張雪翠 孫素麗 盧為國 李海朝 賈巖巖 段燦星 朱振東,*

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081; 2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 河南鄭州 450002

大豆[Glycine max(L.) Merrill]含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂和人體所需要的多種微量元素, 是世界上重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物。我國是大豆主要生產(chǎn)國, 目前生產(chǎn)規(guī)模居世界第5位[1]。在生產(chǎn)中, 病害是制約大豆產(chǎn)量的重要因素, 其中由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是破壞性的大豆病害之一, 廣泛發(fā)生于世界各主要大豆產(chǎn)區(qū), 嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。在中國, 大豆疫霉根腐病首先于1989年在東北被發(fā)現(xiàn)[3], 隨后該病害的發(fā)病區(qū)域不斷擴(kuò)大, 成為影響我國大豆生產(chǎn)的主要病害[4-5]。

大豆疫霉是一種土傳性病原菌, 通過土壤、水流等進(jìn)行傳播和蔓延, 其卵孢子可以在土壤中存活數(shù)年, 在高濕度條件下卵孢子萌發(fā)形成孢子囊,遇水釋放游動(dòng)孢子侵染植株。大豆疫霉在大豆的整個(gè)生育時(shí)期都能侵染, 導(dǎo)致出苗前和出苗后死亡、苗期猝倒或成株期根莖腐。目前, 培育和種植抗病品種是控制大豆疫霉根腐病最為有效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的方法[2,6]。大豆對大豆疫霉的抗性包括由單個(gè)顯性基因控制的質(zhì)量抗性和由多個(gè)微效基因控制的數(shù)量抗性, 其中質(zhì)量抗性為研究的重點(diǎn)[7]。目前, 國內(nèi)外已在大豆 2號、3號、7號、10號、13號、14號、16～19號染色體上鑒定了30多個(gè)抗疫霉根腐病基因[2,8-10]。大豆與大豆疫霉的互作符合基因?qū)虻年P(guān)系, 在抗病品種選擇壓力下, 大豆疫霉容易產(chǎn)生新的毒力型, 從而導(dǎo)致抗病品種的抗性喪失[11-13]。因此, 需要不斷培育和利用新的抗病品種。

河南省近年來大豆種植面積約 57.33萬公頃,位居全國第 4位[14], 在悠久的大豆栽培過程中,通過與病原菌的相互作用及人為選擇, 河南大豆蘊(yùn)藏了豐富的抗病性資源。國內(nèi)外研究表明, 河南大豆品種及資源普遍存在對大豆疫霉根腐病的抗性[15-16], 其中許多品種具有廣譜的抗病性。目前,部分河南大豆品種所含的優(yōu)異抗疫霉根腐病基因已被鑒定[17-19]。大豆品種鄭97196是國內(nèi)篩選到的大豆疫霉根腐病優(yōu)異抗源之一[17,20]。張海鵬等[19]將鄭97196抗大豆疫霉根腐病基因初步定位在大豆3號染色體上, 定名為RpsZheng。最近, 我們對鄭97196抗疫霉根腐病基因RpsZheng進(jìn)行了精細(xì)定位, 并開發(fā)了一個(gè)能夠有效檢測該基因的共分離InDel標(biāo)記 WZInDel11[21]。

雖然河南省尚未有大豆疫霉根腐病嚴(yán)重發(fā)生的報(bào)道, 但有研究證明該地區(qū)存在大豆疫霉及致病型多樣性, 并且與其臨近的山東省、安徽省均有大豆疫病發(fā)生的報(bào)道, 表明具有大豆疫霉根腐病發(fā)生的潛在威脅[4,22]。目前, 河南省有目的抗疫霉根腐病的大豆育種尚未開展, 新育成的品系對大豆疫霉根腐病的抗性及基因型不明確, 因此, 在生產(chǎn)上推廣利用存在大豆疫霉病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本研究對64個(gè)河南省新育成的大豆品系進(jìn)行大豆抗疫霉根腐病鑒定,并利用RpsZheng的共分離標(biāo)記進(jìn)行抗病基因檢測,旨在為這些品系的推廣利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

64個(gè)河南大豆新品系、感病對照品種Williams和抗病品種鄭 97196分別由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供(表 1)。

1.2 大豆疫霉

大豆疫霉分離物 Ps41-1由本實(shí)驗(yàn)室分離保存,PsJS2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授提供(表1)。Ps41-1為我國東北地區(qū)大豆優(yōu)勢毒力分離物(毒力型: 1a,1b, 1d, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7, 8), PsJS2為強(qiáng)毒力分離物(毒力型:1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7,8), 所有的大豆疫霉分離物使用時(shí)均在 V8汁瓊脂培養(yǎng)基上活化[23], 在24℃培養(yǎng)8～10 d, 用于接種。

1.3 抗病性鑒定

分別選取抗病對照鄭97196、感病對照Williams以及 64個(gè)河南大豆新品系 15粒種子, 播種在以蛭石為基質(zhì)的1000 mL的紙杯中, 播種后在25℃溫室培養(yǎng); 每個(gè)品系播種 2杯, 分別用于接種大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2。待植株第1對真葉展開后,采用下胚軸創(chuàng)傷接種法進(jìn)行抗性鑒定[18], 接種時(shí),先用注射器針頭在大豆植株子葉下方1 cm處下胚軸劃一道長約1 cm的傷口, 再用注射器在傷口處注射約 0.2 mL的接種體。接種后的植株置于溫度為23～25℃、濕度為100%的保濕間內(nèi)保濕48 h, 然后轉(zhuǎn)入25℃溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 d后進(jìn)行表型調(diào)查[24-25]?？剐栽u價(jià)參照鐘超等[26]的標(biāo)準(zhǔn), 每個(gè)品種的死亡率小于或等于 30%, 記為抗病(resistant, R); 植株死亡率在30%～70%之間, 記為中間類型(intermediate, I);植株死亡率大于或等于 70%, 記為感病(susceptible,S)。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4 大豆基因組DNA的提取

分別等量采集每個(gè)大豆品系 10株健康幼嫩葉片, 混合于2 mL試管中用于大豆基因組DNA的提取。采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱)(天根生物科技有限公司, 中國北京)提取大豆基因組DNA, 具體步驟參照試劑盒的使用說明。

1.5 標(biāo)記鑒定

用鄭97196大豆抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標(biāo)記 WZInDel11進(jìn)行大豆品系分子標(biāo)記檢測[21]。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成InDel標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系為10 μL, 包含上下游引物各 0.2 μL、2 ×TaqPCR MasterMix (天根生物科技有限公司) 4 μL、模板 DNA 2 μL (20 ng), dd H2O 補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min, 4℃保溫。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定

抗病性鑒定結(jié)果表明, 感病對照品種 Williams對 2個(gè)大豆疫霉分離物均表現(xiàn)為感病, 抗病對照品種鄭97196對2個(gè)大豆疫霉分離物均表現(xiàn)為抗病。圖1顯示了鑒定的64個(gè)大豆新品系對2個(gè)分離物的抗、感反應(yīng)比例。表1列出了每個(gè)品系對2個(gè)大豆疫霉分離物的抗性反應(yīng)型。64個(gè)新品系中, 對大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2表現(xiàn)為抗病的分別有35個(gè)和 16個(gè), 分別占 54.7%和 25.0%, 對 Ps41-1和PsJS2表現(xiàn)為中間反應(yīng)的分別有16個(gè)和10個(gè)品系,分別占25%和15.6%; 對Ps41-1和PsJS2表現(xiàn)為感病的分別有 13個(gè)和 38個(gè)品系, 分別占 20.3%和59.4%。洛豆 16106、開豆 1106、鄭豆 1304、洛豆16095、周豆47、鄭豆1526、周豆43、周豆45、鄭1307、周豆 38、安豆 5919、安豆 6223、周豆 37、安豆1498、鄭1807、漯8826共16個(gè)品系同時(shí)抗2個(gè)大豆疫霉分離物 Ps41-1和 PsJS2, 占鑒定品系的25% (表 1)。

2.2 標(biāo)記基因型鑒定

張雪翠等[21]開發(fā)了一個(gè)廣譜抗大豆疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標(biāo)記WZInDel11, 本研究利用該標(biāo)記對64個(gè)品系進(jìn)行RpsZheng基因檢測(表1和 圖2)發(fā)現(xiàn), 洛豆 16106、鄭豆1304、洛豆16095、周豆47、鄭豆1526、周豆43、周豆45、鄭1307、安豆5919、安豆6223、周豆37、鄭1807、周豆38、漯 8825、駐豆 37、泛豆 22、鄭 15234、漯豆 8816共18個(gè)大豆品系含有WZInDel11標(biāo)記, 占檢測總數(shù)的28.1% (表1)。其中有5個(gè)對1個(gè)或2個(gè)分離物表現(xiàn)為抗感分離的中間型品系(鄭15234、漯8825、漯豆8816、駐豆37和泛豆22)出現(xiàn)了雜合基因型(表1和圖 2), 表明基因型與表型結(jié)果相一致, 也表現(xiàn)為抗感分離。

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本研究進(jìn)一步利用標(biāo)記WZInDel11對出現(xiàn)雜合基因型的漯豆8816的6個(gè)感病單株和4個(gè)抗病單株進(jìn)行分子檢測表明, 6個(gè)感病單株均擴(kuò)增出了WZInDel11的感病目標(biāo)片段, 而 4個(gè)抗病單株有 2個(gè)單株擴(kuò)增出了WZInDel11的抗病目標(biāo)片段, 另外2個(gè)抗病單株擴(kuò)增出了抗病和感病目標(biāo)片段, 其基因型表現(xiàn)為抗、感分離的雜合基因型(圖3)。表明表型為抗病的單株基因型存在純合抗病及抗感分離雜合基因型。

3 討論

本研究對河南省近年來新培育的64個(gè)大豆品系進(jìn)行對2個(gè)大豆疫霉分離物的抗性鑒定發(fā)現(xiàn), 有51個(gè)品系對1個(gè)或2個(gè)大豆疫霉分離物表現(xiàn)為抗病或中間反應(yīng), 將中間反應(yīng)型歸為抗病反應(yīng)[18,26], 抗病品系占鑒定品系的 79.7%, 這表明河南省近期育成的大豆新品系繼續(xù)保持對大豆疫霉根腐病高水平的抗性[20]。

采用對大豆疫霉根腐病具有廣譜抗性基因RpsZheng的共分離標(biāo)記WZInDel11對64個(gè)品系進(jìn)行抗病基因的分子檢測發(fā)現(xiàn), 周豆37、周豆38、周豆43、周豆45、周豆47、鄭豆1304、鄭1307、鄭豆 1526、鄭15234、鄭 1807、漯 8825、漯豆8816、洛豆 16095、洛豆 16106、安豆 5919、安豆 6223、駐豆 37、泛豆 22共 18個(gè)大豆品系中檢測到WZInDel11的抗病目標(biāo)片段。WZInDel11為RpsZheng基因的共分離標(biāo)記, 我們的前期研究表明,攜帶Rps1c、RpsYD25和RpsYD29基因的大豆品種也含有該標(biāo)記[21], 因此 WZInDel11標(biāo)記可以作為Rps1基因座部分等位基因或緊密連鎖基因的檢測標(biāo)記[18](鐘超, 未發(fā)表數(shù)據(jù)), 通過抗性反應(yīng)型和系譜分析推測出含有 WZInDel11標(biāo)記的大豆品種(系)的抗疫霉根腐病基因。本研究發(fā)現(xiàn), 所有含有WZInDel11標(biāo)記的品系對2個(gè)大豆疫霉分離物均表現(xiàn)為抗病型, 表明一些品系含有相同的抗疫霉根腐病基因。漯8816和漯8825的父本均為鄭97196, 抗病基因應(yīng)該來源于鄭97196, 表明2個(gè)品系所含基因?yàn)镽psZheng[21]。豫豆 29為洛豆 16106和鄭 15234的親本之一, 2個(gè)品系的抗性應(yīng)該起源于豫豆29, 因此含有RpsYD29[18]。鄭豆1526、鄭豆1304和鄭1307的親本之一為鄭9805, 鄭9805由豫豆23和豫豆22雜交育成, 推測這 3個(gè)品系的抗病基因來源于豫豆23, 含有RpsZheng或其等位基因[21,28]; 周豆47的親本之一為皖宿2156, 而皖宿2156由中作975和豫豆23 (鄭交8739-47)雜交育成, 因此, 周豆47的抗病基因應(yīng)該來源于豫豆23, 推測其含有RpsZheng或等位基因[21,29]。周豆37、周豆38、鄭1807、周豆43和周豆45親本之一為周豆23或菏豆20, 這2個(gè)品種與鄭97196、豫豆23和豫豆25具有共同祖先, 推測這些品系含有RpsZheng、RpsYD25、RpsYD29或新的等位基因[21,27,30], 安豆6223和安豆5919的一個(gè)親本為安豆5156, 安豆5156以周9521-3-4為母本、獲黃三選-3為父本雜交育成[31], 周 9521-3-4與鄭97196、豫豆 29具有相同的抗大豆疫霉譜和相同的Rps1基因座單倍型[32], 因此, 我們推測, 安豆 6223和安豆5919可能含有RpsZheng或RpsYD29。駐豆37、洛豆10695和泛豆22的親本與鄭97196、豫豆23、豫豆25、豫豆29的親緣關(guān)系不明確, 推測含有新RpsZheng等位基因。

大豆疫霉分離物 PsJS2為江蘇省分離到的強(qiáng)毒力分離物, 能夠克服除Rps9、RpsQ、RpsHC18、RpsX、RpsZheng以外的其他已知抗疫霉根腐病基因, 因此,對 PsJS2表現(xiàn)抗病的大豆品種(系)很可能含有新的基因。本研究抗性鑒定結(jié)果表明, 開豆 1106、鄭1659、漯豆 8826、宛黃 7號、鄭 1227、鄭 1205、安豆 1498對 2個(gè)大豆疫霉分離物 Ps41-1和 PsJS2都表現(xiàn)為抗病反應(yīng)或中間反應(yīng)型, 但分子檢測這些品系中不含有WZInDel11抗病目標(biāo)片段, 表明這些品系可能含有新的廣譜抗疫霉根腐病基因。最近,張志民等[33]鑒定77份大豆品種(系)對8個(gè)大豆疫霉菌株的抗性反應(yīng)發(fā)現(xiàn), 安豆1498是唯一一個(gè)對8個(gè)分離物表現(xiàn)為抗病的品系, 推測其可能攜帶新的抗病基因或新的抗病基因組合。本研究也發(fā)現(xiàn), 安豆1498是唯一一個(gè)對 2個(gè)大豆疫霉分離物 Ps41-1和PsJS2均表現(xiàn)為純合抗病反應(yīng)(植株死亡率為 0)但不攜帶 WZInDel11抗病目標(biāo)片段的品系, 同樣, 我們也推測, 安豆1498可能含有新的抗病基因或新的抗病基因組合。根據(jù)朱振東等[17]的研究結(jié)果, 本研究中開豆1106的父本豫豆19與鄭97196對10個(gè)具有不同毒力的大豆疫霉菌菌株具有相同的反應(yīng)型, 而SSR分析表明, 豫豆19與本研究中安豆5156的父本周9521-3-4具有很近的遺傳關(guān)系[31], 周9521-3-4與鄭97196、豫豆29具有相同的抗大豆疫霉譜和相同的Rps1基因座單倍型[31-32], 表明開豆 1106可能含有RpsZheng座位的新等位基因。

大豆對大豆疫霉根腐病的抗性存在由顯性單基因控制的質(zhì)量抗性和由多基因控制的數(shù)量抗性 2種類型。由于質(zhì)量抗性表現(xiàn)為完全抗性、容易利用和檢測, 國外大豆抗疫霉根腐病育種主要利用質(zhì)量抗性[34]。下胚軸創(chuàng)傷接種是鑒定大豆對大豆疫霉根腐病質(zhì)量抗性的主要方法[24-25]?？剐约兒系拇蠖蛊贩N理論上接種非親和大豆疫霉分離物后的死亡率為 0,但在實(shí)際中大豆品種特別是大豆資源, 可能存在混雜或抗性分離而導(dǎo)致部分植株死亡, 因此絕大多數(shù)研究中將植株死亡率小于或等于 30%的品種或資源劃分為抗病, 死亡率在 31%～69%的歸為中間類型。由于中間類型品種中存在大量的抗性植株, 因此, 對大豆疫霉特別是對其強(qiáng)毒力分離物表現(xiàn)為中間類型的優(yōu)異大豆品種或資源同樣具有重要的利用價(jià)值。

河南省具有豐富的抗大豆疫霉根腐病資源, 大多數(shù)骨干親本都具有對大豆疫霉的廣譜抗性[20]。因此, 河南育成的大豆品種大多對大豆疫霉具有高水平的抗性, 然而由于大豆疫霉根腐病抗性不是大豆育種的目標(biāo)性狀, 育成的大豆品種或多或少出現(xiàn)抗性分離。在本研究中, 分別有 16個(gè)和 10個(gè)品系分別對大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2表現(xiàn)為中間反應(yīng)類型, 其中鄭1801對2個(gè)分離物均表現(xiàn)為中間類型, 表明這些品系存在抗性分離。本研究發(fā)現(xiàn)對 1個(gè)或2個(gè)大豆疫霉分離物表現(xiàn)為中間反應(yīng)型的5個(gè)的大豆品系, 分別為漯8825、駐豆37、泛豆22、鄭15234和漯豆 8816, 分子檢測結(jié)果表明其為雜合基因型, 進(jìn)一步從分子水平證明了這 5個(gè)品系存在抗性分離(圖2)。抗性分離品系的單株分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明, 表型為抗病的植株基因型表現(xiàn)為純合抗病和抗感雜合的2種類型(圖3)。這些抗性分離的品系通過 1～2輪抗性植株的接種選擇, 便可選育成純合抗病品系, 或利用抗病基因連鎖的共顯性分子標(biāo)記WZInDel11直接鑒定純合抗性植株, 從而快速選育成純合抗病品系推廣利用。

4 結(jié)論

通過對河南省新培育的 64個(gè)大豆品系進(jìn)行抗大豆疫霉根腐病鑒定發(fā)現(xiàn), 有 51個(gè)抗病品系, 占鑒定品系的 79.7%, 利用抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標(biāo)記WZInDel11進(jìn)行分子檢測,鑒定了18個(gè)含有RpsZheng或等位基因的大豆品系,研究結(jié)果可為近期培育的大豆新品系的推廣和利用提供參考。