利用QTL-seq定位蘿卜肉質(zhì)根根形指數(shù)QTL

胡天華，魏慶鎮(zhèn)，汪精磊，王五宏，胡海嬌，嚴(yán)亞琴，包崇來(lái)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

蘿卜(RaphanussativusL.)屬于十字花科蘿卜屬，是一種重要的根菜類蔬菜作物。蘿卜以膨大的肉質(zhì)根為主要產(chǎn)品器官，可以熟食、加工腌制和生食，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且富含糖、維生素和蘿卜硫素等物質(zhì)，具有較高的藥用食療價(jià)值[1]。肉質(zhì)根的大小和形狀直接影響蘿卜的產(chǎn)量與品質(zhì)，是蘿卜育種的重要目標(biāo)性狀。蘿卜的肉質(zhì)根分為根頭部、根頸部和真根三個(gè)部分；根頭部為短縮莖，其上著生芽和葉，根頸部是幼苗下胚軸發(fā)育的無(wú)側(cè)根部分，真根一般著生兩列側(cè)根。

蘿卜肉質(zhì)根的大小和形狀是復(fù)合性狀，一般可以用肉質(zhì)根長(zhǎng)度、橫徑、根形指數(shù)以及肉質(zhì)根質(zhì)量等性狀來(lái)衡量。蘿卜資源中，肉質(zhì)根的直徑最小有1 cm，最大可以到30 cm，肉質(zhì)根長(zhǎng)最短有3 cm，最長(zhǎng)可以達(dá)到200 cm[2]；孫玉燕等[3]將蘿卜的肉質(zhì)根分為圓柱、圓錐、卵圓、扁圓、梨形和圓臺(tái)等15種主要形狀。蘿卜肉質(zhì)根大小和形狀為寡基因或多基因控制的數(shù)量性狀，關(guān)于蘿卜肉質(zhì)根大小QTL定位研究較少。荊贊革[4]以肉質(zhì)根大小差異顯著的親本配制雜交組合，研究了蘿卜肉質(zhì)根質(zhì)量的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)蘿卜肉質(zhì)根質(zhì)量是由主基因和多基因控制的數(shù)量性狀，并分離獲得了與其相關(guān)的基因組片段。Tsuro等[5]利用F2分離群體構(gòu)建了包含198個(gè)標(biāo)記的遺傳圖譜，定位到3個(gè)與根形指數(shù)相關(guān)QTL位點(diǎn)，總共可解釋42.4%表型變異率，同時(shí)檢測(cè)到肉質(zhì)根橫徑相關(guān)QTL位點(diǎn)2個(gè)，其中8號(hào)連鎖群上的QTL位點(diǎn)通過(guò)影響肉質(zhì)根橫徑來(lái)影響根形；Hashida等[6]利用重組自交系群體，結(jié)合兩年的性狀數(shù)據(jù)，定位到3個(gè)與肉質(zhì)根根重相關(guān)的QTL位點(diǎn)。目前，蘿卜肉質(zhì)根大小性狀相關(guān)的基因定位研究較少，蘿卜肉質(zhì)根大小研究處于QTL初定位階段，仍未發(fā)現(xiàn)有可用的有效的與肉質(zhì)根大小緊密連鎖的分子標(biāo)記，也未發(fā)掘調(diào)控肉質(zhì)根大小相關(guān)的主效的基因。與蘿卜肉質(zhì)根發(fā)育相關(guān)的研究多集中在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組研究方面[1-2，7-9]，相關(guān)研究發(fā)掘了大量蘿卜肉質(zhì)根不同發(fā)育時(shí)期的差異基因，但直接調(diào)控蘿卜肉質(zhì)根根形相關(guān)的基因仍有待發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，肉質(zhì)根膨大的分子機(jī)制也尚未闡明。

數(shù)量性狀極端性狀混池測(cè)序技術(shù)(QTL-seq)能夠通過(guò)混池的方法排除復(fù)雜遺傳背景的干擾，可以在F2代實(shí)現(xiàn)主效QTL位點(diǎn)的快速定位[10]，已在水稻、番茄和黃瓜等多種作物上得到廣泛應(yīng)用[11-14]；蘿卜中也利用該方法對(duì)蘿卜的肉質(zhì)根皮色和肉質(zhì)根的肉色進(jìn)行了基因的定位挖掘[15-16]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，目前已公布了5個(gè)蘿卜的基因組序列[2，17-20]，其中Moghe等[18]發(fā)表了野生蘿卜基因組，其余均為不同栽培蘿卜基因組，而且蘿卜基因組質(zhì)量不斷提高，最新的基因組利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，基因組contig N50達(dá)到了1.2 Mb[20]，完整性和連續(xù)性均有較大提高，這為不同大小蘿卜肉質(zhì)根形成的關(guān)鍵基因挖掘提供了便利，同時(shí)為蘿卜分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及分子育種等提供了重要基礎(chǔ)。

本研究以肉質(zhì)根大小和形狀差異較大的親本配制了F2分離群體，并對(duì)根形指數(shù)性狀進(jìn)行了QTL定位分析。結(jié)合最新的蘿卜參考基因組，利用QTL-seq方法，分析獲得了4個(gè)與肉質(zhì)根根形指數(shù)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，為蘿卜肉質(zhì)根根形指數(shù)性狀進(jìn)一步精細(xì)定位和候選基因挖掘克隆奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與性狀統(tǒng)計(jì)分析

利用肉質(zhì)根根形差異較大親本LLYH與CLA雜交，獲得300株F2分離群體。母本LLYH為小型扁圓蘿卜，肉質(zhì)根扁圓形，正常成熟期肉質(zhì)根長(zhǎng)約30.0 mm，最大橫徑約為35.0 mm；父本CLA為大型長(zhǎng)白蘿卜，肉質(zhì)根倒長(zhǎng)圓錐形，正常成熟期長(zhǎng)約500.0 mm，最大橫徑約為80.0 mm(圖1)。親本、F1及F2于2018年秋季種植在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地，9月28日播種，11月12日測(cè)量，然后對(duì)肉質(zhì)根長(zhǎng)(root length，RL)和肉質(zhì)根最大橫徑(root diameter，RD)進(jìn)行性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用300.0 mm數(shù)顯游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，單位mm，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[21]，同時(shí)計(jì)算獲得肉質(zhì)根根形指數(shù)(RL/RD)。

圖1 生長(zhǎng)期45 d時(shí)的母本、F1和父本的肉質(zhì)根

1.2 DNA提取與混池測(cè)序

選取親本及F2單株幼嫩葉片進(jìn)行取樣，樣品用液氮速凍后，放在-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)計(jì)算的肉質(zhì)根根形表型數(shù)據(jù)，選取10%左右的極端性狀個(gè)體單株，利用改良的CTAB法分別對(duì)每個(gè)選取的極端單株進(jìn)行DNA提??；利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，同時(shí)用NanoDrop檢測(cè)DNA濃度，然后根據(jù)濃度進(jìn)行樣品DNA等量混池，組成小根形池(S)和大根形池(L)。利用Illumina測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)親本及DNA池進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 QTL-seq分析

利用最新發(fā)表的蘿卜基因組作為參考基因組[20]，使用BWA軟件獲得測(cè)序Clean Reads在參考基因組上的比對(duì)定位結(jié)果，然后使用Picard(http://sourceforge.net/projects/picard/)進(jìn)行去重復(fù)，GATK進(jìn)行局部重比對(duì)、堿基質(zhì)量值校正等預(yù)處理，以保證檢測(cè)得到的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)準(zhǔn)確性，再使用GATK進(jìn)行SNP的檢測(cè)和過(guò)濾，并得到最終的SNP位點(diǎn)集。然后對(duì)SNP進(jìn)行過(guò)濾，首先過(guò)濾掉有多個(gè)基因型的SNP位點(diǎn)，其次過(guò)濾掉read支持度小于4的SNP位點(diǎn)，再次過(guò)濾掉混池之間基因型一致的SNP位點(diǎn)以及隱性混池基因不是來(lái)自于隱性親本的SNP位點(diǎn)，最終得到高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)。根據(jù)QTL-seq方法計(jì)算SNP指數(shù)[10]，以1 Mb為滑動(dòng)窗口，以10 kb為步移，采用DISTANCE方法對(duì)ΔSNP-index進(jìn)行擬合，計(jì)算每個(gè)滑動(dòng)窗口內(nèi)的平均指數(shù)。根據(jù)99%的置信區(qū)間篩選候選QTL位點(diǎn)區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀統(tǒng)計(jì)分析

一共統(tǒng)計(jì)了300株F2單株的肉質(zhì)根長(zhǎng)和橫徑表型數(shù)值，其中肉質(zhì)根長(zhǎng)度最小為55.44 mm，最大為275.17 mm，平均值為123.59 mm；肉質(zhì)根橫徑最大為43.52 mm，最小為104.20 mm，平均為77.73 mm。肉質(zhì)根長(zhǎng)和橫徑均呈現(xiàn)連續(xù)性變化(圖2、圖3)，是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。母本LLYH正常商品肉質(zhì)根(30 d)根形指數(shù)約為0.857，父本CLA正常商品肉質(zhì)根(80 d)根形指數(shù)約為3.750，雜交F1肉質(zhì)根根形指數(shù)約為1.764，F(xiàn)2群體中根形指數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)性變化(圖4)，最小為0.708，最大為3.761，平均值為1.626，暗示根形指數(shù)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳[5]。根據(jù)表型數(shù)值計(jì)算3個(gè)性狀之間的相關(guān)性，其中，肉質(zhì)根長(zhǎng)與根形指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.883，肉質(zhì)根橫徑與根形指數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.448，肉質(zhì)根長(zhǎng)和橫徑的相關(guān)系數(shù)為-0.007(表1)。

圖2 F2群體蘿卜肉質(zhì)根長(zhǎng)度分布

圖3 F2群體蘿卜肉質(zhì)根橫徑分布

圖4 F2群體蘿卜根形指數(shù)分布

表1 表型相關(guān)系數(shù)

根據(jù)肉質(zhì)根根形指數(shù)值，各選取30株極端單株(圖5)，提取DNA，進(jìn)行后續(xù)的極端混池測(cè)序。其中，肉質(zhì)根根形指數(shù)極端小的池根形指數(shù)在0.708～1.028，平均根形指數(shù)為0.908，肉質(zhì)根根形指數(shù)極端大的池的根形指數(shù)在2.407～3.761，平均根形指數(shù)為2.838。

圖5 F2群體中部分極端混池單株圖

2.2 親本及極端混池測(cè)序

本研究經(jīng)測(cè)序得到53.38 Gbp數(shù)據(jù)，平均Q30達(dá)到93.06%，GC含量在37.40%～37.50%之間(表2)。樣品與參考基因組平均比對(duì)效率為96.31%，親本測(cè)序平均深度為16X，極端池測(cè)序平均深度為22.5X，基因組覆蓋度為86.62%(至少一個(gè)堿基覆蓋)，親本及極端池測(cè)序質(zhì)量較好，數(shù)據(jù)量滿足QTL-seq分析要求。利用最新蘿卜參考基因組[20]，經(jīng)檢測(cè)和一系列過(guò)濾后，總共獲得2 159 693個(gè)SNP位點(diǎn)，其中高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)913 322個(gè)，用于后續(xù)QTL-seq分析中SNP-index的計(jì)算。

表2 親本及極端池測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 主效QTL位點(diǎn)的檢測(cè)

根據(jù)QTL-seq方法，計(jì)算獲得△(SNP-index)值，為進(jìn)一步去除假陽(yáng)性SNP，利用SNP在基因組上的物理位置信息，對(duì)相同染色體上Δ(SNP-index)值進(jìn)行擬合，然后以1 Mb為滑動(dòng)窗口，1 kb為步長(zhǎng)進(jìn)行作圖，分別劃定99%(紅色)、95%(藍(lán)色)和90%(綠色)的置信水平作為篩選閾值條件。通過(guò)圖6可以看出，在R2染色體有兩個(gè)峰值區(qū)域超過(guò)99%閾值線，在R6染色體有峰值區(qū)域超過(guò)95%閾值線，在R4染色體有一小段區(qū)域超過(guò)90%閾值線。一共獲得4個(gè)肉質(zhì)根根形指數(shù)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，根據(jù)閾值，其中R2號(hào)染色體有兩個(gè)主效QTL位點(diǎn)rs2.1和rs2.2，R4和R6號(hào)染色體分別有兩個(gè)微效QTL位點(diǎn)rs4.1和rs6.1。根據(jù)SNP位置信息和閾值線獲得QTL位置區(qū)域分別為：rs2.1，21.66～26.03 Mb；rs2.2，30.79～36.56 Mb；rs4.1，39.04～40.43 Mb；rs6.1，11.53～13.40 Mb(圖6，表3)。

表3 肉質(zhì)根根形指數(shù)QTL位點(diǎn)信息匯總表

橫坐標(biāo)為染色體名稱，彩色的點(diǎn)代表計(jì)算出來(lái)的Δ(SNP-index)值，黑色的線為擬合后的Δ(SNP-index)值。其中紅色、藍(lán)色和綠色的線分別代表置信度為0.99、0.95和0.90的閾值線。

3 討論

蘿卜肉質(zhì)根的根形指數(shù)除了受基因遺傳調(diào)控外，還受到環(huán)境與生理等多種復(fù)雜因素的影響，因此，開(kāi)展肉質(zhì)根根形指數(shù)的研究十分有必要，同時(shí)也面臨較多環(huán)境因素的影響，相關(guān)基因的QTL定位較為困難。外界因素像光照、溫度、水分、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、二氧化碳和土壤狀況等均能影響蘿卜肉質(zhì)根的長(zhǎng)度和橫徑，從而影響蘿卜肉質(zhì)根的根形指數(shù)[22-23]；同時(shí)蘿卜肉質(zhì)根的形成過(guò)程中也受到激素的影響，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和乙烯等均能影響蘿卜的長(zhǎng)度和橫徑[24]；此外，也有研究認(rèn)為蘿卜肉質(zhì)根大小受到光合同化物的影響，蔗糖由源(地上部)向庫(kù)(地下部)運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力來(lái)源于蔗糖從葉片的韌皮部裝載，然后在肉質(zhì)根中卸載并儲(chǔ)存的驅(qū)動(dòng)[25]。由于蘿卜肉質(zhì)根生長(zhǎng)在地下，肉眼難以直接觀察，必須將蘿卜拔出進(jìn)行性狀統(tǒng)計(jì)，這也增加了表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)誤差，使QTL定位準(zhǔn)確度降低，增加了基因挖掘的難度。本研究利用肉質(zhì)根根形指數(shù)差異較大的親本配制了分離群體，所有材料全部種植在土質(zhì)疏松、透水性較好的砂質(zhì)土地塊，種植過(guò)程中也保持水肥一致均衡，盡量減小了外界因素對(duì)肉質(zhì)根生長(zhǎng)的影響，以保證定位結(jié)果的準(zhǔn)確性。因?yàn)橛H本生長(zhǎng)周期差異也較大，小型扁圓蘿卜LLYH與大型長(zhǎng)白蘿卜CLA相比，正常生長(zhǎng)周期短近50 d，所以F2單株每個(gè)蘿卜的生長(zhǎng)周期也不同，本研究采取了集中統(tǒng)一采收的方式，在生長(zhǎng)期45 d時(shí)，全部進(jìn)行肉質(zhì)根長(zhǎng)度和橫徑的表型數(shù)據(jù)測(cè)量；此時(shí)，有的蘿卜可能已經(jīng)超過(guò)了正常的生長(zhǎng)期，有的蘿卜可能剛完成正常生長(zhǎng)周期，達(dá)到商品蘿卜要求，有的蘿卜可能還處于生長(zhǎng)發(fā)育早期，這也可能對(duì)定位結(jié)果造成一定的影響，因此，定位結(jié)果中也有可能存在與肉質(zhì)根生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的QTL位點(diǎn)。

前人研究多集中在不同發(fā)育時(shí)期蘿卜肉質(zhì)根轉(zhuǎn)錄組、miRNA和蛋白質(zhì)組方面。Zaki等[26]發(fā)現(xiàn)，有11個(gè)基因在兩個(gè)不同肉質(zhì)根形狀的蘿卜中存在明顯差異；Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，植物激素在肉質(zhì)根的發(fā)育過(guò)程中起了重要作用；Mitsui等[2]對(duì)肉質(zhì)根發(fā)育時(shí)期做了詳細(xì)生物學(xué)觀察和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝相關(guān)基因在發(fā)育的肉質(zhì)根中表現(xiàn)活躍，尤其是在細(xì)胞增殖的組織中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)蔗糖合酶(SUS1)基因與肉質(zhì)根發(fā)育相關(guān)；余如剛[1]分析了2個(gè)蘿卜蔗糖代謝基因RsSuSy1和RsSPS1基因，克隆分析了蘿卜肉質(zhì)根形成相關(guān)RsCLE41和RsSAUR；杜雪玲等[9]發(fā)現(xiàn)，植物激素合成與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、蔗糖代謝相關(guān)基因和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因可能是調(diào)控蘿卜肉質(zhì)根大小品種間差異的關(guān)鍵基因；Muvva等[27]在蘿卜中發(fā)現(xiàn)了48個(gè)保守miRNAs，并預(yù)測(cè)了16個(gè)潛在的基因；余如剛[1]預(yù)測(cè)了191個(gè)肉質(zhì)根膨大過(guò)程中差異表達(dá)miRNA的靶基因，另外通過(guò)DGE和miRNAs關(guān)聯(lián)分析，鑒定到114對(duì)miRNA-mRNA。此外，姜立娜[28]在肉質(zhì)根發(fā)育不同時(shí)期發(fā)現(xiàn)25個(gè)差異明顯蛋白點(diǎn)，并對(duì)差異蛋白基因情況進(jìn)行了分析。以上研究發(fā)現(xiàn)的差異基因可以結(jié)合QTL定位結(jié)果，去挖掘定位區(qū)域內(nèi)的差異基因，并驗(yàn)證候選基因是否與肉質(zhì)根的大小相關(guān)；通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多組學(xué)聯(lián)合的方法系統(tǒng)分析蘿卜肉質(zhì)根的膨大機(jī)理。不過(guò)，前期研究雖然發(fā)現(xiàn)了較多差異基因，但是這些差異基因相關(guān)序列信息難以查找匯總；各項(xiàng)研究可能參考了不同版本蘿卜基因組，不同版本蘿卜基因組存在的差異也使相關(guān)差異基因的序列難以進(jìn)行匯總分析。

蔬菜變態(tài)根的發(fā)育受到外部環(huán)境和內(nèi)部遺傳因素的綜合影響，涉及細(xì)胞周期、植物激素、轉(zhuǎn)錄因子等不同方面的調(diào)控，目前，對(duì)蔬菜變態(tài)根發(fā)育的研究還處于初步階段[3]。蘿卜是典型的變態(tài)根類蔬菜，肉質(zhì)根大小和形狀相關(guān)研究較少，蘿卜肉質(zhì)根大小和形狀QTL定位研究可以參考番茄、甜瓜和黃瓜等果實(shí)大小和形狀的相關(guān)研究[29-31]，但相較于果實(shí)性狀的研究，長(zhǎng)在地下的肉質(zhì)根相關(guān)性狀明顯難度更大，相關(guān)的調(diào)控機(jī)理也存在較大差異。目前，關(guān)于蘿卜肉質(zhì)根根形指數(shù)性狀的QTL定位研究較少，前期雖有利用連鎖群進(jìn)行根形指數(shù)定位研究[5]，但因?yàn)檫z傳圖譜精度不夠，上圖標(biāo)記較少，所用材料存在差異等因素，較難進(jìn)行對(duì)比。蘿卜根形指數(shù)研究還需要開(kāi)展更多的QTL定位研究，發(fā)現(xiàn)一些一致性的QTL位點(diǎn)，并結(jié)合特殊的群體和先進(jìn)測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行后續(xù)的基因精細(xì)定位和功能驗(yàn)證研究。