郝志偉，蔣繼志，吳路芳，張紅霞，張荷花

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

致病疫霉(Phytophthorainfestans)屬于藻界、卵菌門(mén)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Eronosporales)、腐霉科(Pythiace)、疫霉屬(Phytophthora)[1]，主要侵染番茄和馬鈴薯,它所引起的馬鈴薯晚疫病已成為世界第一大作物病害,全世界每年由該病造成的損失為60億～70億美元[2].由于生物防治具有環(huán)保和高效的巨大潛力已受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注.當(dāng)前,針對(duì)致病疫霉及其所引起的馬鈴薯晚疫病已有許多報(bào)道，主要集中在拮抗菌菌株篩選[3]、鑒定[4]、抑菌活性測(cè)定[5]、抑菌物質(zhì)分離純化[6]、離體組織和盆栽植株防病效果檢測(cè)[7]等方面,但對(duì)拮抗菌與致病疫霉之間的關(guān)系，尤其拮抗菌抑制致病疫霉的機(jī)理研究得還不多.本研究室前期也篩選獲得了多株對(duì)致病疫霉有顯著抑制作用的拮抗菌株[8],其中放線(xiàn)菌Sy11菌株是本研究室劉月等[8]從種植番茄的土壤中篩選出的74株放線(xiàn)菌中的1株,經(jīng)鑒定為細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus).對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率為86.47%,但其無(wú)菌體發(fā)酵液無(wú)抑菌作用,且發(fā)現(xiàn)Sy11只有與致病疫霉共培養(yǎng)在黑麥培養(yǎng)基上才有抑菌作用，經(jīng)初步檢測(cè)Sy11并非通過(guò)揮發(fā)性物質(zhì)抑制致病疫霉生長(zhǎng)，而Sy11與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)后兩菌落之間的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)79.38%,在黑麥培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)Sy11后其菌落外圍的無(wú)菌體瓊脂塊并無(wú)抑菌作用；推測(cè)Sy11在與致病疫霉共培養(yǎng)過(guò)程中,對(duì)致病疫霉有感應(yīng)現(xiàn)象,可能是致病疫霉刺激或誘導(dǎo)了Sy11菌株,使其產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)[8].當(dāng)前，關(guān)于微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究在細(xì)菌及真菌方面已有一些報(bào)道[9]，在卵菌方面研究主要集中在致病菌與其寄主植物方面[10]，而有關(guān)放線(xiàn)菌感應(yīng)致病疫霉方面的研究國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道.本研究室王游游等[11]和王雪寧等[12]都證實(shí)了劉月等[8]的推測(cè)，明確了Sy11對(duì)致病疫霉確有感應(yīng)現(xiàn)象，即致病疫霉誘導(dǎo)了Sy11的抑菌作用，并發(fā)現(xiàn)只有活的致病疫霉菌體才能誘導(dǎo)Sy11的抑菌作用,死亡致病疫霉菌體(經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡處理)無(wú)誘導(dǎo)作用,并明確了共培養(yǎng)過(guò)程中致病疫霉能分泌誘導(dǎo)Sy11抑菌作用的信號(hào)分子，且20 ℃共培養(yǎng)5 d后信號(hào)分子的誘導(dǎo)活性最高，且該信號(hào)分子易溶于甲醇，Sy11受甲醇萃取液誘導(dǎo)后對(duì)致病疫霉的抑制率為68.4%.但致病疫霉在哪種培養(yǎng)方式(致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)或與Sy11共培養(yǎng))下產(chǎn)生的信號(hào)分子對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)活性更強(qiáng)，該信號(hào)分子屬于哪種物質(zhì)等均不清楚.本研究擬進(jìn)一步明確致病疫霉的培養(yǎng)方式與其信號(hào)分子產(chǎn)生以及誘導(dǎo)活性強(qiáng)弱之間的關(guān)系，并初步明確信號(hào)分子的物質(zhì)類(lèi)別及萃取條件等，為信號(hào)分子的進(jìn)一步分離、純化和利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為揭示致病疫霉與Sy11之間的相互關(guān)系和Sy11抑制致病疫霉的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

致病疫霉[Phytophthorainfestans(Montagne) de Bary]W101采自黑龍江克山農(nóng)場(chǎng)，細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus)Sy11篩選自番茄田土壤中，均由河北大學(xué)分子免疫實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定和保存.所用培養(yǎng)基為黑麥固體培養(yǎng)基(Rye)、黑麥液體培養(yǎng)基(RL)和高氏1號(hào)培養(yǎng)基(GS),RL制作方法與黑麥固體培養(yǎng)基一致,配方中不加入瓊脂粉.

1.2 致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)生誘導(dǎo)Sy11信號(hào)分子檢測(cè)

1.2.1 致病疫霉固體培養(yǎng)

在Rye表面鋪設(shè)與培養(yǎng)皿同等大小的玻璃紙(經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌)，在玻璃紙上接種經(jīng)Rye活化培養(yǎng)的致病疫霉菌餅(Φ=10 mm)，20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，揭開(kāi)玻璃紙打取無(wú)菌體瓊脂塊Ⅰ(Φ=10 mm)，與經(jīng)GS活化培養(yǎng)的Sy11菌餅(Φ=10 mm)對(duì)峙培養(yǎng)5 d后,從兩菌落之間的正中位置打取無(wú)菌體瓊脂塊Ⅱ(Φ=10 mm)，再次與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)10 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，評(píng)價(jià)無(wú)菌體瓊脂塊Ⅱ?qū)χ虏∫呙咕z生長(zhǎng)的影響，以空白R(shí)ye瓊脂塊作為對(duì)照，每次重復(fù)3個(gè)平皿，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2 致病疫霉液體培養(yǎng)

參考王游游等[11]的方法以RL制備致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液，然后在Rye中央接種Sy11菌餅(Φ=10 mm)，在其兩側(cè)20 mm處打孔(Φ=10 mm)，加入200 μL致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液,培養(yǎng)5 d后從Sy11菌落與致病疫霉發(fā)酵液之間的正中位置打取無(wú)菌體瓊脂塊(Φ=10 mm)，與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)10 d后觀(guān)察結(jié)果，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每次重復(fù)3個(gè)平皿，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以等體積未培養(yǎng)致病疫霉的RL作對(duì)照.

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%

1.3 致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)以及與Sy11共培養(yǎng)誘導(dǎo)Sy11抑菌作用強(qiáng)弱比較

參考王雪寧等[12]的方法對(duì)致病疫霉與Sy11進(jìn)行共培養(yǎng)，包括對(duì)峙培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，對(duì)峙培養(yǎng)7 d后打取兩菌落之間的無(wú)菌體瓊脂塊，再與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)10 d,觀(guān)察統(tǒng)計(jì)抑菌作用；液體培養(yǎng)致病疫霉5 d后加入Sy11菌體再培養(yǎng)7 d，離心并過(guò)濾除去致病疫霉和Sy11菌體，取濾液與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)7 d，觀(guān)察統(tǒng)計(jì)抑菌作用；致病疫霉單獨(dú)固體培養(yǎng)和單獨(dú)液體培養(yǎng)以及誘導(dǎo)效果的檢測(cè)方法同1.2.

1.4 致病疫霉單獨(dú)液體培養(yǎng)后無(wú)菌體發(fā)酵液中信號(hào)分子分析

1.4.1 糖類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)活性檢測(cè)

采用醇沉糖法[13]得到多糖類(lèi)物質(zhì)，將致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液用3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，4 ℃靜置24 h后離心(10 000 r/min，20 min)得到沉淀與上清液，上清液旋蒸除去乙醇后用去離子水定容到原體積；沉淀用1/4體積的石油醚溶解后反復(fù)脫脂4次，減壓除去石油醚后用20 mL去離子水溶解(50～60 ℃)，按Sevage法去除蛋白類(lèi)物質(zhì)，最終得多糖粗提液.上清液及多糖粗提液對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)按1.2.2的方法進(jìn)行.

1.4.2 蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)活性檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法利用硫酸銨沉淀法從致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中得到蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，取20 mL致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%硫酸銨沉淀[13]，離心得到上清液；沉淀經(jīng)無(wú)菌水溶解、透析除雜后,即得蛋白質(zhì)類(lèi)溶液.另外，由于硫酸銨沉淀所得到的不全是蛋白質(zhì)，因此又采用Sevage法[13]得到除去致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中蛋白質(zhì)后的非蛋白類(lèi)物質(zhì)，將1/4體積的Sevage試劑(氯仿與正丁醇體積比為5∶1)加入20 mL致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中，震蕩、離心后除去變性蛋白,重復(fù)操作至水相與有機(jī)相溶液界面無(wú)凝膠絮狀物產(chǎn)生；收集水相部分，有機(jī)相部分旋蒸除去有機(jī)試劑，用等體積去離子水定容得到有機(jī)相溶液.以上硫酸銨沉淀后得到的上清液和蛋白類(lèi)溶液及Sevage法得到的水相和有機(jī)相溶液對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)按照上述1.2.2的方法進(jìn)行.

1.4.3 脂類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)活性檢測(cè)

參考Folch法[14]用氯仿-甲醇溶液(2∶1，體積比)萃取致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中的脂類(lèi)物質(zhì)，在20 mL致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中緩慢加入氯仿-甲醇溶液(10∶3，體積比)，邊加邊攪拌，常溫下靜置1 h，待溶液有機(jī)相、沉淀、水相分開(kāi)后，有機(jī)相經(jīng)旋蒸除去有機(jī)試劑，去離子水定容到原體積即得脂類(lèi)物質(zhì)粗提液；水溶液用去離子水定容到原體積.水溶液及脂類(lèi)粗提液對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)按照1.2.2的方法進(jìn)行.

1.5 幾種有機(jī)試劑對(duì)致病疫霉脂類(lèi)信號(hào)分子萃取效果比較

參考文獻(xiàn)[15]的方法，采用石油醚、乙酸乙酯、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇3種不同極性的有機(jī)試劑對(duì)致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中的脂類(lèi)信號(hào)分子物質(zhì)進(jìn)行萃取，分別得到不同試劑的萃取液及其萃余液，萃取液及其萃余液對(duì)Sy11的誘導(dǎo)按照1.2.2的方法進(jìn)行.

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用2016版Excel進(jìn)行編輯處理，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生誘導(dǎo)Sy11的信號(hào)分子驗(yàn)證

利用玻璃紙平板法在Rye上單獨(dú)培養(yǎng)致病疫霉后(圖1a),用玻璃紙下的瓊脂塊Ⅰ(圖1b)誘導(dǎo)Sy11菌株(圖1c)，再取經(jīng)過(guò)瓊脂塊Ⅰ誘導(dǎo)后的Sy11菌落與瓊脂塊Ⅰ之間的瓊脂塊Ⅱ與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Sy11經(jīng)誘導(dǎo)后的無(wú)菌體瓊脂塊(瓊脂塊Ⅱ)對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，菌落直徑為29.5 mm(圖1d)，對(duì)照(圖1e，未培養(yǎng)致病疫霉的空白瓊脂塊)菌落直徑為80 mm,兩者之間達(dá)到極顯著差異(P<0.01).表明致病疫霉在固體Rye上單獨(dú)培養(yǎng)可產(chǎn)生誘導(dǎo)Sy11抑菌作用的信號(hào)分子，并能分泌到培養(yǎng)基中，且誘導(dǎo)活性很強(qiáng).

a.單獨(dú)培養(yǎng)致病疫霉；b.瓊脂塊Ⅰ；c.瓊脂塊Ⅰ誘導(dǎo)Sy11菌株；d.瓊脂塊Ⅱ與致病疫霉；e.空白瓊脂塊與致病疫霉.

為了明確致病疫霉經(jīng)液體培養(yǎng)后是否也產(chǎn)生誘導(dǎo)Sy11抑菌作用的信號(hào)分子，檢測(cè)了致病疫霉經(jīng)RL單獨(dú)培養(yǎng)的無(wú)菌體發(fā)酵液對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo).結(jié)果顯示，無(wú)菌體發(fā)酵液與Sy11對(duì)峙培養(yǎng)(圖2a)后兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊(圖2b)對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用:菌落直徑為30.5 mm(圖2c)，對(duì)照(圖2d，未培養(yǎng)致病疫霉的RL)菌落直徑為82 mm，兩者之間達(dá)到極顯著差異(P<0.01)).說(shuō)明致病疫霉經(jīng)液體培養(yǎng)也可產(chǎn)生誘導(dǎo)Sy11產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的信號(hào)分子.

a.致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液誘導(dǎo)Sy11; b.誘導(dǎo)后取無(wú)菌體瓊脂塊; c.無(wú)菌體瓊脂塊與致病疫霉; d.空白R(shí)L對(duì)照.

2.2 致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)以及與Sy11共培養(yǎng)對(duì)Sy11誘導(dǎo)活性比較

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)(單獨(dú)固體培養(yǎng)和單獨(dú)液體培養(yǎng))以及與Sy11共培養(yǎng)(對(duì)峙培養(yǎng)和混合培養(yǎng))在誘導(dǎo)Sy11抑菌作用方面的差異，結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出,在4種不同培養(yǎng)方式中，對(duì)峙培養(yǎng)后致病疫霉對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)活性最強(qiáng)，其無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉菌絲體生長(zhǎng)的抑制率為80.28%，其次是混合培養(yǎng)(抑菌率為76.15%)，而單獨(dú)固體培養(yǎng)下致病疫霉的誘導(dǎo)活性最弱(抑菌率為72.55%).可見(jiàn)致病疫霉與Sy11共培養(yǎng)比其單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)Sy11的誘導(dǎo)活性強(qiáng).但統(tǒng)計(jì)分析表明，4種培養(yǎng)方式下致病疫霉對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)活性并無(wú)顯著性差異.由于致病疫霉單獨(dú)液體培養(yǎng)方式比其他3種培養(yǎng)方式更便于分析無(wú)菌體發(fā)酵液中的信號(hào)分子，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用致病疫霉單獨(dú)液體培養(yǎng)方式.

小寫(xiě)字母表示不同培養(yǎng)方式下抑菌效果差異

2.3 致病疫霉單獨(dú)液體培養(yǎng)后產(chǎn)生的信號(hào)分子的誘導(dǎo)作用

2.3.1 多糖類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)作用

單獨(dú)培養(yǎng)的致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾除菌、乙醇沉淀、石油醚除脂、Sevage法去蛋白質(zhì)后得到的多糖粗提液以及乙醇沉淀后的上清液，分別對(duì)Sy11誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，打取兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊再與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示，空白對(duì)照(圖4a)和RL對(duì)照(圖4b)的菌落直徑均為85 mm，多糖粗提液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉的抑制作用較弱，菌落直徑為61.5 mm(圖4c)，而乙醇沉淀后的上清液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊則表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌作用，菌落直徑為26.8 mm(圖4d)；2種處理與對(duì)照之間均達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，2種處理之間也達(dá)到了顯著性差異(P<0.05).說(shuō)明致病疫霉產(chǎn)生的信號(hào)分子主要存在于乙醇沉淀后的上清液中，不屬于多糖類(lèi)物質(zhì)或與多糖類(lèi)物質(zhì)關(guān)系不大，也說(shuō)明乙醇不易獲得該信號(hào)分子.

a.空白對(duì)照；b.RL對(duì)照；c.多糖粗提液；d.乙醇沉淀后的上清液.

2.3.2 蛋白類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)作用

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%硫酸銨對(duì)致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液進(jìn)行沉淀，得到的沉淀與上清液分別對(duì)Sy11誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，再取兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照(圖5a)和RL對(duì)照(圖5b)的菌落直徑均為85 mm，硫酸銨處理后的沉淀誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉的抑制作用較弱，菌落直徑為60 mm(圖5c)，而上清液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊則有很強(qiáng)的抑菌作用，菌落直徑為33 mm(圖5d)，2種處理之間達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，表明致病疫霉產(chǎn)生的信號(hào)分子主要存在于硫酸銨沉淀后的上清液中，不屬于蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)或與蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)關(guān)系不大，也說(shuō)明用硫酸銨不易獲得該信號(hào)分子；為進(jìn)一步驗(yàn)證硫酸銨沉淀后的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)是否有誘導(dǎo)作用，以Sevage試劑處理致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液，使其中的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)變性或降解，得到的上清液(水相)與變性成分(有機(jī)相)分別對(duì)Sy11誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，再取兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉有顯著的抑菌作用，菌落直徑為32 mm，而變性成分(有機(jī)相)誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉的抑制作用很弱，菌落直徑為59.2 mm，兩者之間也達(dá)到顯著性差異(P<0.05).表明致病疫霉產(chǎn)生的信號(hào)分子主要存在于Sevage試劑處理后的上清液(水相)中，不屬于蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)或與蛋白類(lèi)物質(zhì)無(wú)關(guān).

a.空白對(duì)照；b.RL對(duì)照；c.蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)；d.上清液.

2.3.3 脂類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)作用

利用氯仿-甲醇(2∶1，體積比)溶液對(duì)致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液進(jìn)行萃取后,得到氯仿層脂類(lèi)粗提液和水溶液，分別對(duì)Sy11誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，取兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊再與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示，空白對(duì)照(圖6a)和RL對(duì)照(圖6b)的菌落直徑均為85 mm，脂類(lèi)粗提液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用很強(qiáng)，菌落直徑為32.8 mm(圖6c)，遠(yuǎn)優(yōu)于水溶液誘導(dǎo)后的抑菌作用，菌落直徑為56 mm(圖6d)，兩者之間達(dá)到顯著性差異(P<0.05).說(shuō)明致病疫霉產(chǎn)生的信號(hào)分子屬于氯仿-甲醇萃取的脂類(lèi)物質(zhì)，或以脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)為主.

2.4 有機(jī)試劑對(duì)致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中信號(hào)分子萃取效果比較

在上述已初步明確致病疫霉產(chǎn)生的能誘導(dǎo)Sy11抑菌作用的信號(hào)分子基本屬于脂類(lèi)物質(zhì)或以脂類(lèi)物質(zhì)為主的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇常用提取脂類(lèi)物質(zhì)的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、乙酸乙酯和石油醚進(jìn)行萃取，得到了3種溶劑的萃取液和萃余液，分別對(duì)Sy11誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，取兩者之間的無(wú)菌體瓊脂塊與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和乙酸乙酯萃取液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊均對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用,菌落直徑分別為46 mm(圖7Aa)和35 mm(圖7Ab)，但石油醚萃取液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊無(wú)明顯抑制作用(圖7Ac),對(duì)照組菌落直徑為84 mm(圖7Ad),乙醇和乙酸乙酯萃取液與對(duì)照之間均達(dá)到極顯著差異(P<0.01)；另外，3種試劑的萃余液分別誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)也均有一定的抑制作用，菌落直徑分別為48.67、52.67和47.33 mm(圖7Ba-c)，與對(duì)照組(菌落直徑為84 mm，圖7Bd)相比均達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，其中在體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和石油醚的萃余液中仍然含有較多信號(hào)分子,而在乙酸乙酯萃余液中的信號(hào)分子相對(duì)較少,說(shuō)明乙酸乙酯的萃取效果較其他2種試劑更加明顯.

左圖，A.萃取液；B.萃余液；a.乙醇；b.乙酸乙酯；c.石油醚;d.Control. 右圖，小寫(xiě)字母表示不同試劑萃取液抑菌效果差異；*表示不同試劑萃余液的抑菌效果差異顯著(P<0.05),**表示不同試劑萃余液的抑菌效果差異極顯著(P<0.01).

3 討論

群體感應(yīng)(quorum-sensing，QS)，也稱(chēng)為群感效應(yīng)或群體效應(yīng)，是微生物通過(guò)向外分泌并感應(yīng)小分子物質(zhì)來(lái)控制整個(gè)細(xì)菌群體行為活動(dòng)的一種信號(hào)交流機(jī)制[9].目前對(duì)于微生物群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究主要集中在細(xì)菌群體之間，細(xì)菌的信號(hào)分子已發(fā)現(xiàn)4類(lèi)：1)脂肪類(lèi)衍生物，主要由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生，多為N-?；呓z氨酸內(nèi)酯( AHLs) ；2)氨基酸和短肽類(lèi)(AIP)，主要是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生；3)呋喃硼酸二酯(AI-2)，部分革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都可以產(chǎn)生，主要是不同種間細(xì)胞交流的通用信號(hào)分子；4)二酮哌嗪類(lèi)(DKPs)；最近研究發(fā)現(xiàn)，有些細(xì)菌可利用2種甚至3種不同信號(hào)分子調(diào)節(jié)自身群體行為[9].相比細(xì)菌來(lái)說(shuō)，真菌間感應(yīng)信號(hào)現(xiàn)象的研究相對(duì)較少，但也已發(fā)現(xiàn)了一些感應(yīng)信號(hào)分子，主要有白念珠菌的金合歡醇(famesol)、酪氨醇(tyrosol)、釀酒酵母的苯基乙醇(phenylethylalcohol)和色氨酸(tryptophol)以及α-交配因子(α-factor)等[9].有關(guān)卵菌群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究主要集中在致病菌與宿主植物之間，對(duì)卵菌致病疫霉效應(yīng)分子的研究，主要集中在致病疫霉與馬鈴薯的相互作用模式中[16-17]，致病疫霉在侵染馬鈴薯的過(guò)程中，通常采用一種迷惑戰(zhàn)術(shù)，即先產(chǎn)生一種效應(yīng)分子RXLR(例如IPI-O1)去誘發(fā)馬鈴薯等多種植物產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive reaction, HR)，促使植物局部細(xì)胞迅速死亡，限制病菌進(jìn)一步擴(kuò)展以保護(hù)整體植株；但當(dāng)植物通過(guò)消耗體內(nèi)與抗病相關(guān)的許多能量與物質(zhì)完成HR這一過(guò)程后，致病疫霉則會(huì)產(chǎn)生其他的效應(yīng)分子RXLR(例如PITG、PexRD 或Avar3a編碼的產(chǎn)物)來(lái)干擾或消弱植物的免疫抗病反應(yīng)，并誘發(fā)植物接受致病疫霉的侵染.但對(duì)于不同微生物群體之間，例如細(xì)菌與真菌之間、放線(xiàn)菌與真菌之間、放線(xiàn)菌與卵菌之間的感應(yīng)現(xiàn)象，尤其是植物病原菌與其拮抗菌之間感應(yīng)現(xiàn)象的研究均未見(jiàn)報(bào)道[18].

王游游等[11]已明確放線(xiàn)菌Sy11在與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)致病疫霉確有感應(yīng)現(xiàn)象，即致病疫霉刺激或誘導(dǎo)了Sy11菌株，且只有活的致病疫霉菌體才有誘導(dǎo)作用，死亡的菌體無(wú)誘導(dǎo)作用，利用甲醇較易萃取得到致病疫霉產(chǎn)生的誘導(dǎo)Sy11的信號(hào)分子物質(zhì)，甲醇萃取物誘導(dǎo)Sy11后對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率為68.4%.本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上明確了致病疫霉單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)也會(huì)產(chǎn)生這種信號(hào)分子，單獨(dú)固體培養(yǎng)與單獨(dú)液體培養(yǎng)后產(chǎn)生的信號(hào)分子對(duì)Sy11的誘導(dǎo)沒(méi)有顯著差異，并發(fā)現(xiàn)致病疫霉與Sy11共培養(yǎng)(對(duì)峙培養(yǎng)和混合培養(yǎng))后產(chǎn)生的信號(hào)分子對(duì)Sy11抑菌作用的誘導(dǎo)活性高于單獨(dú)培養(yǎng)，但彼此之間并無(wú)顯著性差異；另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)致病疫霉產(chǎn)生的信號(hào)分子的物質(zhì)類(lèi)別進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)該信號(hào)分子不屬于蛋白質(zhì)類(lèi)或多糖類(lèi)物質(zhì)，屬于脂類(lèi)物質(zhì)或至少以脂類(lèi)物質(zhì)為主，用石油醚不能萃取得到該物質(zhì)，95%乙醇也只能萃取得到其中的一部分，而乙酸乙酯的萃取效果相對(duì)較好，萃取液誘導(dǎo)Sy11后的無(wú)菌體瓊脂塊對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率為67.57%，說(shuō)明乙酸乙酯也比較適合從致病疫霉無(wú)菌體發(fā)酵液中萃取信號(hào)分子，這與本實(shí)驗(yàn)室前期王游游等[11]報(bào)道的利用甲醇萃取的結(jié)果較好不一致，可能是所用試劑種類(lèi)以及具體的萃取過(guò)程不同所致.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步完善了對(duì)致病疫霉誘導(dǎo)Sy11抑菌作用的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為后續(xù)對(duì)信號(hào)分子的分離純化及理化性質(zhì)研究提供了依據(jù).