ADRB2、GLCCI1、FCER2基因多態(tài)性與小兒哮喘治療效果以及患兒肺功能的關(guān)系

李陽(yáng)

（江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京，210029）

支氣管哮喘是一種以反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶及呼吸困難為表現(xiàn)，兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性氣道高反應(yīng)性疾病。全國(guó)兒科哮喘協(xié)作組曾先后進(jìn)行過(guò)三次全國(guó)規(guī)模的兒童哮喘患病率調(diào)查，提示我國(guó)兒童哮喘的患病率呈顯著上升趨勢(shì)。哮喘的病因及發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及到遺傳、特應(yīng)性體質(zhì)、環(huán)境、飲食、氣道高反應(yīng)性、性別、肥胖、藥物等多個(gè)方面。哮喘不僅影響個(gè)人的生活質(zhì)量，也給家庭及社會(huì)造成了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，亦消耗著巨大的醫(yī)療衛(wèi)生資源[1]。

由于兒童哮喘的高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高危險(xiǎn)性的特點(diǎn)，作為兒童呼吸科最常見(jiàn)的疾病，一直以來(lái)都是兒童醫(yī)院呼吸領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[2]-[3]。雖然GINA 方案得到大力普及和推廣，但由于個(gè)體遺傳背景的差異，使得患兒對(duì)于β2 受體激動(dòng)劑及ICS（吸入性糖皮質(zhì)激素）的敏感度不同，治療的效果以及遠(yuǎn)期肺功能變化情況也存在較大變異，因此，本研究旨在探討哮喘患兒ADRB2、GLCCI1、FCER2 基因多態(tài)性與患兒哮喘治療效果以及肺功能變化的關(guān)系，以期為提升此類(lèi)患者的臨床治療效果提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2016年11月至2018年6月期間本院收治的哮喘患兒為研究對(duì)象，跟蹤隨訪(fǎng)其治療效果以及最新一次的肺功能檢測(cè)結(jié)果，并按照相關(guān)定義分為不同的臨床轉(zhuǎn)歸組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡0～16 歲；經(jīng)本院呼吸內(nèi)科確診為“支氣管哮喘”或“變異性哮喘”的患兒；所有患兒均為初次確診，并未接受過(guò)相關(guān)治療；患兒監(jiān)護(hù)人同意參與本研究，并簽署了知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過(guò)哮喘相關(guān)治療的患兒；合并有其他嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的患兒；患有嚴(yán)重的感染性疾病或運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，不能耐受激素治療的患兒；監(jiān)護(hù)人拒絕參與研究的。

1.2 方法治療效果的定義，所有患兒均根據(jù)其臨床狀況采用ICS 與β2 受體激動(dòng)劑聯(lián)用的治療方案，按照患兒治療后的臨床轉(zhuǎn)歸定義為治療效果好與治療效果一般，治療效果好指哮喘癥狀部分或全部控制，在臨床醫(yī)師的指導(dǎo)下減藥或停藥的患者；治療效果一般指哮喘癥狀未得到有效控制，或調(diào)整藥量后出現(xiàn)反復(fù)的患者。

肺功能檢測(cè)定義，按照患兒最近一次肺功能檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分組，肺功能無(wú)異?；驓獾拦δ芨纳频幕颊邽榉喂δ苷＝M，存在氣道改變或舒張?jiān)囼?yàn)陽(yáng)性的患者定義為肺功能異常。生物樣本的采集與測(cè)定：用熒光染色原位雜交技術(shù)對(duì)GLCCI1、ADRB2、FCER2 進(jìn)行基因分型，抽取患兒2ml 靜脈血，從血液樣本提取核酸：將待檢血液標(biāo)本顛倒混勻數(shù)次；10× 紅細(xì)胞裂解液（氯化銨）與滅菌水按1∶9 比例稀釋到工作液（1× 紅細(xì)胞裂解液）濃度；取1.5ml 離心管，加入1.2ml 紅細(xì)胞裂解液（工作液），取200μl 待檢標(biāo)本加入離心管中，上下顛倒混勻，室溫靜置5min；將離心管放入離心機(jī)中，離心5min，轉(zhuǎn)速：3000r/min；或700× g 離心完成后取出離心管，用槍頭吸去上清，保留沉淀；緊貼管壁，緩慢加入適量0.9%氯化鈉溶液（約500～1000μl），清洗管壁和白細(xì)胞表面（注意不要將白細(xì)胞吹起），棄上清。（如白細(xì)胞紅色較重可直接加入1000μl 的0.9%氯化鈉溶液，混勻，離心5min，轉(zhuǎn)速：3000r/min；或700× g，棄上清）；加入50～100μl 耀金保，混勻，室溫靜置30min。取1.5μl 最后一步的混合液加入到1 支耀金分中，充分混勻；組織蠟片直接加入耀金分中，用移液槍頭搗碎，并至液面下，將混勻后的樣本順序放入檢測(cè)儀器中，關(guān)閉儀器封蓋。對(duì)儀器進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置，運(yùn)行儀器，進(jìn)行檢測(cè)。

SNP 的選取原則依據(jù)下述原則挑選本研究所需的SNP：①確認(rèn)有效狀態(tài)（確認(rèn)該SNP 在中國(guó)群體中被有效證明）；②雜合度，要求最小等位基因頻率（minorallelefrequencies，MAF）＞0.1，一個(gè)SNP 的兩個(gè)等位基因的出現(xiàn)頻率越高，獲得雜合子越容易，從而可以確保較高的雜合性，提高統(tǒng)計(jì)功效；③既往研究中證明了該SNP 在哮喘治療中效果影響的有效性；④在多個(gè)來(lái)源的SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中有報(bào)道。

1.3 數(shù)據(jù)收集與分析本研究中研究對(duì)象的一般信息以及目的基因的檢測(cè)信息收集完成后由兩位數(shù)據(jù)錄入人員使用Epidata3.0 進(jìn)行雙錄入建立數(shù)據(jù)庫(kù)，在分析之前使用SHEsis 軟件對(duì)各S NP 進(jìn)行Hardy-Weinbergequilibrium（HWE）檢驗(yàn)，使用SAS9.4 構(gòu)建不同的遺傳模型，并檢驗(yàn)在各模型下各SNP 基因多態(tài)性在不同組間患者內(nèi)分布的差異,使用logistic 回歸模型校正年齡、性別、病程等因素的影響，本研究的檢驗(yàn)水準(zhǔn)統(tǒng)一設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征情況83 例研究對(duì)象中，男52 例（62.65%）；所有研究對(duì)象中，年齡3～16 歲，平均年齡（10.64± 2.89）歲。其中被診斷為支氣管哮喘者10 人，診斷為咳嗽變異性哮喘者73 人；病程＜2年的有19 例（22.89%），病程在2～5年的有51 例（61.44%），病程＞5年的有13 例（15.66%），見(jiàn)表1。

表1 83 例研究對(duì)象的一般特征

2.2 目標(biāo)SNP 信息以國(guó)家基因數(shù)據(jù)庫(kù)CNGB 為數(shù)據(jù)源，依據(jù)SNP的挑選原則挑選目標(biāo)SNP，最終納入3 個(gè)目標(biāo)SNP 為研究對(duì)象（ADRB2 基因的rs1042713 位點(diǎn)，GLCCI1 的rs37973 位點(diǎn)，F(xiàn)CER2的rs28364072 位點(diǎn)），三個(gè)位點(diǎn)的基因信息經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1042713 位點(diǎn)的應(yīng)答率為95.8%，rs37973、rs28364072 兩位點(diǎn)的應(yīng)答率均為100%，各SNP 的信息，見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)SNP 信息

2.3 藥物受體基因多態(tài)性與患兒治療效果的關(guān)系按照患兒的治療轉(zhuǎn)歸分組后，比較不同治療結(jié)局間各SNP 基因型的分布差異，結(jié)果顯示，對(duì)于ADRB2 基因型的rs1042713 位點(diǎn)，在各遺傳模型下基因型的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)于GLCCI1 基因的rs37973 位點(diǎn)，在加性模型以及顯性模型下，基因型的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,顯性模型下的結(jié)果顯示，GG 基因型的患兒發(fā)生治療結(jié)果不良的風(fēng)險(xiǎn)是GA 以及AA 基因型患兒的18.20 倍（95%CI：4.92～67.26）；對(duì)于FCER2 基因的rs28364072 位點(diǎn)，加性模型與隱性模型下差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 各SNP 與哮喘患兒治療效果的關(guān)系

2.4 藥物應(yīng)答基因與患者肺功能的關(guān)系在不同遺傳模型下對(duì)各基因目標(biāo)SNP 基因型在肺功能正常與異常患者間分布差異的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)于ADRB2，在隱性模型下，目標(biāo)SNP 基因型在不同肺功能檢測(cè)結(jié)果患者間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GG 基因型的患者發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)僅為GA 與AA 基因型的0.32倍（95%CI：0.12～0.87），對(duì)于GLCCI1，目標(biāo)SNP 各基因型在不同遺傳模型下與不同肺功能檢測(cè)結(jié)果患者間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于FCER2，在加性模型、顯性模型下目標(biāo)SNP 的各基因型在不同肺功能檢測(cè)結(jié)果的患者間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表4 各基因目標(biāo)SNP 基因型與患者肺功能變化的關(guān)系

3 討論

本研究的目的旨在從遺傳機(jī)制以及分子層面探討影響小兒哮喘治療效果的因素，以期加深對(duì)于此類(lèi)疾病治療分子機(jī)制的理解，從而提升臨床治療效果。結(jié)果顯示，ADRB2、GLCCI1、FCER2 三個(gè)基因的多態(tài)性均與小兒哮喘治療效果或患兒臨床肺功能轉(zhuǎn)歸相關(guān)[4]-[5]。

既往研究證明[6]-[7]，ADRB2 基因的表達(dá)及功能可影響以β 2-腎上腺素受體為作用靶點(diǎn)的支氣管擴(kuò)張劑（包括β受體激動(dòng)劑、茶堿類(lèi)、抗膽堿類(lèi)藥物等）的藥物效應(yīng)，因此，其多態(tài)性可能作為影響因素對(duì)使用β2 腎上腺素受體激動(dòng)劑作為哮喘治療手段的患兒長(zhǎng)期預(yù)后造成影響，本研究結(jié)果顯示，對(duì)于ADRB2基因rs1042713 位點(diǎn)基因型為GG 的患兒，GA 以及AA 基因型的患兒發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)更高，與Lipworth，Zuurhout 等在國(guó)外成年哮喘患者中所得的研究結(jié)論相一致。此外，本課題組在同樣遺傳背景的患兒中進(jìn)行的前期研究中也發(fā)現(xiàn)在難治性哮喘患兒中，ADRB2AA 型者，停用β2 受體激動(dòng)劑，給予噻托溴銨后，患兒哮喘得到明顯控制，提示此基因作為小兒哮喘個(gè)體化治療依據(jù)的意義。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因1（glucocorticoid-inducedtranscript1gene，GLCCI1）位于人類(lèi)染色體組的7 號(hào)染色體上，其編碼一種功能尚不清楚但由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。既往研究的結(jié)果顯示，此種蛋白質(zhì)可能是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志物，因此其表達(dá)水平可以影響到糖皮質(zhì)激素生理作用的大小，兩項(xiàng)關(guān)于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，rs37973 位點(diǎn)G 等位基因與治療反應(yīng)較差有關(guān)。與本研究的結(jié)果相互印證[8]-[9]。此外邱玉明等在中國(guó)漢族人群中的研究結(jié)果也證實(shí)了GLCCI1 基因多態(tài)性對(duì)于糖皮質(zhì)激素吸入治療哮喘療效的影響。

FCER2 位于人類(lèi)染色體組第19 號(hào)染色體上，是一種蛋白編碼基因，其在調(diào)控IgE 生成中起著重要作用，是過(guò)敏性哮喘的重要介導(dǎo)因子。既往研究的結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)CER2 基因rs28364072位點(diǎn)的多態(tài)性為與哮喘的嚴(yán)重程度、住院風(fēng)險(xiǎn)，住院時(shí)間有關(guān)。推測(cè)可能是由于在使用糖皮質(zhì)激素吸入療法治療哮喘時(shí)，F(xiàn)CER2基因突變的患者可通過(guò)提高IgE 表達(dá)水平加重氣道功能的異常，從而加劇不良反應(yīng)的程度[10]。本研究結(jié)果顯示，相較于FCER2基因rs28364072 位點(diǎn)為GA 或AA 的患者，GG 基因型的患者發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)更高，與Tantisira 等在國(guó)外哮喘患兒中進(jìn)行的研究結(jié)果一致，此外，Rogers 等的研究結(jié)果顯示，同一位點(diǎn)GG 基因型的患者，接受糖皮質(zhì)激素吸入治療時(shí)肺功能（FEV1%）惡化的相對(duì)危險(xiǎn)度（OR）為2.1，與本研究的結(jié)果相互印證。

既往關(guān)于哮喘的研究提示，此疾病為受基因與環(huán)境共同影響的多基因遺傳病，多種基因通過(guò)不同通路共同作用與哮喘的發(fā)病以及后續(xù)對(duì)治療的反應(yīng)，因此患者的治療效果變異較大，近些年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)提示基因診斷在哮喘治療中的價(jià)值，幾位專(zhuān)家[11]-[12]應(yīng)用ADRB2、GLCCI1、FCER2 三個(gè)基因多態(tài)性檢測(cè)有效提升了兩例小兒難治性哮喘中的治療效果，并且成功的降底了并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，GLCCI1 基因的rs1042713位點(diǎn)、FCER2 基因多態(tài)性與哮喘患兒藥物治療效果相關(guān)，ADRB2、FCER2 基因多態(tài)性與哮喘患兒肺功能轉(zhuǎn)歸有關(guān)。提示了此三個(gè)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果在指導(dǎo)哮喘臨床用藥中的意義。