夏 萍 唐發(fā)輝 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

車輪蟲(chóng)是一類危害性外寄生纖毛蟲(chóng), 常寄生于海、淡水魚(yú)類、部分貝類及極少數(shù)的腔腸動(dòng)物; 當(dāng)感染強(qiáng)度較大時(shí), 可能引發(fā)宿主鰓呼吸功能障礙等,極其嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致宿主死亡[1—3]。目前車輪蟲(chóng)主要的研究工作大多數(shù)仍聚焦于形態(tài)分類學(xué)方面[4,5]。根據(jù)Lynn[6]纖毛蟲(chóng)分類系統(tǒng), 車輪蟲(chóng)科Trichodinidae包括車輪蟲(chóng)屬Trichodina、三分蟲(chóng)屬Tripartiella和小車輪蟲(chóng)屬Trichodinella等10個(gè)屬, 其中小車輪蟲(chóng)屬因其個(gè)體微小且同一物種的不同種群之間齒體差異較大而頗受爭(zhēng)議。

眉溪小車輪蟲(chóng)Trichodinella myakkae(Mueller,1937) ?rámek-Hu?ek, 1953隸屬于小車輪蟲(chóng)屬, 由Mueller于1937年在美國(guó)佛羅里達(dá)州的大口黑鱸Aplites salmoides上首次檢獲并描述[7—9], 后在小口牛胭脂魚(yú)Ictiobus bubalus和草魚(yú)Ctenopharyngodonidellus等宿主上均有發(fā)現(xiàn)[10,11], 但迄今均未見(jiàn)任何可供參考的附著盤(pán)銀染資料 (車輪蟲(chóng)形態(tài)學(xué)物種鑒定的重要依據(jù)); 由于常與其他車輪蟲(chóng)混合感染宿主魚(yú), 且形態(tài)量度也難以與小車輪蟲(chóng)屬其他物種相區(qū)分, 故難以對(duì)其進(jìn)行種類鑒定。眉溪小車輪蟲(chóng)與周叢小車輪蟲(chóng)Trichodinella epizootica(Raabe, 1950)?rámek-Hu?ek, 1953和纖細(xì)小車輪蟲(chóng)Trichodinella subtili(Lom, 1959) Lom & Haldar, 1977形態(tài)相似,有研究認(rèn)為眉溪小車輪蟲(chóng)是周叢小車輪蟲(chóng)或纖細(xì)小車輪蟲(chóng)的同物異名[11—13]。隨著分子技術(shù)在車輪蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用, 車輪蟲(chóng)的研究得到進(jìn)一步發(fā)展。2006年Gong等[14]提交了眉溪小車輪蟲(chóng)的18S rDNA序列 (AY102176), 但由于未提供分子數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的原始銀染標(biāo)本, 該序列的有效性仍有待進(jìn)一步核實(shí)[15,16]。為此, 本文基于新獲得的寄生于多種宿主的小車輪蟲(chóng)形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù), 描述了眉溪小車輪蟲(chóng)的形態(tài)和分子特征, 并進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 采集與鑒定

宿主魚(yú)鰱Hypophthalmichthys molitrix和鳙Aristichthys nobilis于2019年6月采自重慶江津區(qū)同一養(yǎng)殖漁場(chǎng) (29°18′N, 106°16′E), 宿主魚(yú)麥穗魚(yú)Pseudorasbora parva于2019年8月采自重慶沙坪壩區(qū)(29°52′N, 106°44′E), 且上述宿主魚(yú)均處于幼魚(yú)期(體長(zhǎng)約8—13 cm)?；铙w宿主魚(yú)帶回實(shí)驗(yàn)室解剖后, 使用體視顯微鏡 (NIKON SMZ1500) 進(jìn)行車輪蟲(chóng)的活體觀察, 并進(jìn)行鰓涂片, 待自然空干后采用修訂版干銀法對(duì)鰓組織涂片進(jìn)行附著盤(pán)的形態(tài)學(xué)染色[17]。利用全自動(dòng)光學(xué)顯微鏡 (LEICA DM6000B)進(jìn)行車輪蟲(chóng)附著盤(pán)的顯微照片拍攝。采用“統(tǒng)一特定方法”對(duì)所獲車輪蟲(chóng)樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)量與統(tǒng)計(jì)[18]。齒體定位線條圖利用軟件CorelDRAW X8繪圖完成。根據(jù)Van As和Basson提出, 唐發(fā)輝等[19,20]完善的方法進(jìn)行齒體特征的描述。

1.2 主成分分析

使用PAST 3軟件對(duì)眉溪小車輪蟲(chóng)各株系蟲(chóng)體直徑、附著盤(pán)直徑、緣膜寬、齒環(huán)直徑、齒體縱長(zhǎng)、齒長(zhǎng)、齒鉤長(zhǎng)、齒錐寬、齒棘長(zhǎng)、輻線數(shù)及齒體數(shù)11項(xiàng)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行主成分分析 (PCA), 利用變異協(xié)方差矩陣生成置信度為95.0%的散點(diǎn)圖。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增與測(cè)序

在光學(xué)顯微鏡下使用玻璃微吸管吸取單只車輪蟲(chóng), 無(wú)菌水洗滌純化后采用試劑盒提取DNA(REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit), -20℃凍存。PCR體系: 2×TaqPCR預(yù)混液 (2×TaqMaster Mix, Novoprotein, E005-02B) 6.25 μL, 引物各0.5 μL,模板DNA 2 μL, 超純水補(bǔ)足至25 μL體系。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性1min 30s; 94℃變性20s, 56℃退火20s, 72℃延伸2min, 35個(gè)循環(huán); 72℃再延伸5min。18S rDNA的擴(kuò)增引物為: 82F (5′-GAAACTG GGAATGGCTC-3′) 和LSUR (5′-GTTAGTTTCTT TTCCTCCGC-3′)[21]; ITS-5.8S rDNA的擴(kuò)增引物為:ERIB10-V (5′-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3′) 和28S1R (5′-GTGTTTCAAGACGGGTCG-3′)[22]。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送至英濰捷基生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 分子特征分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列的同源性比對(duì);應(yīng)用DAMBE7.2.136軟件分析堿基替代飽和性; 采用MEGA6.0進(jìn)行遺傳距離 (K-2-P模型)的計(jì)算及序列變異位點(diǎn)的分析; 使用BioEdit7.0.5.3進(jìn)行18S rDNA的GC含量計(jì)算; 18S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)基于RNA structure5.2完成, 所有參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn),選取自由能最低的模型并利用RNAViz2.0參照European Ribosomal RNA Database手動(dòng)調(diào)整完成[23]。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

共選取63條序列使用BI (Bayesian Inference)及ML (Maximum Likelihood) 構(gòu)建18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 序列包括眉溪小車輪蟲(chóng)三株系共5條18S rDNA序列, 及在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取的同源性較高的分子序列, 其余序列參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行選取,外群選取大腎形蟲(chóng)Colpoda magna(EU039896)與毛板殼蟲(chóng)Coleps hirtus(AM292311)。采用GTR+I+G模型在MrBayes3.1.2軟件中構(gòu)建BI樹(shù), 運(yùn)行300萬(wàn)代, 每200代抽樣1次, 舍棄前25.0%樣本。通過(guò)在線工具The CIPRES Science Gateway V.3.3 (http://www.phylo.org/), 在RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.12) 下構(gòu)建ML樹(shù)[25,26], 使用GTR+G模型進(jìn)行1000次自舉(Bootstrap) 重復(fù)檢測(cè)。利用FigTree v1.4.2顯示系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 使用Photoshop CS3美化樹(shù)圖。同理, 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取鰱、鳙、草魚(yú)及麥穗魚(yú)線粒體16S rDNA序列各2條, 以奇額墨頭魚(yú)Garra mirofrontis(GU168764) 為外群構(gòu)建宿主魚(yú)的BI樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)描述

株系1: 眉溪小車輪蟲(chóng)Trichodinella myakkae(HM; 圖 1A和表 1)

圖1 眉溪小車輪蟲(chóng)附著盤(pán)的銀染顯微結(jié)構(gòu)圖及齒體定位圖 (本研究)Fig. 1 Photomicrographs of silver impregnated specimen and denticle diagrammatic drawings of T. myakkae

采集地: 重慶江津區(qū)

采集時(shí)間: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鰱; 鰓表

感染率: 100% (15/15)

感染強(qiáng)度: 中度 (車輪蟲(chóng)感染強(qiáng)度的劃分標(biāo)準(zhǔn):光學(xué)顯微鏡下放大10×10倍后1個(gè)視野內(nèi)平均蟲(chóng)體數(shù)為0—5為輕度; 蟲(chóng)體數(shù)5—10為中度; 蟲(chóng)體數(shù)＞10為重度, 后同)。

形態(tài)學(xué)描述 (n=13): 該種蟲(chóng)體小型, 蟲(chóng)體直徑(19.8±1.1) μm (17.2—21.9 μm), 附著盤(pán)直徑(16.5±1.2) μm (14.5—18.1 μm), 齒環(huán)直徑(8.1±0.6) μm(7.3—9.9 μm), 緣膜寬(1.8±0.5) μm (1.2—2.9 μm)。染色后附著盤(pán)齒體形態(tài)清晰, 無(wú)明顯的中央顆粒;齒鉤部分發(fā)達(dá), 略成長(zhǎng)方形, 齒鉤長(zhǎng)(3.4±0.3) μm(2.9—3.9 μm); 齒鉤前緣超過(guò)Y+1軸, 前后緣稍彎曲, 多數(shù)齒鉤外切緣略高于鈍圓的骨突, 存在鉤突且鉤突較為發(fā)達(dá), 無(wú)明顯后突起, 齒鉤連接纖細(xì); 齒錐較發(fā)達(dá), 齒錐寬(0.8±0.2) μm (0.4—1.1 μm), 齒錐頂點(diǎn)鈍圓略超Y軸; 齒棘短且纖細(xì), 齒棘長(zhǎng)(1.0±0.3) μm(0.7—1.5 μm), 齒棘后傾斜不及Y軸與Y-1軸距離的一半, 無(wú)明顯棘突; 口圍繞度190°—210°。

株系2: 眉溪小車輪蟲(chóng)Trichodinella myakkae(AN; 圖 1B和表 1)

表1 眉溪小車輪蟲(chóng)三株系、纖細(xì)小車輪蟲(chóng)及周叢小車輪蟲(chóng)形態(tài)學(xué)特征統(tǒng)計(jì) (測(cè)量單位: μm)Tab. 1 Morphological characteristics of three strains of T. myakkae, T. subtilis and T. epizootica (measurement unit: μm)

采集地: 重慶江津區(qū)

采集時(shí)間: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鳙; 鰓表

感染率: 100% (18/18)

感染強(qiáng)度: 中度

形態(tài)學(xué)描述 (n=15): 小型淡水車輪蟲(chóng), 齒體形態(tài)與T. myakkae(HM) 株系相比, 本株系齒鉤外切緣不圓滑, 這可能與染色時(shí)間相關(guān), 但多數(shù)仍高于骨突; 齒鉤前后緣平滑, 鉤突顯著且略為尖銳, 無(wú)明顯后突起, 鉤突與上個(gè)齒體形成的凹口嵌合較為緊密。形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表 1。

株系3: 眉溪小車輪蟲(chóng)Trichodinella myakkae(PP; 圖 1C和表 1)

采集地: 重慶沙坪壩區(qū)

采集時(shí)間: 2019年8月

宿主及寄生部位: 麥穗魚(yú); 鰓表

感染率: 38.4% (4/11)

感染強(qiáng)度: 輕度

形態(tài)學(xué)描述 (n=15): 蟲(chóng)體小型與其他株系相比, 本株系齒鉤更為發(fā)達(dá), 整個(gè)齒鉤幾近填滿Y軸與Y+1軸間的空間; 該種具有較為光滑的齒鉤前后緣,且其齒鉤外切緣向上凸, 高于鈍圓骨突; 齒鉤連接較其他株系更為纖細(xì), 鉤突更為發(fā)達(dá), 鉤突向前與上個(gè)齒體形成的凹口嵌合疏松, 齒棘短但并不尖銳。形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表 1。

2.2 眉溪小車輪蟲(chóng)三株系的主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示本研究獲得的眉溪小車輪蟲(chóng)3個(gè)株系的形態(tài)學(xué)特征 (蟲(chóng)體直徑、附著盤(pán)直徑、緣膜寬、齒環(huán)直徑、齒體縱長(zhǎng)、齒長(zhǎng)、齒鉤長(zhǎng)、齒錐寬、齒棘長(zhǎng)、輻線數(shù)及齒體數(shù)) 構(gòu)建的散點(diǎn)圖高度重疊 (圖 2)。

圖2 眉溪小車輪蟲(chóng)三株系形態(tài)特征主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of morphometric data of three strains of T. myakkae

2.3 18S rDNA與ITS-5.8S rDNA分子特征

本研究已測(cè)定并提交于GenBank的眉溪小車輪蟲(chóng)相關(guān)DNA序列信息詳見(jiàn)表 2。眉溪小車輪蟲(chóng)3個(gè)株系均與T. myakkae(AY102176) 最相似 (相似度≥99.0%)。18S rDNA序列相似度及遺傳距離顯示, 3個(gè)株系間的序列相似度為99.2%—100%, 遺傳距離為0.000—0.003。其中,T. myakkae(HM)與T.myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.003;T. myakkae (AN)與T. myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.003;T. myakkae(PP)與T. myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.004。眉溪小車輪蟲(chóng)各序列與T. epizootica(GU906246)的序列相似度為96.7%—97.7%, 遺傳距離為0.017—0.021。GC含量顯示本研究所獲3株系及T. myakkae(AY 102176) 為50.8%—51.2%。

表2 眉溪小車輪蟲(chóng)三株系18S rDNA和ITS-5.8S rDNA序列登錄號(hào)Tab. 2 Accession numbers of 18S rDNA and ITS-5.8S rDNA sequences of three strains of T. myakkae

18S rDNA與ITS-5.8S rDNA變異位點(diǎn)顯示: 以T. myakkae(AY102176) 為參考序列,T. myakkae(HM)與T. myakkae(AN) 株系18S rDNA的相同變異位點(diǎn)共有7個(gè), 且T. myakkae(HM) 在第34位也存在變異位點(diǎn);T. myakkae(PP) 有7個(gè)變異位點(diǎn)。ITS-5.8S rDNA序列變異位點(diǎn)顯示, 以T. myakkae(HM)為參考序列,T. myakkae(AN) 無(wú)變異位點(diǎn), 而T.myakkae(PP) 存在18個(gè)變異位點(diǎn) (圖 3)。本研究所獲眉溪小車輪蟲(chóng)3株系及T. myakkae(AY102176)的18S rDNA堿基組成頻數(shù)顯示平均轉(zhuǎn)換頻數(shù)為3, 顛換為1, 轉(zhuǎn)換高于顛換, 轉(zhuǎn)換率與顛換率之比R=2.28(＞2.0); 密碼子第1、2、3位點(diǎn)轉(zhuǎn)換及顛換頻數(shù)如表 3所示, 其中第2位點(diǎn)最為保守, 無(wú)堿基替換，故R值不可計(jì)算。18S rDNA基因堿基替換飽和曲線如圖 4所示, 轉(zhuǎn)換遺傳距離(S)大于顛換遺傳距離(V), 且其增加速度也大于后者; 轉(zhuǎn)換遺傳距離(S)整體呈線性上升趨勢(shì), 而顛換遺傳距離(V)則趨于穩(wěn)定。各堿基替換飽和度情況顯示, 替換飽和指數(shù)ISS(Index of Substitution Saturation) 小于替換飽和指數(shù)臨界值ISS.c (the critical ISS value), 且P=0.0000 (差異極顯著)。

圖4 眉溪小車輪蟲(chóng)18S rRNA堿基替換飽和曲線Fig. 4 Base substitution saturation curve of 18S rRNA sequence of T. myakkae

表3 眉溪小車輪蟲(chóng)各株系18S rDNA堿基對(duì)數(shù)組成頻數(shù)Tab. 3 Base pairs composition frequency of T. myakkae based on 18S rDNA

圖3 眉溪小車輪蟲(chóng)三株系ITS-5.8S rDNA序列變異位點(diǎn)比較Fig. 3 Comparison of variation sites among three strains of T. myakkae based on ITS-5.8S rDNA sequences

所獲眉溪小車輪蟲(chóng)3株系及T. myakkae(AY102176)的4個(gè)高變區(qū) (V3、V4、V5和V7) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示: 4個(gè)株系在4個(gè)高變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型相同,僅在V3、V4和V5區(qū)一級(jí)結(jié)構(gòu)存在堿基差異;T.myakkae(HM)與T. epizootica(GU906246)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示: 眉溪小車輪蟲(chóng)與周叢小車輪蟲(chóng)在螺旋H17(V3區(qū)) 存在構(gòu)型差異, 前者在螺旋H17僅有一個(gè)側(cè)凸和大發(fā)卡環(huán), 而周叢小車輪蟲(chóng)具有兩個(gè)側(cè)凸和小發(fā)卡環(huán) (圖 5)。

圖5 眉溪小車輪蟲(chóng) (HM)與周叢小車輪蟲(chóng) (GU906246) 18S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu) H17區(qū)比較Fig. 5 Comparison of H17 regions for T. myakkae (HM) and T.epizootica (GU906246) based on 18S rRNA secondary structure

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于18S rDNA構(gòu)建的ML和BI樹(shù)呈現(xiàn)出一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (本文只呈現(xiàn)BI樹(shù), 圖 6A)。本研究的3個(gè)株系與T. myakkae(AY102176) 聚為一枝 (Clade A), 且位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的頂部, 具有高支持率。Clade A中, 宿主為鰱的T. myakkae(HM1) 和T.myakkae(HM2) 及宿主為鳙的T. myakkae(AN1) 和T. myakkae(AN2) 分別聚枝后再形成姐妹枝, 后與宿主為草魚(yú)的T. myakkae(AY102176) 聚枝后再與宿主為麥穗魚(yú)的T. myakkae(PP) 聚枝。Clade A與小車輪蟲(chóng)未定種Trichodinellasp. (JQ663869) 聚為一枝后再與由周叢小車輪蟲(chóng)構(gòu)成的支系Clade B互為姐妹枝, 并具有高支持率?；诰€粒體16S rDNA構(gòu)建的具有高支持率的魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示, 鰱枝、鳙枝先聚為一小枝后再與草魚(yú)枝互為姐妹枝,最后再與麥穗魚(yú)枝聚枝(圖 6B)。

圖6 基于BI法與ML法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 6 Molecular phylogenetic tree constructed by BI and ML method

3 討論

3.1 眉溪小車輪蟲(chóng)的種類鑒定及與近緣種的比較

口圍繞度為車輪蟲(chóng)口面區(qū)口圍帶盤(pán)繞程度, 是車輪蟲(chóng)科中屬間分類的重要依據(jù), 本研究所獲蟲(chóng)種口圍繞度落入了小車輪蟲(chóng)屬180°—270°的范圍[27—29];附著盤(pán)銀染標(biāo)本顯示該種具有小車輪蟲(chóng)屬較直的齒鉤、纖細(xì)的齒錐和短小的齒棘等典型特征[28,30];遺傳距離和序列相似度顯示: 本物種與周叢小車輪蟲(chóng)屬于種間水平; GC含量均超過(guò)50.0%, 符合Tang和Zhao[31]所總結(jié)的小車輪蟲(chóng)屬GC含量區(qū)間; 基于18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同樣顯示: 本研究所獲物種與周叢小車輪蟲(chóng)及小車輪蟲(chóng)未定種聚為小車輪蟲(chóng)枝系。綜合上述形態(tài)學(xué)、分子特征及系統(tǒng)發(fā)育分析表明本研究所獲物種應(yīng)隸屬于小車輪蟲(chóng)屬。Mueller[32]在1937年報(bào)道眉溪小車輪蟲(chóng)時(shí), 國(guó)際無(wú)統(tǒng)一的形態(tài)學(xué)描述方法, 因此原始株系描述并不完善且缺乏附著盤(pán)銀染圖, 但基于已有的原始形態(tài)學(xué)特征描述顯示: 本研究所獲物種除具有齒棘外,其輻線數(shù)、齒體數(shù)目和蟲(chóng)體大小等鑒別性特征均與眉溪小車輪蟲(chóng)原始株系一致, 且本研究物種齒鉤較直, 有明顯的突起等特征也與之相符[5]。綜上, 本研究所獲物種應(yīng)為眉溪小車輪蟲(chóng), 并且本研究中的宿主魚(yú)——麥穗魚(yú)為眉溪小車輪蟲(chóng)的宿主新記錄。

本研究所涉眉溪小車輪蟲(chóng),與近緣種周叢小車輪蟲(chóng)、纖細(xì)小車輪蟲(chóng)形態(tài)比較相似, 但眉溪小車輪蟲(chóng)的蟲(chóng)體直徑、附著盤(pán)直徑、齒環(huán)直徑、齒長(zhǎng)和齒錐寬等形態(tài)特征均小于周叢小車輪蟲(chóng)及纖細(xì)小車輪蟲(chóng), 且齒體數(shù)區(qū)間并不重合。結(jié)合齒體定位圖分析, 眉溪小車輪蟲(chóng)纖細(xì)較直的齒棘與周叢小車輪蟲(chóng)彎鉤狀齒棘不同; 眉溪小車輪蟲(chóng)僅具有1個(gè)前突起, 區(qū)別于纖細(xì)小車輪蟲(chóng)具向前的2個(gè)突起 (鉤突與齒錐前突起) 這一鑒別性特征[33]; 同時(shí), 眉溪小車輪蟲(chóng)的口圍繞度 (190°—210°) 也大于纖細(xì)小車輪蟲(chóng)(170°—190°) 及周叢小車輪蟲(chóng) (180°—190°)的口圍繞度[10,11,33,34], 故基于形態(tài)學(xué)分析表明: 眉溪小車輪蟲(chóng)與周叢小車輪蟲(chóng)及纖細(xì)小車輪蟲(chóng)應(yīng)為不同物種。18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)顯示, 眉溪小車輪蟲(chóng)與周叢小車輪蟲(chóng)單獨(dú)聚枝, 且兩者二級(jí)結(jié)構(gòu)在螺旋H17存在明顯的構(gòu)型差異 (眉溪小車輪蟲(chóng)僅有一個(gè)側(cè)凸并有大的發(fā)卡環(huán), 圖 5), 表明本研究所獲物種與周叢小車輪蟲(chóng)具有種間水平的差異。

3.2 眉溪小車輪蟲(chóng)的種內(nèi)分化及其與宿主的協(xié)同進(jìn)化

形態(tài)學(xué)研究表明, 本研究中的眉溪小車輪蟲(chóng)3個(gè)株系形態(tài)特征相似 (表 1), 附著盤(pán)齒體形態(tài)無(wú)明顯差異 (圖 1), 且主成分分析顯示3個(gè)株系形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)所形成的散點(diǎn)圖高度重疊 (圖 2), 綜合形態(tài)學(xué)與主成分分析結(jié)果表明眉溪小車輪蟲(chóng)各株系均屬同種, 且無(wú)明顯表型分化。眉溪小車輪蟲(chóng)各株系18S rDNA序列相似度為99.2%—100%, 遺傳距離為0.000—0.004。以往的研究表明, 18S rDNA不同分類群遺傳距離閾值種內(nèi)水平為0.000—0.005[31], 表明3株系在分子層面產(chǎn)生分化, 但屬于種內(nèi)水平。T. myakkae(HM)與T. myakkae(AN) 18S rDNA和ITS rDNA序列變異位點(diǎn)幾乎一致, 而T. myakkae(PP) 則產(chǎn)生了分子分化 (圖 3)。有研究認(rèn)為DNA的堿基替換記載著物種進(jìn)化的信息, 且轉(zhuǎn)換更易于飽和[35]。本研究顯示眉溪小車輪蟲(chóng)各序列差異度與遺傳距離呈線性關(guān)系, 轉(zhuǎn)換大于顛換 (圖 4), 表明眉溪小車輪蟲(chóng)各株系種間的進(jìn)化潛能較大, 且受進(jìn)化噪音的影響較小, 其轉(zhuǎn)換和顛換均具系統(tǒng)發(fā)育研究意義。結(jié)合DNA序列堿基組成及相關(guān)資料分析(表 3), 堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換的可能易于顛換; 密碼子第2位點(diǎn)較為保守, 且不同位點(diǎn)的堿基替換率不同, 但多表現(xiàn)為同義突變, 推測(cè)這些同義突變受到的自然選擇壓力較小, 突變后容易固定[36—38]。眉溪小車輪蟲(chóng)不同株系18S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型一致, 進(jìn)一步表明本研究所獲3株系均屬同種。

18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖 6): 宿主為鰱的T. myakkae(HM) 枝與宿主為鳙的T. myakkae(AN) 枝互為姐妹枝, 再依次與宿主為草魚(yú)的T.myakkae(AY102176) 及宿主為麥穗魚(yú)的T. myakkae(PP) 聚枝, 再次支持其為同種。各株系的宿主均屬鯉科魚(yú)類, 其中鰱和鳙隸屬于鰱亞科Hypophthalmichthyinae, 草魚(yú)隸屬于雅羅魚(yú)亞科Leuciscinae, 麥穗魚(yú)隸屬于亞科Gobioninae, 且基于線粒體16S rDNA構(gòu)建的宿主魚(yú)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示(圖 6B): 鰱亞科的鰱和鳙與雅羅魚(yú)亞科的草魚(yú)有較近的親緣關(guān)系,亞科的麥穗魚(yú)則與鰱亞科和雅羅魚(yú)亞科較遠(yuǎn),與已有研究結(jié)果一致[39,40]。本研究所揭示的眉溪小車輪蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示其與宿主魚(yú)具有相同的進(jìn)化趨勢(shì), 表明二者之間可能存在共物種形成的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系, 故在一定程度上宿主也可能成為影響眉溪小車輪蟲(chóng)演化的重要因素。但受限于本研究眉溪小車輪蟲(chóng)樣本量較少, 且涉及宿主魚(yú)多樣性較為局限, 因此來(lái)自更多宿主的相關(guān)數(shù)據(jù)的獲取可能更有利于厘清其中的自然關(guān)系。

基于上述分析結(jié)果,T. myakkae(HM、AN)與T. myakkae(AY102176) 株系差異較小, 而T. myakkae(PP)與其他株系已經(jīng)出現(xiàn)差異, 但綜合形態(tài)學(xué)特征、DNA序列分子特征 (序列相似度、遺傳距離、變異位點(diǎn)及二級(jí)結(jié)構(gòu)) 和分子系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果, 此類分化應(yīng)屬于種內(nèi)水平, 推測(cè)部分眉溪小車輪蟲(chóng)在適應(yīng)其不同宿主內(nèi)的寄生生活過(guò)程中, 可能由于基因交流的減少而產(chǎn)生了種內(nèi)多樣性。系統(tǒng)發(fā)育分析還顯示了眉溪小車輪蟲(chóng)與其宿主可能存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。