非酒精性脂肪性肝炎新藥研發(fā)的一些關(guān)鍵因素

郭朝陽，芮法娟，李 婕

山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院 感染性疾病科，濟(jì)南 250021

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟疾病，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)等。NAFLD的患病率隨著肥胖、血脂異常、糖尿病等代謝綜合征(MS)相關(guān)疾病的流行呈逐年增長趨勢，目前已成為全球的第一大慢性肝病[1]。本研究組對亞洲的NAFLD患病率進(jìn)行薈萃分析，結(jié)果顯示亞洲國家普通人群中NAFLD患病率為29.62%，中國大陸高達(dá)29.81%[2]。若不采取有效的干預(yù)措施，25%的NAFLD患者會(huì)進(jìn)展為NASH，NASH患者10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)15%～25%[3]。因此，NASH已成為嚴(yán)重的全球性公共健康問題，是日益增長的肝硬化和肝癌的主要原因之一[4]。

NASH的治療目標(biāo)是延緩、阻止、逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，改善臨床結(jié)局，包括降低肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生，降低肝移植的需求，提高存活率，改善生活質(zhì)量等。然而，目前的干預(yù)措施除改變生活方式(飲食及運(yùn)動(dòng)干預(yù)等)實(shí)現(xiàn)減重可使部分患者獲益外，尚無臨床試驗(yàn)確證有效和安全的治療NASH藥物。即使在接受減重手術(shù)的NASH伴肝纖維化患者中，50%以上的患者肝纖維化程度并未改善甚至惡化，因此針對NASH患者肝臟損傷的藥物治療至關(guān)重要[5]。NASH新藥研發(fā)過程中的一些關(guān)鍵因素更新迅速，我國和美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)均針對NASH藥物研發(fā)發(fā)布臨床研究指南征求意見稿[6-8]，但因疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、患者異質(zhì)性大等而面臨諸多挑戰(zhàn)，雖然目前有超過50種治療藥物正處于臨床研發(fā)階段，但臨床試驗(yàn)成功率低，對該領(lǐng)域患者的臨床治療需求未得到滿足，仍存在諸多關(guān)鍵未決問題。

1 目標(biāo)研究人群臨床表型的復(fù)雜性

NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。之前多數(shù)學(xué)者支持以線粒體反應(yīng)氧體系(ROS)為核心的氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化對肝臟造成的進(jìn)一步損傷理論，即“二次打擊”理論。隨著臨床和基礎(chǔ)研究的深入，目前NASH被認(rèn)為是一種與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和MS的各種表型密切相關(guān)的疾病[9]。

臨床上NASH患者常同時(shí)合并2型糖尿病(86.29%)、高血壓(85.23%)、高脂血癥(79.81%)、心血管疾病(35.76%)、肺部疾病(18.10%)、腎衰竭(15.77%)和甲狀腺疾病(14.95%)等代謝相關(guān)疾病[10-12]。但有的NASH患者無肥胖和高血壓等MS表現(xiàn)，而有的則可能伴隨一種或多種MS組分。因此，臨床上肝臟和肝外病變不同嚴(yán)重程度組合，決定了NASH患者的臨床表型非常復(fù)雜，這些復(fù)雜的臨床表型不僅會(huì)促進(jìn)疾病進(jìn)展，其對療效的影響亦不可忽視。某一類NASH的新藥，可能對所有的表型都有效，也可能只是對某個(gè)表型有效，對其他表型無效甚至有害。例如乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪合成中的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)代謝中發(fā)揮重要作用。ACC抑制劑在臨床研究中能有效降低肝臟脂肪含量，但卻意外升高血漿甘油三酯(TG)，帶來了心血管的安全隱患；盡管法尼酯衍生物X受體(FXR)激動(dòng)劑奧貝膽酸Ⅲ期臨床試驗(yàn)證實(shí)會(huì)減少肝臟纖維化，但它作為肝臟TG重要的調(diào)節(jié)因子，長期用藥會(huì)導(dǎo)致循環(huán)膽固醇升高和不良心血管事件發(fā)生，而且在亞洲人群的不良反應(yīng)較高。

此外，由于NASH患者對藥物所致的肝損傷敏感性增加，有時(shí)藥物可能誘發(fā)肝損傷加重，以及NASH本身具有增加慢性腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，比如過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)δ激動(dòng)劑Seladelpar改善NASH的相關(guān)指標(biāo)卻增加發(fā)生界面性肝炎的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在研發(fā)藥物時(shí)應(yīng)將可能的肝臟毒性以及腎臟損傷性考慮在內(nèi)，并在臨床試驗(yàn)中設(shè)立相應(yīng)的監(jiān)測計(jì)劃。對于伴有高血壓、糖尿病等合并癥的NASH患者，如果同時(shí)服用降壓、降糖藥物，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注NASH新藥與以上疾病常用藥物合并用藥的藥物相互作用，是否會(huì)影響臨床療效的評價(jià)。NASH新藥研發(fā)需要考慮這些異常代謝因素對藥物療效潛在的影響以及藥物是否有加重原有疾病的風(fēng)險(xiǎn)。一個(gè)有效的新藥在不合適(無效)的人群中開展研究，得到的只能是不正確的結(jié)果，從而錯(cuò)誤地判斷此藥無效或者有害。在臨床實(shí)踐中，往往需要針對每一個(gè)新藥進(jìn)行評估，綜合考慮新藥的作用靶點(diǎn)、臨床定位、臨床前研究和前期臨床研究的有效性和安全性等，從而選擇納入臨床試驗(yàn)的真正合適的患者群體[13]。例如，隨機(jī)分組時(shí)可以考慮針對不同合并癥采用分層隨機(jī)化的方法，如考慮糖尿病、高血壓等并存疾病因素，避免藥物影響原有疾病。因此，藥物研發(fā)方案設(shè)計(jì)中針對目標(biāo)研究人群的考慮，實(shí)則是設(shè)定一個(gè)NASH新藥的真正合適的患者群體，這對新藥成功研發(fā)是非常重要的。

2 起始治療節(jié)點(diǎn)以及臨床治療終點(diǎn)的合理性

關(guān)于NASH起始治療節(jié)點(diǎn)的選擇，一般認(rèn)為，對藥物的依賴性應(yīng)該是只有進(jìn)展到NASH才形成。但從內(nèi)分泌角度來看，單純性脂肪肝(不伴有NASH)作為內(nèi)臟肥胖的標(biāo)準(zhǔn)，就應(yīng)該進(jìn)行干預(yù)，只有脂肪肝早期治療才能阻斷其進(jìn)展NASH和纖維化/肝硬化；同時(shí)又能減少脂肪肝誘發(fā)的全身代謝紊亂。而從肝病角度來看，只有晚期纖維化患者中肝臟相關(guān)事件的風(fēng)險(xiǎn)較高，認(rèn)為NASH臨床試驗(yàn)最好的治療時(shí)機(jī)是在NASH伴有纖維化階段(F2～3)，尤其是橋接樣纖維化受試者的成本效益和社會(huì)獲益會(huì)更高。特別是這個(gè)階段疾病進(jìn)展較快，藥物治療能夠突顯效果，并對肝損傷進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因子——纖維化程度能夠進(jìn)行客觀評估，這部分患者也是最迫切需要治療的[14-15]。因此，2018年FDA發(fā)表的指南明確指出脂肪肝和輕度NASH不是藥物開發(fā)的首要目標(biāo)，這個(gè)階段可以通過改變生活方式進(jìn)行控制和治療；需要藥物干預(yù)的主要是纖維化2～3級的非肝硬化NASH和纖維化4級的代償期肝硬化，建議根據(jù)纖維化評估來確定需要藥物治療的NASH人群。

在藥物研發(fā)過程中，臨床治療終點(diǎn)的準(zhǔn)確選擇對于NASH藥物療效的評價(jià)意義重大。是否能夠反映臨床結(jié)局、預(yù)測臨床獲益是終點(diǎn)選擇的基本原則。NASH新藥研發(fā)最重要的臨床結(jié)局是全因死亡率。因此，全因死亡率降低是NASH臨床試驗(yàn)的硬終點(diǎn)。肝臟相關(guān)死亡率是全因死亡率的一個(gè)重要組成部分，常與進(jìn)展為肝硬化、出現(xiàn)失代償事件(腹水、食管胃底靜脈曲張出血、肝性腦病和肝腎綜合征等)、肝移植和進(jìn)展為肝癌密切相關(guān)[5]。一旦患者出現(xiàn)上述硬終點(diǎn)事件，通常意味著死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。然而，NASH經(jīng)常與糖尿病、肥胖和心血管等疾病共存。這些疾病互為因果，相互促進(jìn)[16]。實(shí)際上，NASH患者首要死因是心腦血管疾病，而非終末期肝病。這給以全因死亡為主要終點(diǎn)的驗(yàn)證性臨床試驗(yàn)帶來極大的復(fù)雜性；此外，NASH進(jìn)展為肝硬化的過程通常非常緩慢，如果以全因死亡率和肝臟相關(guān)死亡率降低作為主要研究終點(diǎn)，對于大部分早期NASH患者可能需要隨訪至少長達(dá)10～15年才能看到新藥的效果，這在新藥研發(fā)和審批的實(shí)踐中并不可行[9]。因此，藥物研發(fā)中關(guān)鍵因素是識別和驗(yàn)證能預(yù)測進(jìn)展為硬終點(diǎn)的替代終點(diǎn)[16-18]。

對治療NASH的新藥而言，替代終點(diǎn)的改善可以反映患者進(jìn)展為肝硬化、出現(xiàn)失代償事件和進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，進(jìn)而預(yù)測新藥降低全因死亡率和肝臟相關(guān)死亡率的臨床獲益。理想的替代終點(diǎn)應(yīng)該是在NASH的早期階段能預(yù)測未來向硬終點(diǎn)發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，且在治療中變化靈敏，可以反映疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的降低[6]。目前，常用的替代終點(diǎn)有基于肝臟組織病理學(xué)的替代終點(diǎn)，然而組織學(xué)作為替代終點(diǎn)仍存在諸多問題。肝活組織檢查有一定的風(fēng)險(xiǎn)，不能作為常規(guī)多次隨訪的手段，患者依從性較差。組織學(xué)評價(jià)質(zhì)量也受多種因素影響，包括活檢方式/類型、穿刺部位、穿刺針規(guī)格以及病理學(xué)評估的偏倚等[9,19]。近來有大量研究[20-22]致力于用無創(chuàng)的方法診斷或評估NASH和肝纖維化，并取得一定進(jìn)展，其中包括生化、氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和纖維化的諸多生物標(biāo)志物或組合指標(biāo)，以及基于影像學(xué)技術(shù)的肝纖維化的判斷方法，如MRI彈性成像、瞬時(shí)彈性成像等。美國FDA認(rèn)為早期臨床試驗(yàn)嘗試提供概念驗(yàn)證的證據(jù)，或者確定藥物的合適劑量，可采用無創(chuàng)的替代評價(jià)指標(biāo)，如肝臟血清轉(zhuǎn)氨酶或者其他生物學(xué)標(biāo)志物作為終點(diǎn)。在Ⅱb/Ⅲ試驗(yàn)中，可以考慮使用與肝臟相關(guān)結(jié)局聯(lián)系密切的替代終點(diǎn)如纖維化評分、MRI質(zhì)子密度脂肪含量測定和MRI彈性成像等[23]。

3 多靶點(diǎn)藥物的聯(lián)合應(yīng)用

隨著對NASH發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應(yīng)激、免疫或細(xì)胞因子或線粒體功能改變，以及細(xì)胞凋亡等共同參與了NASH的發(fā)生和發(fā)展[24]。針對這些發(fā)病機(jī)制的靶向干預(yù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，當(dāng)前NASH藥物研發(fā)主要分為三類：調(diào)節(jié)代謝和能量，調(diào)節(jié)免疫和炎癥，控制纖維化進(jìn)展[25]。治療靶點(diǎn)及相應(yīng)制劑主要有PPARα/δ雙激動(dòng)劑(脂代謝類)、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1抑制劑(抗氧化抗炎類)、長效胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑(胰島素抵抗)、FXR激動(dòng)劑(脂代謝類)、成纖維細(xì)胞生長因子-19(脂代謝類)、甲狀腺激素受體-β激動(dòng)劑(脂代謝類)、CC趨化因子受體2和5抑制劑(抗肝纖維化)等[26]。

目前這些治療靶點(diǎn)的探索分別處在不同的研究階段，但是多數(shù)研究僅僅是圍繞單一靶點(diǎn)干預(yù)展開。由于NASH的病因復(fù)雜，作為MS的一個(gè)組分，很難準(zhǔn)確地建立一種導(dǎo)致或者驅(qū)動(dòng)肝病進(jìn)展的病因優(yōu)先級。目前在研藥物的作用靶點(diǎn)相對分散，有的甚至作用靶點(diǎn)也未明確。藥物研發(fā)的難點(diǎn)在于這些生物信號通路相互交織，互為因果，同時(shí)伴隨著肥胖、糖尿病以及心血管風(fēng)險(xiǎn)，靶向其中的一個(gè)通路或靶點(diǎn)，有時(shí)不足以產(chǎn)生療效甚至帶來副作用。而且個(gè)體患者發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展階段不盡相同，簡單說單一靶點(diǎn)藥物在不同患者不一定達(dá)到相同藥效，單靶點(diǎn)治愈NASH的可能性很小。因此，針對NASH發(fā)病機(jī)制不同靶點(diǎn)的多種藥物聯(lián)合干預(yù)，機(jī)制互補(bǔ)的組合尤其值得期待，治療靶點(diǎn)需要兼顧防治肝脂肪變、炎癥、肝細(xì)胞損傷及纖維化,如研究中涉及多個(gè)藥物多靶點(diǎn)聯(lián)合治療或固定劑量復(fù)方制劑，需要提供聯(lián)合用藥的充分依據(jù)，比如抑制ACC導(dǎo)致非飽和脂肪酸的反饋，PPAR通路被抑制，臨床表現(xiàn)為TG升高，依靠優(yōu)化藥物分子難以克服，但可以考慮的解決方案是與PPAR或者FXR激動(dòng)劑聯(lián)用。此外，與治療代謝疾病的藥物進(jìn)行聯(lián)合，可能會(huì)給研究帶來更多的思路，例如奧貝膽酸導(dǎo)致循環(huán)膽固醇升高，可能需要與他汀類藥物聯(lián)合用藥[26-27]。

4 可有效預(yù)測療效的體外細(xì)胞/動(dòng)物模型

FDA建議研發(fā)人員使用動(dòng)物模型篩選潛在新藥。構(gòu)建NAFLD合適的模型進(jìn)行臨床前研究，對于測試靶點(diǎn)的合理性和藥物的成藥性至關(guān)重要。理想的動(dòng)物模型應(yīng)與人類疾病特征相似，能夠模擬人類疾病狀態(tài)和進(jìn)程；穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高，造模方法簡便可行。與人源化模型相比，NASH動(dòng)物模型中需要對人類疾病的所有元素進(jìn)行建模，這顯然具有較大的挑戰(zhàn)性。在臨床前動(dòng)物試驗(yàn)中，動(dòng)物模型必須解決幾個(gè)關(guān)鍵問題：能否忠實(shí)的復(fù)制疾病的所有特征？動(dòng)物對特定藥物的反應(yīng)是否表明患者也可能有此類反應(yīng)？另一挑戰(zhàn)是嚙齒類動(dòng)物對藥物的反應(yīng)比人類更敏感，從鼠模型中能夠看到比人類實(shí)際中更多種類的疾病。雖然NASH動(dòng)物模型眾多，但由于這些病理特征難以同時(shí)在臨床前模型中模擬，沒有任何模型能夠理想的模擬人類的NASH環(huán)境、發(fā)病機(jī)制和病理特征，不同靶點(diǎn)藥物可能在不同的模型中發(fā)揮功效，從而導(dǎo)致NASH藥物從臨床前數(shù)據(jù)到臨床患者療效的轉(zhuǎn)化率很低[28-29]。目前之所以沒有FDA批準(zhǔn)的NASH治療藥物，部分歸因于缺乏生物學(xué)相關(guān)的臨床前模型。因此，新藥研發(fā)成功的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于選擇合適的臨床前動(dòng)物模型，可以密切反映人類的病理生理學(xué)對于驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)和確定藥物的作用方式非常重要。

目前，NASH動(dòng)物模型眾多，但沒有任何模型能夠完全模擬NASH的環(huán)境、機(jī)制和病理特征。NASH的小鼠模型通常是飲食模型，沒有遺傳或基因突變因素參與。比如瘦素(ob/ob)缺乏模型，代謝特征明顯，但是在無外加條件下，很難發(fā)生肝纖維化，最重要的是，在人類NAFLD中，血清瘦素通常呈現(xiàn)升高的狀態(tài)[28,30]。蛋氨酸膽堿缺乏(MCD)飼料誘導(dǎo)的NASH模型基因表達(dá)譜和人類NASH較接近，但缺乏代謝紊亂特征且體質(zhì)量隨試驗(yàn)延長明顯降低，與人類NAFLD代謝過程明顯不同[29]?；瘜W(xué)(CCl4)或者物理損傷(BDL)可以方便地誘導(dǎo)纖維化，但機(jī)制上完全有別于NASH。而且，NASH一般與糖尿病、高脂血癥、心血管等疾病共存，目前，很少有模型能夠綜合反映多種疾病共存的特征。在NASH藥物研發(fā)中，為了結(jié)果的可重復(fù)性，試驗(yàn)動(dòng)物盡量保持各種因素統(tǒng)一，然而臨床試驗(yàn)中，個(gè)體差異無法排除，包括性別、年齡、基因背景、生活習(xí)慣、腸道菌群和基礎(chǔ)疾病等。這也是臨床前結(jié)果不能轉(zhuǎn)化的重要原因。而且NASH動(dòng)物造模時(shí)間長，特別是飲食誘導(dǎo)的模型，周期從幾個(gè)月到1年以上，導(dǎo)致NASH藥物研發(fā)成本高，效率低[31]。

因此，尋找其他創(chuàng)新的臨床前模型也是NASH領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。模擬人體3D細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，其中就包括模擬NASH的復(fù)雜性，提高藥物發(fā)現(xiàn)和安全性測試效率。目前，無論是在工業(yè)界還是學(xué)術(shù)界，都認(rèn)為將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型轉(zhuǎn)向3D細(xì)胞模型更有意義，它具有很多技術(shù)和實(shí)踐優(yōu)勢。

5 總結(jié)與展望

目前尚無獲得批準(zhǔn)的NASH治療藥物，考慮到NASH的高患病率、終末期肝病日益加重的負(fù)擔(dān)，研制減緩、停止或逆轉(zhuǎn)NASH的新藥具有巨大的臨床需求。鑒于尚未有標(biāo)準(zhǔn)來確定哪些NAFLD患者會(huì)進(jìn)展為NASH，目前藥物研發(fā)的重點(diǎn)放在開發(fā)非肝硬化NASH伴肝纖維化的治療上，而且NASH進(jìn)展緩慢，并且需要時(shí)間來評估臨床終點(diǎn)，如肝硬化或生存期。因此，將考慮可以合理地預(yù)測臨床獲益，我國食品藥品監(jiān)督管理局2019版指導(dǎo)原則推薦采用臨床結(jié)局終點(diǎn)和肝組織學(xué)(炎癥或/和纖維化)替代終點(diǎn)。此外，由于NASH發(fā)病多重作用機(jī)制，多同時(shí)伴隨著肥胖、糖尿病以及心血管等并發(fā)癥，導(dǎo)致NASH漸進(jìn)演變及其異質(zhì)性異常復(fù)雜，NASH新藥研發(fā)需要考慮這些異常代謝因素對藥物療效潛在的影響以及藥物是否有加重原有疾病的風(fēng)險(xiǎn)，選擇適宜的目標(biāo)治療人群對于評價(jià)新藥的有效性至關(guān)重要。目前NASH新藥研發(fā)缺少適宜的體外模型來測試靶點(diǎn)的合理性和藥物的成藥性。雖然現(xiàn)有多種針對不同治療靶點(diǎn)的探索分別處在不同研究階段，但是多數(shù)研究僅僅是圍繞單一靶點(diǎn)干預(yù)展開的，使得NASH藥物研發(fā)成功率較低。針對發(fā)病機(jī)制的多靶向聯(lián)合干預(yù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，聯(lián)合多靶點(diǎn)用藥會(huì)是未來治療的一個(gè)發(fā)展方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李婕負(fù)責(zé)文章思路設(shè)計(jì)；郭朝陽、芮法娟負(fù)責(zé)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)獲取分析；李婕、郭朝陽、芮法娟負(fù)責(zé)起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容。