韓長(zhǎng)志,祝友朋,王韻晴
(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,云南 昆明 650224;2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224)
核桃作為世界著名的“四大干果”(核桃、扁桃仁、腰果、榛子)之一,是重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。近些年,云南省所轄129個(gè)縣(市、區(qū))中90%以上地區(qū)大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè),2017年種植面積(近300 萬hm2)、產(chǎn)量(115 萬噸)、產(chǎn)值(315億元)均居全國(guó)之首[2]。然而,核桃炭疽病、細(xì)菌性黑斑病等病害嚴(yán)重影響著云南省核桃產(chǎn)業(yè)的健康、有序和快速發(fā)展[3-4]。
核桃細(xì)菌性黑斑病,又名核桃黑斑病、核桃黑、黑腐病,作為一種細(xì)菌性病害,是世界性的核桃病害,核桃植株受害率高達(dá)90%以上[5-6]。主要危害核桃果實(shí)、葉片、嫩梢、芽、雄花序及枝條等[7],幼果受害后果皮表面形成褐色軟斑,后變黑腐爛,造成落果[8];成熟果實(shí)受害后會(huì)造成果皮形成黑色病斑[9];葉片受害后出現(xiàn)小褐斑,后病斑脫落;嫩梢受害后病斑褐色,凹陷,嚴(yán)重時(shí)病斑以上部分嫩梢枯死,嚴(yán)重影響著核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。核桃種植地因所處環(huán)境不同和核桃品種不同,核桃細(xì)菌性黑斑病的危害程度也存在差異,如甘肅天水市發(fā)生該病的病株率為9%~45%,果實(shí)被害率14%~60%,造成減產(chǎn)15%~40%[10],河南濮陽(yáng)縣發(fā)生該病的病株率為60%~100%,果實(shí)被害率30%~70%,核仁減重40%~50%[11],濟(jì)南市南部山區(qū)2017年發(fā)生該病的病株率約42%,減產(chǎn)約40%[12]等。
目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的研究,主要集中在病害癥狀、病原、侵染循環(huán)、檢測(cè)技術(shù)、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)[13]、發(fā)病規(guī)律及防治[14-16]等方面。為了更好地解析核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病機(jī)理以及研發(fā)防治該病害的作用靶標(biāo)藥劑,本研究基于文獻(xiàn)計(jì)量法,通過對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)該病的文章開展深入剖析,針對(duì)該病害研究的薄弱點(diǎn),從宏觀視角和微觀視角對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的未來研究提出展望,以期為該病害的進(jìn)一步研究及有效控制提供參考。
為明確近年來學(xué)術(shù)界對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的研究現(xiàn)狀,選用國(guó)內(nèi)CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)及國(guó)外Sciencedirect 數(shù)據(jù)庫(kù),分別采用“主題”、“篇名”進(jìn)行“核桃細(xì)菌性黑斑病”及“Walnut Blight”檢索,并對(duì)2009—2019年的文獻(xiàn)進(jìn)行整理。結(jié)果表明,近10年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的研究報(bào)道均呈上升的趨勢(shì),但此病菌引起的病害在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量較少(圖1)。通過對(duì)上述文獻(xiàn)的梳理,發(fā)現(xiàn)前人的研究主要集中在該病害的發(fā)生與防治,涉及病害的防治有131 篇、發(fā)生有53 篇、防治方法25 篇、發(fā)病規(guī)律19 篇、病原有18 篇、發(fā)生原因有10 篇、藥劑防治試驗(yàn)10 篇、危害癥狀7 篇、不同品種抗性3 篇等。關(guān)于該菌的研究尚缺乏諸如分泌蛋白、致病因子等分子生物學(xué)方面的研究以及病菌檢測(cè)、致病性測(cè)定、侵染機(jī)制等常規(guī)性的研究報(bào)道。
圖1 國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的文獻(xiàn)計(jì)量分析Fig.1 Bibliometric analysis of the bacterial black spot disease of walnut by domestic and foreign scholars
目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于引起核桃細(xì)菌性黑斑病的病原報(bào)道主要涉及樹生黃單胞菌胡桃變種(Xanthomonas arboricolapv.juglandis)[10,17-19]、核桃黃極毛桿菌(Xanthomonas campestrispv.juglandis)[20-21]、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)以及上述細(xì)菌的復(fù)合報(bào)道[22],韓國(guó)地區(qū)為變黃假單胞菌(Pseudomonas flavescens)[23]。此外,畢節(jié)地區(qū)、甘肅天水市、云南香格里拉的病原報(bào)道為核桃黃極毛桿菌[Xanthomonas juglandis(Pierce)Dowson][24-26]。但X.arboricola、X.campestris和X.juglandis(Pierce)Dowson 三者的關(guān)系尚不明確,前人研究認(rèn)為核桃細(xì)菌性黑斑病的病原為核桃黃極毛桿菌,僅是命名不同,最開始命名為X.campestrispv.juglandis(Pierce )Dye,后來被命名為X.arboricolapv.juglandis(Pierce)Vauterin,我國(guó)一開始將核桃細(xì)菌性黑斑病的病原命名為X.juglandis(Pierce)Dowson,后改為X.campestris,現(xiàn)在多命名為X.arboricola[13]。陳善義團(tuán)隊(duì)對(duì)北京地區(qū)核桃細(xì)菌性黑斑病的病原進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)序,然后進(jìn)行BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)與X.campestris及X.arboricola的一些致病變種的相似性為99%[27]。X.campestris和X.arboricola是否為同一種菌的不同致病變種有待進(jìn)一步明確。
關(guān)于核桃細(xì)菌黑斑病的報(bào)道主要集中在四川、山東、甘肅、云南等核桃主要種植地區(qū),盡管一些地區(qū)關(guān)于該病害的病原報(bào)道相同,但各個(gè)地區(qū)病原形態(tài)大小存在一定的差異性。在云南,X.arboricola的形態(tài)大小為0.5~1.2 μm×1.0~2.4 μm[22],該病菌未見其他地區(qū)報(bào)道;在甘肅隴南市,X.campestris的形態(tài)大小為1.3~3.0 μm×0.3~0.5 μm[28],在臨夏州臨夏縣,形態(tài)大小為1.25~3.1 μm×0.3~0.4 μm[29],在山東,形態(tài)大小為0.3~1.8 μm×0.3~0.8 μm[30],該病菌未見其他地區(qū)報(bào)道。在云南,P.agglomerans的形態(tài)大小為0.5~2.0 μm×0.6~3.0 μm[22],在隴南,形態(tài)大小為1.0~3.0 μm×0.5~1.0 μm[31],在山東,形態(tài)大小為0.9~3.0 μm×0.6~1.2 μm[30](表1)。
表1 核桃細(xì)菌性黑斑病病原的種類和地區(qū)分布Table 1 Species and regional distribution of walnut bacterial black spot
前人對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的鑒定,主要根據(jù)病菌的菌落特征和生理生化特征,以及致病性試驗(yàn)驗(yàn)證等。2011年陳善義團(tuán)隊(duì)對(duì)北京地區(qū)的核桃細(xì)菌性黑斑病菌進(jìn)行16S rDNA 序列的測(cè)定,鑒定病菌為X.campestris,從分子角度進(jìn)行核桃細(xì)菌性黑斑病菌的鑒定和分類提供依據(jù)[27]。2020年Hyun-Sun Kim等人根據(jù)菌落特征、16S rRNA 序列測(cè)定并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、致病性驗(yàn)證,鑒定核桃細(xì)菌性黑斑病菌為Pseudomonas flavescens[23]。目前,對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的鑒定依據(jù)主要為菌落特征、生理生化特征、致病性驗(yàn)證和分子特征等(表2)。
表2 核桃細(xì)菌性黑斑病的病原報(bào)道及鑒定方法Table 2 Reported pathogen and identification method of walnut bacterial black spot
核桃細(xì)菌性黑斑病的病原菌一般在核桃休眠芽、雄花芽?jī)?nèi)越冬,少部分在僵果、病果、病枝、潰瘍斑及昆蟲體上越冬;翌年春天,伴隨著核桃芽和雄花序的生長(zhǎng),病原菌不斷繁殖,進(jìn)而侵染其周圍的健康組織,形成初侵染[35]。同時(shí),該菌可以通過核桃組織中的氣孔、皮孔、柱頭等自然孔口,或是通過昆蟲、日灼、冰雹等造成的傷口進(jìn)一步侵染核桃葉片、枝條以及果實(shí),形成再侵染;其傳播一般借助于雨水、灌溉水、介體昆蟲、農(nóng)事操作、帶菌的苗木及接穗等(圖2)。在河北太行山區(qū)一般5月中下旬開始發(fā)生,6—7月為發(fā)病盛期[36],北京地區(qū)發(fā)病盛期在7月下旬至8月中旬雨季,若夏季多雨發(fā)病加重,夏季干旱少雨年份發(fā)病輕[27]。就成團(tuán)泛菌而言,其主要通過傷口侵入植株葉片組織使得核桃發(fā)病,而植株莖干的損傷對(duì)植株發(fā)病短期內(nèi)無明顯影響。
圖2 核桃細(xì)菌性黑斑病的病害循環(huán)Fig.2 Disease cycle of walnut bacterial black spot
核桃細(xì)菌性黑斑病的危害程度受環(huán)境濕度影響較大,在濕潤(rùn)多雨的季節(jié)、年份發(fā)病嚴(yán)重[37]。展葉期、花期前后、幼果期等核桃生長(zhǎng)期若處于多雨潮濕的環(huán)境中,將有利于病原菌的侵染和存活,因此在核桃細(xì)菌性黑斑病的防治中展葉期和花期等初侵染時(shí)期是防治的關(guān)鍵時(shí)期。病菌一般5月中下旬開始侵染果實(shí)、枝條、葉片和幼嫩組織,7月下旬到8月中旬為發(fā)病盛期。同時(shí)前人調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同品種、樹齡、樹勢(shì)發(fā)病輕重也不相同,引入核桃發(fā)病情況重于當(dāng)?shù)睾颂襕38],種植在背陰處、濕度較大的地方的核桃發(fā)病較重,樹勢(shì)衰弱的核桃發(fā)病較重,蟲害嚴(yán)重的片區(qū),如核桃舉肢蛾(Atrijuglans hetaohei)攜帶病原菌進(jìn)行傳播,有利于病害的流行,云斑天牛(Batocera horsfieldi)、核桃小吉?。ˋgrilus lewisiellus)等枝干害蟲造成的傷口,有利于病菌的侵入,易造成核桃發(fā)病較重[39]。此外還與核桃樹體郁閉通風(fēng)透氣度、立地條件、栽培管理措施及防治不當(dāng)有很大的關(guān)系[37]。
核桃細(xì)菌性黑斑病的防治主要有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治兩種,農(nóng)業(yè)防治應(yīng)以種植抗病品種為主[40],另外在核桃的種植過程中可以和豆科植物套種[41],改善田間小氣候;合理的種植密度,保證通風(fēng)透光度;加強(qiáng)水肥管理,增強(qiáng)核桃樹勢(shì);清除病枝、病果等,減少病源;采收時(shí)減少棍棒敲擊,以免造成大傷口,減少病原菌侵染機(jī)會(huì)等[42]?;瘜W(xué)防治主要有預(yù)防和防治兩方面,其中預(yù)防主要采用波爾多液等[43],防治主要采用銅制劑、代森類藥劑和抗生素類藥劑在核桃生長(zhǎng)的不同時(shí)期進(jìn)行防治[16,44-46],其中趙寶軍等人發(fā)現(xiàn)施用春雷菌素 + 代森錳鋅的混合藥劑,防治效果為90.94%,其次為代森鋅,防治效果為80.49%,但農(nóng)用硫酸鏈霉素防治效果不佳[16];郭安柱等人發(fā)現(xiàn)中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷菌素對(duì)成團(tuán)泛菌的防治效果都在70%以上[44];劉寶生等人發(fā)現(xiàn)施用農(nóng)用硫酸鏈霉素 + 乙蒜素的混合藥劑,防治效果為100%,中生菌素、四霉素和農(nóng)用硫酸鏈霉素的防治效果都在95%以上[45];孫陽(yáng)發(fā)現(xiàn)農(nóng)用硫酸鏈霉素、可殺得3000、代森錳鋅、春雷王銅和吡蟲啉混合施用,防治效果可以顯著提高[46];陳邦清等人發(fā)現(xiàn)可以滅殺真菌和細(xì)菌的氟硅唑和農(nóng)用硫酸鏈霉素的防治效果高于多菌靈和可殺得3000,與毒死蜱混合施用的防治效果高于單一施用[47]。因此,在對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病進(jìn)行防治時(shí),化學(xué)藥劑應(yīng)施用銅制劑 + 代森類、抗生素類 + 代森類等類型的混合藥劑,還要進(jìn)行病蟲害的綜合防治,以達(dá)到最大的防治效果[47-48]。
近些年,學(xué)術(shù)界對(duì)植物病原真菌、卵菌等真核生物分泌蛋白的預(yù)測(cè)較多,而對(duì)屬于植物病原細(xì)菌特別經(jīng)濟(jì)林木上的植物病原細(xì)菌研究較少[49]。本研究小組明確核桃細(xì)菌性黑斑病菌Xanthomonas arboricolapv.Juglandis的7個(gè)菌株[50-51]中分泌蛋白數(shù)量?jī)H占全蛋白數(shù)量的1.81%。不僅與前人所報(bào)道的有關(guān)植物病原真菌、細(xì)菌、卵菌分泌蛋白所占比例存在明顯差異,也與放線菌中分泌蛋白所占比例存在明顯差異[52]。分泌蛋白可以作為效應(yīng)物參與病原菌的侵染過程,其中碳水化合物活性酶類(CAZymes)是分泌蛋白的重要類型,在碳水化合物的降解過程中發(fā)揮著重要作用,參與植物細(xì)胞壁的降解,在病原菌的侵染過程中發(fā)揮著重要作用。今后深入解析核桃細(xì)菌性黑斑病菌中分泌蛋白的功能及其致病機(jī)理,將有助于更好地開發(fā)針對(duì)其致病基因或蛋白的作用靶標(biāo)的藥劑,更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的有效防控,有助于進(jìn)一步促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)健康、有序、快速發(fā)展。
近些年,引起核桃細(xì)菌性黑斑病菌的報(bào)道主要涉及X.arboricola、X.campestris,筆者在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行病菌拉丁文搜索,獲到X.arboricola和X.campestris相關(guān)報(bào)道的多個(gè)菌株的全基因組序列,由此推斷上述病原菌對(duì)于植物的危害在世界各地表現(xiàn)較為突出。因此,學(xué)術(shù)上急需明確有關(guān)植物病原菌的致病機(jī)制,從而更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)于該病害的防治。同時(shí),國(guó)外學(xué)者利用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析方法(Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis,MLVA)進(jìn)一步開展了核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病變種間的遺傳關(guān)系研究[53],然而,對(duì)于X.arboricola和X.campestris之間的遺傳關(guān)系尚不清楚。此外,就不同區(qū)域上述植物病原菌之間的遺傳關(guān)系也不清楚,以及植物病原菌與寄主植物的抗病機(jī)制以及互作機(jī)制也不清楚,均有待于今后學(xué)術(shù)界對(duì)其開展更加深入的研究。
核桃細(xì)菌性黑斑病目前國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的報(bào)道。2000年,美國(guó)針對(duì)細(xì)菌性黑斑病的發(fā)生發(fā)展,開展了預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的構(gòu)建工作,商業(yè)上稱為Xanthocast TM,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于美國(guó)核桃生產(chǎn)和科學(xué)研究中。因此,開展核桃細(xì)菌性黑斑病早期快速檢測(cè)預(yù)警技術(shù)是病害科學(xué)防治的重點(diǎn),目前核桃細(xì)菌性黑斑病的診斷判定一般是依據(jù)田間癥狀和病原菌的培養(yǎng)特征。通過培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行鏡檢[29],輔以分子檢測(cè)技術(shù),提高核桃細(xì)菌性黑斑病診斷的準(zhǔn)確性及效率,但耗時(shí)較長(zhǎng)。國(guó)外采用一種微流控免疫傳感器,將檢測(cè)樣本中氨基苯基磷酸酯通過堿性磷酸酶轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚,利用酶產(chǎn)物產(chǎn)生的電流大小與病原菌成正比來實(shí)現(xiàn)對(duì)于病原菌的檢測(cè)[54]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種普遍的植物病原菌檢測(cè)方法,其實(shí)用性、可靠性較高,該技術(shù)可用于未來核桃細(xì)菌性黑斑菌的檢測(cè)工作中。在病害防治方面,應(yīng)針對(duì)核桃產(chǎn)區(qū)環(huán)境條件、品種特性、栽培管理方式等存在的差異,制定適宜的科學(xué)防治方法,在藥劑選用上,應(yīng)逐步減少化學(xué)藥劑的大量使用,采用生物防治、無公害技術(shù)等綠色防控方法。