌外植體獲得率＞65%），但HgCl2屬劇毒化學(xué)品[7]，需特殊儲存場所，廢液處理也有特定要求，今后可嘗試使用有效成分為NaClO的消毒液進(jìn)行消毒，以期在脫毒的同時達(dá)到保護(hù)環(huán)境的效果。

外源激素種類和濃度配比決定植物組織培養(yǎng)過程中器官分化的方向。6-BA和NAA配合使用，可以使非洲堇葉片誘導(dǎo)愈傷和愈傷出芽一步完成，這與婁淵樣[8]對非洲堇組培一次成苗技術(shù)研究有相似之處，不同之處在于激素濃度，本研究中，在6-BA 0.15 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中，非洲堇的愈傷誘導(dǎo)率為65.93%，同時不定芽誘導(dǎo)率58.11%，單個外植體不定芽（無根）平均發(fā)生個數(shù)為25.42個，而婁發(fā)現(xiàn)在6-BA和NAA均為0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，一個葉塊上可長出數(shù)棵帶根的完整小苗，導(dǎo)致不同結(jié)果主要與材料基因型、試驗(yàn)方法、內(nèi)源激素種類和含量等因素有關(guān)。正交試驗(yàn)表明，6-BA、NAA、IBA 3種激素，僅6-BA是非洲堇繼代增殖的主要影響因子，該結(jié)果與紀(jì)麗麗[9]的研究結(jié)果雷同，她認(rèn)為6-BA對大花重瓣型非洲紫羅蘭芽分化、增殖起決定性作用，但增殖倍數(shù)與6-BA和NAA的濃度比值有關(guān)。組培苗誘導(dǎo)生根過程中，IBA和NAA是常用的兩種激素，根據(jù)培養(yǎng)材料不同，兩種激素單獨(dú)使用或配合使用以達(dá)到生根目的。朱立明[10]以大花重瓣型非洲紫羅蘭組培無根苗作為試驗(yàn)材料，培養(yǎng)基附加0.1 mg·L-1NAA生根率可達(dá)82.1%，且根粗壯而長；耿明清[11]在培養(yǎng)基中附加0.2 mg·L-1IBA，非洲紫羅蘭試管苗生根效果好；何家濤[12]單獨(dú)使用NAA或IBA或IAA均能使非洲紫羅蘭無根苗生根，且生根率在97%以上；本研究采用兩種激素配合使用，當(dāng)IBA和NAA分別為1.5和0.05 mg·L-1時，非洲堇生根效果理想。