菜用大豆籽粒中蔗糖的遺傳與調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

張偉梅，張古文，馮志娟，劉 娜，王 斌，卜遠(yuǎn)鵬，*

(1.浙江省麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

菜用大豆，也常被稱為“鮮食大豆”或“毛豆”，屬于豆科，大豆屬，栽培大豆種[Glycinemax(L.)Merri.]，是在粒寬達(dá)到莢寬的80%～90%，籽粒飽滿，豆莢和籽粒顏色翠綠時(shí)采收的大豆[1-2]。菜用大豆自宋代起即在中國發(fā)展[1]，目前其生產(chǎn)和貿(mào)易在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。我國菜用大豆年種植面積約40萬hm2，總產(chǎn)量超過400萬t，年產(chǎn)值約100億元，是世界上最大的菜用大豆生產(chǎn)國和出口國，出口量約占世界總量的52%[3]，雖然美國引領(lǐng)著世界大豆的生產(chǎn)和出口，但是其對(duì)菜用大豆消費(fèi)量的約40%依靠從中國進(jìn)口[4]。

菜用大豆的品質(zhì)對(duì)其市場接受度和價(jià)格起著決定性作用。菜用大豆的品質(zhì)主要體現(xiàn)在食味品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、外觀品質(zhì)等方面，其中食味品質(zhì)主要包括入口后能夠明顯感知的甜味、香味、鮮味和質(zhì)地[5]，是菜用大豆作為休閑食品消費(fèi)時(shí)最重要的性狀[6]。優(yōu)良的食味品質(zhì)不僅可以在感官上給消費(fèi)者帶來愉悅的體驗(yàn)，而且也直接影響人體對(duì)菜用大豆的消化和吸收，是目前菜用大豆品質(zhì)研究的重點(diǎn)[7]。甜味是菜用大豆區(qū)別于普通粒用型大豆的顯著特征之一，消費(fèi)者尤其青年消費(fèi)者喜歡較甜的菜用大豆[8-9]。通常認(rèn)為菜用大豆的甜味主要?dú)w因于可溶性糖含量[10]，可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖以及棉子糖家族寡糖(棉子糖、水蘇糖)等[11]，其中蔗糖含量為21.1～102.0 mg·g-1，約占可溶性總糖的71%[12]，是麥芽糖的2.34倍，果糖的14.8倍，葡萄糖的19.1倍[13]，與甜度極顯著正相關(guān)(r=0.977，P<0.01)，是決定菜用大豆甜度的關(guān)鍵因素[9]；同時(shí)蔗糖含量是影響菜用大豆食味品質(zhì)的最主要因素[14]，與感官評(píng)分極顯著正相關(guān)(r=0.864，P<0.01)[11]。因此，提升蔗糖含量是菜用大豆栽培和品種選育研究的焦點(diǎn)[15]。

菜用大豆蔗糖含量與栽培管理、貯藏條件、發(fā)育時(shí)期以及品種特性等相關(guān)[12，16-18]。苗期施鉀肥能夠顯著提高菜用大豆籽粒蔗糖濃度，葉面增施鉀肥可進(jìn)一步提高蔗糖濃度[19-20]；此外烯效唑和氨基乙酸二乙酯(DA-6)等植物生長調(diào)節(jié)劑也可促進(jìn)蔗糖在菜用大豆籽粒中的積累[21]。貯藏條件對(duì)菜用大豆的蔗糖含量影響很大，當(dāng)菜用大豆采收后在25 ℃下保存1 d后，蔗糖含量降幅達(dá)60%以上；若采收后立即分別保存于-20 ℃和-4 ℃環(huán)境中，11 d后蔗糖含量僅比剛采收時(shí)分別下降9.2%～13.5%和20.2%～24.1%[22]。大豆籽粒中蔗糖一般是隨著種子的成熟呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在R6期(鼓粒期)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，R8期(成熟期)約降至R6期的77.9%[23-24]。菜用大豆籽粒蔗糖含量在不同品種中差異巨大，侯金鋒[25]對(duì)來源我國不同地區(qū)的323份大豆種質(zhì)資源鮮食期籽粒蔗糖含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，其變化范圍是11.4～47.5 mg·g-1，品種特性是影響菜用大豆蔗糖含量的決定性因素，品種改良是提高菜用大豆蔗糖含量的根本的方法。解析和歸納蔗糖在菜用大豆籽粒中的遺傳與調(diào)控機(jī)制，對(duì)于加速菜用大豆食味品質(zhì)的遺傳改良，提升我國菜用大豆的國際市場競爭力具有重要意義。本文主要對(duì)菜用大豆籽粒中蔗糖積累的遺傳基礎(chǔ)、蔗糖代謝過程中關(guān)鍵酶及同源基因的克隆與調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)行了歸納總結(jié)，并展望了今后菜用大豆蔗糖含量遺傳改良發(fā)展趨勢，以期為菜用大豆食味品質(zhì)的提升提供參考依據(jù)。

1 大豆籽粒中蔗糖含量的遺傳機(jī)制研究

蔗糖含量對(duì)菜用大豆以及豆腐、豆?jié){、納豆等多種食用大豆的品質(zhì)具有重要影響[26]，為改良大豆品質(zhì)，育種家們做了大量工作探究蔗糖含量的遺傳基礎(chǔ)。研究表明，大豆蔗糖含量具有較高的遺傳率(H2=0.74～0.79)[27-29]，在雜交后代中普遍存在超親現(xiàn)象，因此大豆中蔗糖含量受加性基因控制，對(duì)雜交后代進(jìn)行連續(xù)選擇可以獲得較大的遺傳增益[29-31]。Mebrahtu等[32]利用10份菜用大豆種質(zhì)通過完全雙列雜交方法對(duì)蔗糖積累的遺傳規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，大多數(shù)表現(xiàn)出顯著負(fù)特殊配合力效應(yīng)的雜交組合往往親本之一或雙方具有較低的一般配合力效應(yīng)，因此，菜用大豆蔗糖含量主要受加性或加性×顯性基因控制；由于非加性方差顯著，育種過程中可采用“單粒傳法”等使雜交后代迅速純合，同時(shí)為后代保留較大的選擇壓力，至F5或F6時(shí)在多環(huán)境下對(duì)優(yōu)良株系進(jìn)行選擇鑒定。

由于蔗糖含量的測定工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，為通過分子標(biāo)記輔助選擇加速食用大豆品種改良進(jìn)程，目前已經(jīng)挖掘到一批與大豆籽粒蔗糖含量緊密連鎖的位點(diǎn)/分子標(biāo)記(表1)。2000年Maughan等[33]使用包含164個(gè)RFLP、6個(gè)SSR和3個(gè)RAPD的分子標(biāo)記首次對(duì)蔗糖含量進(jìn)行了QTL分析，在7個(gè)連鎖群上共鑒定到17個(gè)與大豆蔗糖含量緊密連鎖的分子標(biāo)記。隨后又有許多研究人員相繼進(jìn)行了蔗糖含量相關(guān)的QTL定位研究[27-29，34]。Kim等[27]利用Keunolkong×Iksan10衍生的F2:10重組自交系(RIL)群體，基于99個(gè)SSR標(biāo)記和2個(gè)形態(tài)學(xué)標(biāo)記，通過單因素方差分析和多元回歸的方法檢測到3個(gè)與蔗糖含量連鎖的QTL，其中位于L連鎖群上Satt278-Satt523區(qū)間內(nèi)存在一個(gè)主效QTL，可解釋21.39%的表型變異；隨后該研究者使用Keunolkong×Shinpaldalkong衍生的RIL群體，基于108個(gè)SSR標(biāo)記和2個(gè)形態(tài)學(xué)標(biāo)記檢測到2個(gè)QTL[29]。但上述研究由于可用的標(biāo)記數(shù)目少，導(dǎo)致QTL定位結(jié)果的分辨率不足，限制了研究結(jié)果在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。近年來高通量基因分型技術(shù)快速發(fā)展，為蔗糖含量相關(guān)QTL的精細(xì)定位提供了便利。Lee等[34]使用Axiom?180K SoyaSNP芯片對(duì)Kim等[27]報(bào)道的RIL群體進(jìn)行基因分型，使用其中8 967個(gè)高質(zhì)量分子標(biāo)記構(gòu)建高密度連鎖圖譜，通過完備區(qū)間作圖法對(duì)蔗糖含量進(jìn)行精細(xì)定位，鑒定到3個(gè)QTL，其中qtl_SUC3位于19號(hào)染色體，LOD=11.73，可解釋36.87%的表型變異；前人在19號(hào)染色體上將蔗糖含量的QTL定位在33 000～36 700 kb[27，29，33]，而qtl_SUC3將定位區(qū)間進(jìn)一步縮小至34 327～34 692 kb，區(qū)間內(nèi)包含18個(gè)候選基因。Zeng等[28]使用MFS-553×PI 243 545衍生的不同世代的家系群體，分別使用兩套分子標(biāo)記在3個(gè)不同環(huán)境下檢測到3個(gè)蔗糖含量相關(guān)的新的QTL。除了以上通過基于家系群體的連鎖作圖方法定位蔗糖相關(guān)QTL之外，Vaughn等[35]分別使用2個(gè)不同的自然群體，通過關(guān)聯(lián)分析鑒定到3個(gè)與蔗糖含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP。目前相關(guān)研究的對(duì)象多是成熟大豆籽粒，對(duì)于鮮食期菜用大豆籽粒蔗糖含量的QTL定位研究鮮見報(bào)道。Hou等[36]使用323份來自全中國不同地區(qū)栽培大豆，使用101個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)鮮食期大豆籽粒中的蔗糖含量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，共鑒定到9個(gè)蔗糖相關(guān)的標(biāo)記分布于9個(gè)不同的連鎖群上，但其中不存在不同環(huán)境下可以穩(wěn)定檢測到的標(biāo)記，表明菜用大豆蔗糖含量可能是由多個(gè)易受環(huán)境影響的微效基因共同控制的。由于效應(yīng)值較低，在性狀改良過程中，進(jìn)行分子輔助選擇或特異片段的導(dǎo)入等應(yīng)用時(shí)，單個(gè)位點(diǎn)的作用可能效果有限，需要多個(gè)位點(diǎn)的協(xié)同選擇或共同導(dǎo)入。同時(shí)，許多主效QTL在不同的研究中不能被重復(fù)檢測到，原因可能是控制蔗糖含量的大效應(yīng)等位基因較少或基因×環(huán)境的互作效應(yīng)較強(qiáng)[28，35]，因此在更廣泛的遺傳群體中發(fā)掘含有更強(qiáng)遺傳效應(yīng)的等位基因資源尤為重要[37]。

表1 目前已定位的與大豆籽粒蔗糖含量相關(guān)的位點(diǎn)/分子標(biāo)記

菜用大豆中總可溶性糖含量約為59.7 mg·g-1，其中蔗糖含量最高，為43.1 mg·g-1，其次是棉子糖和水蘇糖，分別為2.1 mg·g-1和1.1 mg·g-1，葡萄糖和果糖含量更低，二者之和約1.7 mg·g-1[11]。蔗糖、葡萄糖和果糖有利于提升豆制品的風(fēng)味，而棉籽糖和水蘇糖等寡聚糖雖然可以促進(jìn)雙歧桿菌生長，具有維持腸道正常功能的生理活性[38]，但是同時(shí)這類糖屬于抗?fàn)I養(yǎng)因子，不能被體內(nèi)的酶分解而會(huì)引起非反芻動(dòng)物的腸胃脹氣和腹瀉[39]，此外還能產(chǎn)生不良風(fēng)味[37，40]。在大豆籽粒發(fā)育過程中，低聚糖家族的合成要以消耗蔗糖和肌醇半乳糖苷為代價(jià)，因此育種家可以通過降低大豆籽粒中低聚糖含量而增加蔗糖含量，實(shí)現(xiàn)大豆食味和營養(yǎng)品質(zhì)的改良[41]。Skoneczka等[37]使用一個(gè)蔗糖含量升高、水蘇糖降低的突變體材料PI200508作為親本之一構(gòu)建了2個(gè)F2群體，將QTL定位在C2連鎖群上標(biāo)記1157BAT21和157MAT36之間的724 kb的范圍內(nèi)，該區(qū)間共包含66個(gè)預(yù)測基因，將其中1個(gè)半乳糖基轉(zhuǎn)移基因的同源基因作為候選基因，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因上存在一個(gè)3 bp的缺失導(dǎo)致棉籽糖合酶功能突變，將該位點(diǎn)開發(fā)成標(biāo)記Rsm1，與Rsm1共分離的QTL分別可解釋60%和76%的蔗糖含量表型變異。隨后研究者又發(fā)現(xiàn)棉籽糖合成酶2(RS2，Glyma.06g179200)和3(RS3，Glyma.05g003900)基因的突變基因同時(shí)存在時(shí)可以獲得超低低聚糖表型[42]。RS2中存在的一個(gè)3 bp堿基缺失突變，導(dǎo)致第331位氨基酸從高度保守的色氨酸變?yōu)槠鹗济艽a子[43]，或由于一個(gè)錯(cuò)義突變使第107位的蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼醄44]，二者都可降低大豆籽粒中低聚糖含量而對(duì)其他農(nóng)藝性狀不造成不良影響。最新的一項(xiàng)研究表明，當(dāng)存在RS2突變等位基因時(shí)，可直接對(duì)RS3等位基因的新變體(rs3snp5，rs3snp6)和錯(cuò)義等位基因(rs3G75E)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可快速獲得超低低聚糖株系[41]。

2 蔗糖的合成與代謝調(diào)控機(jī)制研究

目前植物中蔗糖的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與分解途徑已較為明確[45]，概括地講，CO2在葉綠體中通過開爾文循環(huán)固定并轉(zhuǎn)化為磷酸丙糖(Triose-P)；一部分Triose-P轉(zhuǎn)化為ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADP-Glc)，進(jìn)而合成淀粉，淀粉在夜間又分解為葡萄糖(glucose，Glc)或麥芽糖(Maltose，Mal)后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)；還有一部分Triose-P直接轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中為呼吸作用等其他新陳代謝過程提供原料。Glc在己糖激酶作用下發(fā)生磷酸化產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-phosphate，Glc-6-P)，在Glc-6-P異構(gòu)酶的催化下轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，F(xiàn)ru-6-P)，一部分Fru-6-P進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)，蔗糖磷酸合酶(Suc-phosphate synthase，SPS)以Fru-6-P和UDP-Glc為底物合成磷酸蔗糖(Suc-phosphate，Suc-P)，進(jìn)而在磷酸蔗糖磷酸酶(Suc-phosphate phosphatase，SPP)作用下轉(zhuǎn)化為蔗糖(sucrose，Suc)。由此，Suc作為植物光合作用碳同化的最初能量和碳源供體，通過韌皮部篩管分子/伴細(xì)胞復(fù)合體或胞間連絲裝載入韌皮部，隨著蔗糖的積累增多水分滲透進(jìn)來產(chǎn)出高膨壓，驅(qū)動(dòng)同化產(chǎn)物向其他器官尤其合成代謝活躍的果實(shí)或種子、塊莖等庫器官運(yùn)輸[46]。

蔗糖磷酸合酶(SPS)的主要功能是調(diào)節(jié)蔗糖和淀粉的分配，參與細(xì)胞的分化及纖維細(xì)胞壁的合成，影響植物的生長發(fā)育，影響植物種子、果實(shí)的品質(zhì)，參與植物的耐逆響應(yīng)等[25]，是植物細(xì)胞質(zhì)中蔗糖合成的主要限速酶[47]，是影響大豆葉片中蔗糖合成的關(guān)鍵酶[48]。在菜用大豆籽粒發(fā)育過程中，SPS的活性逐漸升高，在花后24～36 d升高幅度顯著加快，之后又趨于緩慢；高蔗糖含量的菜用大豆品種SPS的活性高于低蔗糖含量的品種[49]。SPS活性與菜用大豆子葉和胚軸的蔗糖含量顯著正相關(guān)，SPS活性的峰值與菜用大豆籽粒各部位蔗糖含量的峰值重合，處于菜用大豆鮮莢的采摘期，較高的SPS活性有利于菜用大豆食用品質(zhì)的提高[15]。SPS家族具有滲透脅迫位點(diǎn)[50]、14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)[51]和光調(diào)控位點(diǎn)[52]三個(gè)保守的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化可調(diào)節(jié)SPS的活性。對(duì)SPS蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在SPS上除了含有與轉(zhuǎn)移葡糖基功能相關(guān)的N端葡糖基轉(zhuǎn)移區(qū)外，還含有C端磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)類似區(qū)及中間的連接區(qū)，使SPS與SPP結(jié)合形成復(fù)合體催化蔗糖的合成反應(yīng)[53]。徐志華[54]在菜用大豆中對(duì)擬南芥AtSPP1進(jìn)行同源克隆獲得了GmSPP1，表達(dá)模式分析表明GmSPP1的表達(dá)量變化與GmSPS1表達(dá)量變化一致，其表達(dá)量隨著籽粒發(fā)育逐漸升高；在擬南芥中過表達(dá)GmSPP1可使轉(zhuǎn)基因株系種子中的蔗糖含量顯著升高。

運(yùn)輸?shù)綆於说恼崽切遁d后再進(jìn)行水解得到己糖產(chǎn)物，己糖不僅作為植物異養(yǎng)的底物，還作為一種信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和發(fā)育[55-56]。植物中具備蔗糖分解功能的酶有兩類，分別為蔗糖合酶(sucrose synthase，SS，也簡稱SuSy/SUS等，EC2.4.1.13)和轉(zhuǎn)化酶(invertase，INV，EC3.2.1.26)。SUS和INV在庫端將蔗糖分解，形成從源到庫的蔗糖濃度梯度，為蔗糖由韌皮部向果實(shí)的運(yùn)輸提供壓力，保證蔗糖向庫中的持續(xù)供應(yīng)[57]。質(zhì)外體途徑的蔗糖要通過細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase，CWIN)水解為葡萄糖(Glc)和果糖(Fru)之后才能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，此外Glc還可能通過G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(regulator of G-protein signaling，RGS)作為一種信號(hào)分子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；通過胞間連絲或蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的蔗糖被細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase，CIN)和SUS水解，產(chǎn)生的己糖用于合成淀粉、纖維素和果聚糖等多聚糖，或參與糖酵解過程和磷酸戊糖途徑為脂肪、蛋白質(zhì)等的合成提供原料。此外，己糖的水平還可以被核定位己糖激酶(hexokinase，HXK)或其他蛋白質(zhì)感知進(jìn)而對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，己糖和蔗糖也可直接調(diào)節(jié)含有糖應(yīng)答元件的基因的轉(zhuǎn)錄(包括編碼轉(zhuǎn)錄因子)。

蔗糖合酶(SUS)是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的可逆的酶，既可催化蔗糖合成又可催化分解。在菜用大豆花后9～30 d，SUS活性以分解方向?yàn)橹?，但隨著發(fā)育的進(jìn)行，其分解活性逐漸下降，合成活性逐漸升高；花后30～36 d合成活性均驟然升高；36～42 d，SUS合成活性和分解活性保持相對(duì)穩(wěn)定[49]。SUS催化的蔗糖合成和分解過程可為植物中的淀粉、胼胝質(zhì)和纖維素等多糖物質(zhì)的生物合成提供底物，故在植物碳源分配中起關(guān)鍵調(diào)控作用，進(jìn)而對(duì)相關(guān)重要農(nóng)藝性狀和非生物脅迫響應(yīng)發(fā)揮重要作用[57]。鑒定和克隆植物的SUS基因是了解其生理功能和代謝機(jī)制的第一步，利用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因家族分析是基因功能研究的前提。目前已從玉米、水稻和陸地棉等多種作物中對(duì)SUS基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，并發(fā)現(xiàn)該家族在作物生長和產(chǎn)量形成中發(fā)揮著重要的作用[58]。晁毛妮等[59]在大豆基因組共鑒定到12個(gè)SUS基因家族成員，其中GmSUS8在種子中表達(dá)量最高，其他組織表達(dá)量很低。SUS基因?qū)ΨN子發(fā)育調(diào)控作用在擬南芥[60]、普通菜豆[61]和棉花[62]等許多植物中已經(jīng)被證明，因此推測GmSUS8在大豆種子發(fā)育過程中起著重要作用。GmSUS1、GmSUS5和GmSUS7在大豆根瘤中特異性高表達(dá)，蔗糖代謝為豆科植物的根瘤提供碳骨架能量[63]，且固氮作用相關(guān)的蛋白也依賴于SUS的活性[64]，表明它們可能在大豆固氮過程中起著重要作用。生長發(fā)育過程中的低溫、干旱和鹽脅迫等均會(huì)對(duì)大豆產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，SUS家族基因如擬南芥AtSUS1[60]，大麥HvSUS1和HvSUS3[65]等在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過程中起著重要作用，但是關(guān)于大豆SUS基因在逆境條件下的表達(dá)特性及其對(duì)大豆生長發(fā)育的影響目前還不清楚。因此，加強(qiáng)對(duì)菜用大豆SUS基因的研究不僅對(duì)于提升菜用大豆蔗糖品質(zhì)具有重要意義，而且對(duì)于增進(jìn)人們對(duì)菜用大豆的產(chǎn)量生理、籽粒發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。目前相關(guān)研究仍需繼續(xù)深入，研究成果可能為將來菜用大豆品質(zhì)和抗逆育種提供重要的基因信息。

轉(zhuǎn)化酶(INV)是一個(gè)催化不可逆反應(yīng)的酶，能將蔗糖分解成果糖和葡萄糖。根據(jù)其最適pH可分為兩種類型：中性/堿性轉(zhuǎn)化酶(NI)，其最佳pH為7.0～7.8，位于細(xì)胞質(zhì)中，也稱為細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase，CIN)，CIN通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)己糖的積累水平間接調(diào)控蔗糖的代謝，對(duì)于維持體內(nèi)糖和活性氧平衡具有重要作用[66]；而酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)的最佳pH為4.5～5.5，包括緊密結(jié)合在細(xì)胞壁的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase，CWIN)和存在于液泡中的液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase，VIN)[67]，CWIN在韌皮部卸載和庫發(fā)育中具有重要作用，VIN一般有利于糖積累和細(xì)胞擴(kuò)增[68]。菜用大豆籽粒灌漿過程中不同部位AI活性變化較大，只有種皮中AI活性變化與種皮蔗糖積累的相關(guān)性達(dá)到顯著水平且活性顯著高于其他部位，但未引起相同時(shí)期種皮蔗糖含量變化，所以推斷種皮是AI發(fā)揮調(diào)節(jié)蔗糖在庫端的卸載和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的主要場所，這與種皮高度維管化有關(guān)。菜用大豆籽粒不同組織的NI的活性差異較小，且變化趨勢相似，在灌漿初期活性高并隨著籽粒的成熟呈一直下降趨勢[15]。

蔗糖在成熟葉片(源)中合成后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到異養(yǎng)組織(庫)中以滿足植物生長發(fā)育的需要。高等植物體內(nèi)蔗糖的跨膜運(yùn)輸及其在植物中的分配需要依賴于膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sucrose/H+symporters，也稱Sucrose/H+cotransporters或Sucrose/H+transporters，SUCs或SUTs)[69]。SUC/SUT家族屬于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)，包括SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5 5個(gè)亞家族[70]。目前，在高等植物中已克隆到80多個(gè)SUC/SUT基因，其中在擬南芥中克隆了9個(gè)SUC基因，分別屬于SUT1、SUT2和SUT4 3個(gè)亞家族[71]，T-DNA插入AtSUC2后，突變體植株?duì)I養(yǎng)組織內(nèi)有大量蔗糖和淀粉沉積，而將AtSUC2重新導(dǎo)入突變體植株后，營養(yǎng)組織內(nèi)蔗糖與淀粉的轉(zhuǎn)運(yùn)水平均恢復(fù)正常[72]；抑制馬鈴薯中StSUT1的表達(dá)，可引起塊莖變小且數(shù)量減少，成熟葉片中糖分積累增加[73]，因此SUC/SUT基因與蔗糖的運(yùn)輸和碳分配密切相關(guān)，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的調(diào)控作用[74]。在菜用大豆籽粒發(fā)育過程中，蔗糖結(jié)合蛋白2(sucrose-binding protein 2，SBP 2)前體的上調(diào)表達(dá)可能有助于提高菜用大豆籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)，表明蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能對(duì)菜用大豆蔗糖的調(diào)控起著重要的作用[75]。張玉梅等[76-77]分別以擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Q39232和O80605在大豆基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對(duì)，獲得了其中的兩條SUT序列，在菜用大豆閩豆6號(hào)中克隆得到了GmSUT和Glyma18g15950，其中GmSUT與大豆參考基因組Williams 82中的Glyma10g36200相似性達(dá)到99.98%，屬于MFS超家族，與綠豆(Vignaradiatavar.radiata)的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)93.28%，將該蛋白與擬南芥的9個(gè)SUC蛋白比對(duì)表明GmSUT與AtSUC2的親緣關(guān)系最近，屬于SUT1亞族；而Glyma18g15950蛋白屬于MFS-2超家族，Glyma18g15950與AtSUC3的親緣關(guān)系最近，屬于SUT2亞族。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)分析及功能驗(yàn)證提供了理論參考[77]。

植物果實(shí)蔗糖積累受一系列因子如蔗糖的合成、運(yùn)輸、分配及在果實(shí)中的代謝等的共同作用，其中蔗糖在果實(shí)中的分解強(qiáng)度是增強(qiáng)庫強(qiáng)、提高糖卸載能力、保證新合成的蔗糖由源到庫不斷運(yùn)輸?shù)闹匾h(huán)節(jié)，源庫之間蔗糖濃度的梯度差將調(diào)節(jié)籽粒中蔗糖的輸入速率[78]。在菜用大豆籽粒發(fā)育早期，即花后30 d之前，SUS的活性以分解方向?yàn)橹?，INV也維持較高活性，SPS活性雖緩慢上升，但整個(gè)蔗糖代謝酶系統(tǒng)的凈活性為負(fù)值，蔗糖代謝以分解為主，使籽粒維持較低水平的蔗糖濃度，形成源庫之間的濃度梯度，促進(jìn)蔗糖向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)；到花后30～36 d，籽粒發(fā)育至中期，SUS合成方向活性迅速升高，分解方向活性持續(xù)下降，同時(shí)INV也維持在較低活性，總體蔗糖代謝相關(guān)酶的凈活性為正值，蔗糖代謝以合成為主，蔗糖含量顯著升高；開花36 d之后籽粒發(fā)育進(jìn)入后期，蔗糖分解速率開始加快，形成的單糖為籽粒蛋白質(zhì)和脂肪等貯藏物質(zhì)的快速合成提供了充足的碳源[49]。菜用大豆籽粒中蔗糖的含量并非受某一種酶絕對(duì)調(diào)控，當(dāng)種皮中AI活性不高時(shí)，源端輸入的蔗糖不能及時(shí)分解而轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中，會(huì)導(dǎo)致SPS催化的底物缺失而降低活性，致使籽粒中蔗糖含量下降；在SUS活性較高時(shí)，籽粒中蔗糖分解速度加快，雖然不利于蔗糖的積累，卻加大了源庫兩端蔗糖的梯度差，從而促進(jìn)蔗糖向籽粒的運(yùn)輸。不同菜用大豆品種相關(guān)酶基因的表達(dá)存在明顯差異，因此，在選育品種時(shí)應(yīng)注意，蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性在合成和分解兩個(gè)方向上均較高的品系更有潛力發(fā)展成高蔗糖含量品種[15]。

3 菜用大豆蔗糖含量遺傳改良發(fā)展展望

傳統(tǒng)育種方法對(duì)于培育和改良菜用大豆品質(zhì)做出了突出貢獻(xiàn)。但由于菜用大豆蔗糖含量屬于由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，表型受環(huán)境效應(yīng)的影響很大，傳統(tǒng)育種存在的選擇效率低、育種周期長和成本高等缺點(diǎn)，難以滿足人們對(duì)高品質(zhì)、多樣化的菜用大豆品種的需求，因此，迫切需要對(duì)傳統(tǒng)育種技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。借助分子標(biāo)記輔助選擇、重組DNA技術(shù)、基因編輯和多組學(xué)技術(shù)(基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、離子組)等現(xiàn)代育種技術(shù)，是未來大幅提升菜用大豆的品質(zhì)和產(chǎn)量的重要途徑[79]。

3.1 通過全基因組選擇的方法加速菜用大豆蔗糖相關(guān)的微效基因的聚合

由于目前已經(jīng)定位的不同QTL在不同的親本組合和環(huán)境中的效應(yīng)值具有較大差異，因此，要成功將前人已報(bào)道的分子標(biāo)記應(yīng)用于自己的育種過程，必須充分考慮作圖群體、表型測定方法、重復(fù)和環(huán)境、遺傳分析方法、遺傳變異的豐度等多種因素，并進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，當(dāng)一個(gè)與原始群體至少有一個(gè)共有親本的獨(dú)立群體，在一個(gè)獨(dú)立的環(huán)境中對(duì)一個(gè)QTL進(jìn)行評(píng)估時(shí)，實(shí)驗(yàn)誤差<0.01時(shí)才能確認(rèn)這個(gè)QTL的有效性[80]。同時(shí)，菜用大豆蔗糖含量相關(guān)的主效位點(diǎn)較少，且效應(yīng)值不大，可能還受到許多未檢測出來的微效基因的控制，因此，育種中既要注意主效位點(diǎn)的利用，又要考慮微效多基因的積聚。僅有與菜用大豆蔗糖含量連鎖的標(biāo)記是不夠的，一個(gè)完整的育種計(jì)劃還需要農(nóng)藝性狀的標(biāo)記資料和合理的育種設(shè)計(jì)，包括回交代數(shù)、每個(gè)世代需要保留的個(gè)體數(shù)等等，最好有一張高密度的分子遺傳圖譜，可以進(jìn)行全基因組選擇[81]。RTM-GWAS方法能夠相對(duì)全面地解析植物種質(zhì)/育種群體數(shù)量性狀的QTL體系，其檢測結(jié)果可以全面反映群體數(shù)量性狀遺傳構(gòu)成，從而能夠進(jìn)一步從全基因組QTL水平對(duì)育種親本組合進(jìn)行潛力預(yù)測及優(yōu)化組合設(shè)計(jì)，基于QTL-allele矩陣，可通過設(shè)計(jì)分子標(biāo)記進(jìn)一步應(yīng)用于雙親后代選擇，從而提高選擇效率、縮短育種周期[82]。

3.2 解析蔗糖與其他相關(guān)性狀之間的遺傳關(guān)系，實(shí)現(xiàn)菜用大豆食味品質(zhì)的協(xié)同改良

一般來講，菜用大豆品質(zhì)性狀相關(guān)QTL具有多效性，彼此緊密連鎖[29，33]，品質(zhì)相關(guān)的不同性狀之間往往存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，若提高某一物質(zhì)含量往往以犧牲另一重要性狀為代價(jià)，要通過傳統(tǒng)育種手段實(shí)現(xiàn)品質(zhì)改良，往往顧此失彼。例如，菜用大豆蔗糖含量與蛋白質(zhì)含量之間具有顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.424，P<0.05)[11]，蔗糖相關(guān)的主效QTL同時(shí)也與蛋白質(zhì)含量緊密連鎖[33]，在提高蔗糖含量的同時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的降低[33]。在進(jìn)行菜用大豆蔗糖含量QTL分析時(shí)，可同時(shí)對(duì)與蔗糖緊密相關(guān)的多個(gè)性狀進(jìn)行研究，尋找具有協(xié)同增效或?qū)ζ湟辉鲂?duì)其他性狀無減效的QTL或分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記輔助選擇，實(shí)現(xiàn)菜用大豆品質(zhì)性狀的協(xié)同改良[83]。關(guān)聯(lián)性狀間的條件QTL分析可以對(duì)緊密相關(guān)的性狀間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分解，從單個(gè)QTL或基因水平上探索兩性狀間緊密相關(guān)的內(nèi)在遺傳基礎(chǔ)[84]，區(qū)分一因多效或多因一效對(duì)目標(biāo)性狀的影響，尤其重要的是可以鑒定對(duì)某一性狀具有正效應(yīng)但同時(shí)對(duì)與其負(fù)相關(guān)的性狀無負(fù)效應(yīng)的重要QTL/基因，對(duì)打破許多重要農(nóng)藝性狀間顧此失彼的矛盾有非常重要的意義，目前該方法在菜用大豆籽粒硬度的遺傳基礎(chǔ)研究中已經(jīng)被報(bào)道[85]。

3.3 充分利用最新的分子生物學(xué)手段，實(shí)現(xiàn)菜用大豆蔗糖含量的精準(zhǔn)改良

而近年來，隨著大豆基因組數(shù)據(jù)的逐步完善及分子生物學(xué)的發(fā)展，使大豆基因的克隆不再困難。目前在擬南芥、煙草等模式植物上，通過基因調(diào)控手段來改變組織中蔗糖含量已經(jīng)有很多研究[86]。在菜用大豆品質(zhì)改良方面，若能通過克隆其蔗糖代謝途徑關(guān)鍵基因，調(diào)控其表達(dá)模式，或許會(huì)具有更明顯的實(shí)際應(yīng)用效果[25]。近年來，基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)植物基因組的編輯簡單易行、成本低、突變效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)編輯，是生物技術(shù)的重大突破，它的應(yīng)用使得基因功能研究和作物遺傳改良等領(lǐng)域飛速發(fā)展[87]。隨著基因編輯技術(shù)的不斷進(jìn)步，大豆分子設(shè)計(jì)育種迎來高速發(fā)展的階段，我們應(yīng)當(dāng)把握機(jī)遇，充分利用豐富的種質(zhì)資源去解析遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，定位和克隆功能基因，運(yùn)用基因編輯技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾及編輯，加速驗(yàn)證其功能，深入解析菜用大豆蔗糖代謝相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)菜用大豆蔗糖含量以及食味品質(zhì)的精確改良[88]。