RRLC-MS/MS法測定酒類產(chǎn)品中11種非法添加利尿組分

王超,劉小芳,徐慧,楊釗*

1(青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 青島,266071) 2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島,266071)

酒類產(chǎn)品品種繁多,口味獨(dú)特,在社交娛樂及養(yǎng)生保健方面都占有重要的位置。酒類產(chǎn)品中添加利尿劑能夠促進(jìn)機(jī)體快速排尿,去除飲酒而帶入體內(nèi)的大量水分。利尿劑通過選擇性阻斷鈉-鉀-氯等共同轉(zhuǎn)運(yùn)體來促進(jìn)尿液中鈉和水的排泄[1-2]或保鉀以達(dá)到排鈉排尿的作用,部分利尿劑聯(lián)合使用可以起到更好的利尿效果[3]。但人體長期攝入利尿劑易引起低血鈉、低血鉀、低血鎂等電解質(zhì)紊亂及高尿酸血癥等代謝紊亂癥狀,同時(shí)存在痙攣、尿頻等其他不良反應(yīng)[1-4],嚴(yán)重影響身體健康,必須嚴(yán)格控制機(jī)體的攝入來源。

目前,保健食品及中成藥中非法添加化學(xué)藥物的檢測主要是先通過液相色譜法進(jìn)行色譜分離初篩,采用保留時(shí)間和紫外吸收光譜初步定性,初篩為陽性的樣品經(jīng)液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法或液相色譜-離子阱/軌道阱進(jìn)行確證[5-7]。液相色譜法的分離能力有限,復(fù)雜基質(zhì)的樣品中干擾峰較多,增加了分離的難度和色譜分析的時(shí)間；液相色譜質(zhì)譜法靈敏度較高,且各化合物之間在保留時(shí)間上不必完全分離,其中液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法和液相色譜-離子阱/軌道阱屬于高分辨檢測儀器,在未知化合物的碎片解析及已知化合物的定性確證方面應(yīng)用較多,定量能力有待改進(jìn)[8-11]；液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法抗干擾能力較強(qiáng),可針對每個(gè)化合物設(shè)定專有通道進(jìn)行檢測,且精密度較好,適合多種已知的化合物同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析檢測[12]。

本文涉及的11種化合物中個(gè)別化合物因不同的功效在不同的基質(zhì)中被檢出的情況已有報(bào)道,所涉及的基質(zhì)包括尿液、保健食品和化妝品[13-16],所涉及的檢測技術(shù)包括液相色譜法初篩后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法[13]或液相色譜-離子阱/軌道阱進(jìn)行定性確證[14-15]、通過液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法直接進(jìn)行定性和定量分析[16],其中氣相色譜-質(zhì)譜法確證前需要進(jìn)行衍生化處理,衍生過程繁瑣且衍生物不穩(wěn)定[13]。酒類產(chǎn)品中11種利尿化合物的定性定量檢測未見報(bào)道。綜上,本文建立酒類產(chǎn)品中非法添加利尿組分的快速分離液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry,RRLC-MS/MS)方法,上機(jī)后可在13 min內(nèi)同時(shí)完成11種利尿化合物的定性及定量檢測,方法篩查效率高、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng),為監(jiān)督酒類產(chǎn)品質(zhì)量和打擊酒類產(chǎn)品中非法添加利尿組分行為提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 prime-6470A液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,美國Agilent公司；Sartourious BT125D十萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司；AS 20500B超聲波清洗器,天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

1.2 材料與試劑

對照品：氫氯噻嗪(批號 100309—201103，含量99.8%)、茶堿(批號100121—201805，含量99.9%)、米諾地爾(批號100238—201702，含量99.7%)、氨苯蝶啶(批號100429—201602，含量99.8%)、呋塞米(批號100544—201503，含量99.3%)、吲達(dá)帕胺(批號100257—201605，含量97.7%)、螺內(nèi)酯(批號100193—201704，含量99.9%)、非洛地平(批號 100717—201403，含量99.6%)，中國食品藥品檢定研究院；芐氟噻嗪(批號100007—200703，含量100%)、環(huán)戊噻嗪(批號100188—199701，含量100%)，中檢所；坎利酮(批號MS190929—20，含量98.06%)，Stanford Chemicals。

樣品：從山東省青島市的超市和便利店采購10批酒類產(chǎn)品,涉及啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型,其中啤酒3批,葡萄酒3批,果酒2批,黃酒2批。

甲醇、乙腈,色譜純，德國默克；甲酸(色譜純),賽默飛世爾科技有限公司；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取11種化合物對照品10 mg至10 mL量瓶中,加入甲醇4 mL,振搖溶解,螺內(nèi)酯、茶堿需超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)5 min,并振搖溶解,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述對照品溶液各0.1 mL至10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述對照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品的上機(jī)參數(shù)優(yōu)化用溶液。

精密稱取11種化合物對照品各50 mg至同1個(gè)50 mL量瓶中,加入甲醇25 mL,超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)5 min,并振搖使溶解,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液；精密量取上述混合對照品溶液0.1 mL至50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得2 μg/mL的混合對照品溶液；精密量取上述混合對照品溶液50、100、300、500、1 000 μL至10 mL量瓶中,用甲醇-水(體積比9∶1)稀釋至刻度,搖勻,作為線性方程用系列對照品溶液,質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.06、0.1、0.2 μg/mL。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

精密稱取樣品約0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入甲醇5 mL,超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)提取5 min,冷卻至室溫,用甲醇定容至刻度,搖勻；精密量取上述溶液0.1 mL至100 mL量瓶中,用甲醇-水(體積比9∶1)稀釋至刻度,搖勻,過0.22 μm的微孔濾膜即得樣品溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 Rapid Resolution HD色譜柱(3.0 mm×50 mm,1.8 μm)；流動相：以0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸溶液為流動相A,以含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的甲醇為流動相B,梯度洗脫(0～3 min：95%A→60%A；3～8 min：60%A →20%A；8～10.5 min：20%A→ 20%A；10.5～10.7 min：20%A→ 95%A；10.7～16.0 min：95%A)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源(AJS ESI),各化合物分別在正離子或負(fù)離子模式下通過動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進(jìn)行測定；干燥氣溫度為300 ℃；干燥氣流速為9 L/min；霧化氣壓力為37 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為11 L/min；正離子模式時(shí),毛細(xì)管電壓為3 600 V,噴嘴電壓為400 V；負(fù)離子模式時(shí),毛細(xì)管電壓為 3 000 V,噴嘴電壓為400 V；質(zhì)譜的碰撞氣為高純氮?dú)狻?1種化合物22個(gè)通道優(yōu)化后的動態(tài)MRM方法中母離子、定性子離子、定量子離子、碎裂電壓及碰撞能量等參數(shù)見表1,11種化合物的提取離子色譜圖見圖1。

1-氫氯噻嗪;2-茶堿;3-米諾地爾;4-氨苯蝶啶;5-呋塞米;6-吲達(dá)帕胺;7-芐氟噻嗪;8-環(huán)戊噻嗪;9-螺內(nèi)酯;10-坎利酮;11-非洛地平圖1 11種化合物的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 11 compounds

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)和方法專屬性的考察

實(shí)驗(yàn)選取啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型的陰性樣品基質(zhì)進(jìn)行等體積混合,得到混合基質(zhì)溶液。用甲醇-水(體積比9∶1)配制50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液,待測；精密稱取混合基質(zhì)溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合對照品溶液5 mL,按照1.3.1.2的方法制備得到50 ng/mL的混合基質(zhì)加標(biāo)溶液,待測。將50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液和50 ng/mL的混合基質(zhì)加標(biāo)溶液上機(jī)測定,通過計(jì)算2種溶液中化合物的響應(yīng)值百分比來考察基質(zhì)效應(yīng)的影響[17-19]。

表1 11種化合物的母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量Table 1 Precursor ions,product ions,fragmentor and collision energy of 11 compounds

實(shí)驗(yàn)選取啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型的陰性樣品,分別按照1.3.1.2的制備方法得到空白基質(zhì)溶液,按1.3.2和1.3.3的方法進(jìn)樣測定,考察方法的專屬性。

1.3.5 方法的線性、檢出限、定量限和回收率

將1.3.1.1中制備的線性方程用系列對照品溶液按照1.3.2和1.3.3項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,以化合物的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)繪制線性方程。以3倍信噪比計(jì)算各化合物的檢出限,以10倍信噪比計(jì)算各化合物的定量限。精密稱取1.3.4中混合基質(zhì)溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合對照品溶液10 mL,按照1.3.1.2的方法制備得到100 ng/mL的混合基質(zhì)加標(biāo)溶液,平行制備6份,按1.3.2和1.3.3的方法進(jìn)樣測定,計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用美國Agilent公司的QQQ Quantitative Analysis程序軟件和Microsoft Office Excel 2007軟件,繪圖采用Microsoft Office Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選用1.3.1.1的對照品上機(jī)參數(shù)優(yōu)化用溶液上機(jī),對11種化合物分別進(jìn)行ESI+和ESI-條件下的一級全掃,根據(jù)一級全掃結(jié)果確認(rèn)化合物的電離模式,并選定合適的母離子,通過設(shè)定不同的碎裂電壓,以母離子的響應(yīng)強(qiáng)度為觀察目標(biāo)選定最優(yōu)碎裂電壓,在此碎裂電壓下進(jìn)行目標(biāo)母離子的二級全掃,選擇強(qiáng)度最大的2個(gè)碎片離子分別進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化,在最優(yōu)碎裂電壓和最優(yōu)碰撞能量下響應(yīng)強(qiáng)度最大的定為定量子離子,響應(yīng)強(qiáng)度次之的定為定性子離子,綜合11種化合物的上述參數(shù)建立該11種化合物的MRM方法。為充分提高每種化合物的靈敏度,實(shí)驗(yàn)在MRM方法參數(shù)的基礎(chǔ)上根據(jù)保留時(shí)間建立了11種化合物22個(gè)通道的動態(tài)MRM方法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取了0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈2種流動相體系對11種化合物的色譜行為和響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行考察。流動相為0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈條件下,砍利酮、螺內(nèi)酯響應(yīng)較弱,氨苯喋啶響應(yīng)較強(qiáng)；流動相為0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇條件下,氨苯喋啶響應(yīng)略有降低,但其他化合物響應(yīng)與前一種流動相體系相比無較大影響或有增強(qiáng)。綜合考慮化合物的出峰時(shí)間、分離情況和響應(yīng)強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸溶液作為流動相A,含0.1%甲酸的甲醇作為流動相B進(jìn)行測定?；谏鲜錾V條件,結(jié)合優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù),建立11種化合物22個(gè)通道的快速液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用方法。

2.3 溶劑的優(yōu)化

以0.1%的甲酸溶液為流動相A,以含0.1%甲酸的甲醇為流動相B,考察對照品和樣品上機(jī)前最后一步的稀釋溶劑,實(shí)驗(yàn)選定甲醇-水(體積比1∶9)、甲醇-水(體積比5∶5)、甲醇-水(體積比9∶1)與甲醇共4種溶劑進(jìn)行溶解并測定,結(jié)果見圖2,發(fā)現(xiàn)氨苯喋啶、氫氯噻嗪、非洛地平的響應(yīng)隨著甲醇濃度的升高而增強(qiáng),純甲醇作為溶劑時(shí)響應(yīng)最強(qiáng),略高于甲醇-水(體積比9∶1)作為溶劑時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度；其余化合物均在甲醇-水(體積比9∶1)作為溶劑時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)。

1-氫氯噻嗪；2-茶堿；3-米諾地爾；4-氨苯蝶啶；5-呋塞米；6-吲達(dá)帕胺；7-芐氟噻嗪；8-環(huán)戊噻嗪；9-螺內(nèi)酯；10-坎利酮；11-非洛地平圖2 溶劑對11種化合物的影響Fig.2 Effect of solvent to 11 compounds

為充分提高化合物的靈敏度,綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選定甲醇-水(體積比9∶1)作為對照品和供試品上機(jī)前最后一步的稀釋溶劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和方法專屬性

將1.3.4中50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液和50 ng/mL的混合基質(zhì)加標(biāo)溶液上機(jī)測定,計(jì)算2種溶液中化合物的響應(yīng)值百分比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氨苯喋啶、米諾地爾等響應(yīng)值百分比大于1,呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng),環(huán)戊噻嗪、芐氟噻嗪、氫氯噻嗪響應(yīng)值百分比小于1,呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),吲噠帕胺、螺內(nèi)酯、砍立酮等基質(zhì)效應(yīng)影響不大。結(jié)果表明11種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在77.4%～112.8%,因?yàn)榉欠ㄌ砑铀幬锏奶砑觿┝恳话阈枰砑拥侥軌虬l(fā)揮藥效的劑量,通常為毫克級別,不屬于痕量檢測,所以常見的4種類型的陰性樣品基質(zhì)對該11種化合物的基質(zhì)效應(yīng)影響在可接受范圍內(nèi)[20]。

按照1.3.4考察該方法的專屬性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種類型的22個(gè)通道中均未見有干擾11種目標(biāo)化合物的色譜峰,方法的專屬性較好。

2.5 方法的線性、檢出限、定量限和回收率

按照1.3.5的方法得到的線性方程、檢出限和回收率結(jié)果見表2。11種化合物在本實(shí)驗(yàn)的線性范圍內(nèi)均具有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0；以3倍信噪比計(jì)算的11種化合物的檢出限在0.8～133.9 ng/g,定量限在2.7～446.3 ng/g,靈敏度較高；6份加標(biāo)樣品中11種化合物的平均回收率為88.3%～105.3%,平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.3%～2.2%,回收率較高。

表2 11種化合物的線性方程、檢出限和回收率Table 2 Liner equations,detection limits and recoveries of 11 compounds

2.6 樣品測定

將1.2中10批酒類市售產(chǎn)品按照1.3.1.2方法制備,按照1.3.2和1.3.3方法上機(jī)測定,通過比較供試品和對照品中11種化合物的定性離子對和定量離子對的保留時(shí)間、定性離子對與定量離子對的離子比率進(jìn)行定性,以定量離子對的峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中均未檢出11種目標(biāo)成分,這可能與該10批樣品均為大型超市購買的正規(guī)市售產(chǎn)品有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究首次建立了一種快速篩查酒類產(chǎn)品中非法添加11種利尿組分的RRLC-MS/MS方法,可在13 min內(nèi)同時(shí)完成該11種化合物的定性篩查和定量檢測,方法操作簡便、篩查效率高,具有較好的方法專屬性和較高的靈敏度,重復(fù)性好,對酒類產(chǎn)品的安全監(jiān)督及風(fēng)險(xiǎn)性篩查工作具有重要意義。